全 文 ：冬凌草甲素抑制人胃癌 SGC7901 细胞生长的 G2 / M期阻滞机制研究
季宇彬1, 2 ,洪 宝1, 2 , 高世勇1, 2
收稿日期: 20100627
基金项目:黑龙江省普通高等学校新世纪优秀人才培养计划; 哈尔滨商业大学校内研究生创新基金项目 ( YJSCX2009113H SD)
作者简介:季宇彬( 1956 ) ,男,博士,教授,博士生导师,多年来一直致力于中药药理、肿瘤药理及分子药理学研究。
( 1 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心 ,黑龙江 哈尔滨 150072; 2 黑龙江省肿瘤预防
与抗肿瘤药物研究重点实验室, 黑龙江 哈尔滨 150076)
摘 要:目的 研究冬凌草甲素抑制人胃癌 SGC7901 细胞生长作用及 G2 / M 期阻滞机制。方法 MTT 法检测
冬凌草甲素对 SGC7901 细胞生长的抑制作用;流式细胞术检测冬凌草甲素对 SGC7901 细胞周期的影响; West
ern blo tting 法检测冬凌草甲素对 Cdk1、Cyclin B1 两种蛋白表达的影响。结果 冬凌草甲素作用于 SGC7901 细
胞的 IC50为 15 64mo l/ L ; 冬凌草甲素对 G2 / M 期细胞的阻滞作用随着浓度的增加而增强; Cdk1 和 Cyclin B1 蛋
白的表达量随着冬凌草甲素浓度的增大显著降低。结论 冬凌草甲素通过下调 SGC7901 细胞内 Cdk1、CyclinB1
两种蛋白的表达,阻滞细胞于 G 2/ M 期而抑制 SGC7901 细胞生长。
关键词:冬凌草甲素; 人胃癌 SGC7901 细胞; Cdk1; CyclinB1; 细胞周期
中图分类号: R286 91 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2010) 12 2024 03
Inhibitory mechanism of oridonin on G2 / M phase arrest in SGC7901 cell growth
JI Yubin1, 2 , HONG Bao1, 2 , GA O Shiyong1, 2
( 1 Life Sciences and Env ironmental Sciences Resear ch Cent er of H arbin Commerce Univ ersity , H arbin 150072, China;
2. Key Resear ch Labor ator y of Cancer Prophylaxis and Anticancer Drug s of H eilong jiang Prov ince, Harbin 150076, China)
Abstract: Objective T o invest igate the ef fect of or idonin on G2 / M phase ar rest of human stomach
cancer SGC7901 cell g row th in v it ro and its molecular mechanism. Methods The inhibit ion o f oridonin on
SGC7901 cells w as detected by MT T assay. Ef fect of oridonin on the phase dist ribut ion of SGC7901 cell
cycle w as observed by f low cytometry ( FCM ) . Western blot t ing w as used to analyze the expression of
Cdk1 and CyclinB1. Results IC50 of oridonin on SGC7901 cells w as 15. 64 mo l/ L . T he effect of oridonin
on SGC7901 cel ls presented the increasing percentag es o f cells in G2 / M phase as the concentr at ion of o ri
donin increased. W ith the increase of oridonin dose, the expresstion o f Cdk1 and CyclinB1 proteins w as
remarkably decreased. Conclusion Oridonin can downregulate the expression o f Cdk1 and CyclinB1,
w hich may be the mechanism of arrest ing SGC7901 cells in G2 / M phase.
Key words: oridonin; human stomach cancer SGC7901 cells; Cdk1; CyclinB1; cell cycle
冬凌草甲素 ( o ridonin) 是一种贝壳杉烯二萜
类天然有机化合物[ 12] ,主要来源于唇形科香茶菜属
植物。有研究表明,冬凌草甲素对多种组织来源的
肿瘤细胞的增殖有抑制作用, 如对 Bel7402、NB49、
MB4等具有明显的抑制作用[ 36] , 能够影响肿瘤细
胞周期、钠泵活性和蛋白质的合成并增强其他放化
疗疗效[ 7]。但冬凌草甲素对 SGC7901 细胞周期阻
滞作用尚未见报道, 本实验以 SGC7901 细胞为研
究对象, 观察不同浓度的冬凌草甲素对 SGC7901
细胞的生长抑制及周期阻滞作用,并检测了周期相
关蛋白表达的变化, 探讨冬凌草甲素对 SGC7901
细胞的生长抑制及周期阻滞作用,并检测了周期相
关蛋白表达的变化, 探讨冬凌草甲素对 SGC7901
细胞的生长抑制及周期阻滞作用机制。
1 材料
1 1 肿瘤细胞株:人胃癌 SGC7901 细胞株, 由哈
尔滨商业大学药物研究所传代保种。
1 2 药物与主要试剂: 冬凌草甲素 (质量分数>
98%) 由中国药品生物制品检定所提供, 羟基喜树
碱 ( HCPT) 由上海龙翔生物医药开发有限公司提
供; M TT 购自美国 Molecular Probe 公司; RPM I
1640 培养基, 购自美国 Gibco 公司; 二甲基亚砜
( DMSO)、胰蛋白酶、溴化丙啶 ( PI ) , 购自美国
Sigma 公司。兔抗 Cyclin B1 一抗、兔抗 Cdk1/
Cdc2 一抗、碱磷酶标记山羊抗兔 IgG, 由碧云天生
物技术研究所提供;其他试剂均为国产分析纯。
2024 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
1 3 主要仪器: CO 150 型 CO 2培养箱 (美国
NBS) ; 680型酶标仪 (美国伯乐公司)、电泳仪、电转
仪 (北京六一仪器厂) ; EPICS XL 流式细胞仪
(美国 Beckman Coulter 公司) ; 低温高速离心机
(美国 Beckman Coulter 公司)。
2 方法
2 1 MTT 法检测冬凌草甲素对 SGC7901 细胞增
殖的抑制作用: 取对数生长期的 SGC7901 细胞, 胰
酶消化后,调整细胞浓度为 1 ! 104 / mL, 按每孔 100
L 接种于 96 孔板中,置 37 ∀ 、5% CO2培养箱中
孵育 24 h 后,每孔加 100 L 不同浓度的冬凌草甲
素, 使冬凌草甲素的终浓度分别为 3 125、6 25、
12 5、25、50 mol/ L ,每个浓度设 8 个平行孔; 阴性
对照组加相同体积的培养液;阳性对照组为 HCPT
( 10 mo l/ L) ,于 37 ∀ 、5% CO2饱和湿度培养箱中
继续培养 72 h 后, 弃上清, 每孔加入 0 5 mg / mL
MT T 溶液 100 L, 继续孵育 4 h, 弃上清液, 每孔
加 150 L DMSO, 振荡混匀后用酶标仪检测波长
570 nm 条件下的吸光度 ( A ) 值, 计算抑制率
及 IC50。
抑制率= (对照组 A 值- 给药组 A 值) /对照组 A 值!
100%
2 2 流式细胞仪检测冬凌草甲素对 SGC7901 细
胞周期的影响: 将浓度为 1 5 ! 105 / mL 对数生长期
SGC7901 细胞接种于 6 孔培养板, 每孔 1 mL, 置
培养箱内培养 24 h 后加入不同浓度的冬凌草甲素
( 0 375、0 75、1 50 mo l/ L ) , 48 h 后分别用胰蛋白
酶消化细胞, PBS洗 3次, 用 70% 冰乙醇固定, 4 ∀
过夜, PBS 洗 1 次后, 用 50 mol/ L PI 染色, 37 ∀
避光培养 30 m in, 300目尼龙网滤过后上机检测, 激
发波长 488 nm ,发射波长 525 nm[ 8] 。
2 3 Western blot ting 法检测冬凌草甲素对 SGC
7901 细胞 Cdk1和 CyclinB1 蛋白表达的影响:将浓
度为 2 ! 105 / mL 对数生长期 SGC7901 细胞接种
于 150 mL 培养瓶中, 每孔 5 mL, 培养箱中孵育
24 h 后,加入不同浓度的冬凌草甲素 ( 0 375、0 75、
1 50 mo l/ L ) , 48 h 后倒掉培养液, PBS 洗 2次, 刮
下细胞, 每瓶细胞加 40 L 含 PM SF 的细胞裂解
液,冰浴放置 30 m in。然后于 4 ∀ 下 12 000 r/ m in
离心 10 min,取上清液,采用考马斯亮蓝法进行蛋
白定量后,分装转移至离心管中放于 - 80 ∀ 保存。
取蛋白进行电泳, 并转移到 NC 膜上, 用含 5% 脱
脂奶粉 T TBS 室温封闭 2 h, 将膜与稀释的一抗
4 ∀ 冰箱中孵育过夜, T TBS 液充分洗膜 3 次, 每
次振摇 10 min,再与碱磷酶标记山羊抗兔 IgG 室温
孵育 2 h,冲洗未结合二抗, TT BS 洗 3 次,每次 10
m in,取出 NC 膜显色后, 用凝胶成像系统照相扫
描,图像凝胶成像分析系统进行分析。实验重复
3 次。
2 4 统计学处理:数据以 x # s 表示, 采用 t检验对
数据进行处理。
3 结果
3 1 冬凌草甲素对 SGC7901 细胞增殖的影响:
M TT 结果表明冬凌草甲素明显抑制 SGC 7901 细
胞的增殖, 冬凌草甲素作用于 SGC7901 细胞的
IC50为 15 64 mol/ L。
3 2 冬凌草甲素对 SGC7901 细胞周期的影响:结
果见表 1。0 375、0 75、1 5 mol/ L 冬凌草甲素作
用 SGC7901细胞 48 h 后, G 2 / M 期的细胞比例明
显升高。
表 1 冬凌草甲素对 SGC7901 细胞周期的影响 ( x# s, n= 3)
Table 1 Effect of oridonin on cell cycle
of SGC7901 cells ( x# s, n= 3)
组 别
C/
( mol L- 1 )
细胞周期 /%
G1/ G0 S G2/ M
阴性对照 - 59 98 # 105 32 54 # 059 7 48 # 0 46
HCPT 1000 48 14 # 071 35 11 # 196 16 75 # 2 47* *
冬凌草甲素 0375 55 99 # 163 30 15 # 106 13 87 # 0 57* *
175 53 14 # 110 32 62 # 049 14 24 # 0 62* *
150 53 16 # 120 31 84 # 192 14 98 # 0 69* *
与阴性对照组比较: * * P< 0 01
* * P < 0 01 v s negat ive cont rol group
3 3 冬凌草甲素对 SGC7901 细胞内 Cdk1 蛋白
表达的影响: 随着冬凌草甲素浓度的增加, Cdk1 的
蛋白表达量逐渐降低, 与阴性对照组比较差异显著
( P< 0 01)。结果见图 1。
3 4 冬凌草甲素对 SGC7901 细胞内 CyclinB1 蛋
白表达的影响: 随着冬凌草甲素浓度的增加,
CyclinB1的蛋白表达量逐渐降低,与阴性对照组比
较差异显著 ( P< 0 05、0 01)。见图 2。
4 讨论
冬凌草甲素对肿瘤细胞周期的阻断作用,是其
抗肿瘤的重要途径之一, 研究表明冬凌草甲素对
MCF10A、HepG2、喉癌等细胞具有周期阻滞作
用[ 911] 。本研究 MT T 结果显示冬凌草甲素对
SGC7901细胞的 IC50是 15 64 mo l/ L, 表明冬凌
草甲素对 SGC7901 细胞增殖有较强的抑制作用。
进一步通过流式细胞仪检测分析表明不同浓度的冬
凌草甲素作用 SGC7901 细胞 48 h 后,各组 G 2 / M
期细胞比例随着药物浓度增加而升高。1 5mol/ L
2025 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
与阴性对照组比较: * P < 0 05 * * P < 0 01, 图 2同
* P < 0 05 * * P < 0 01 v s negat ive cont rol group, Fig. 2 is same
图 1 冬凌草甲素对 SGC7901 细胞 Cdk1 蛋白表达的影响 ( x# s, n= 3)
Fig. 1 Effect of oridonin on protein expression of Cdk1 in SGC7901 cells ( x# s, n= 3)
图 2 冬凌草甲素对 SGC7901 Cyclin B1 蛋白表达的影响 ( x# s, n= 3)
Fig. 2 Effect of oridonin on protein expression of Cyclin B1 in SGC7901 cells ( x# s, n= 3)
冬凌草甲素对 G 2 / M 期的细胞影响最大,这说明冬
凌草甲素可将 SGC7901 细胞阻滞于 G 2 / M 期。
细胞周期蛋白 ( cyclins) 和细胞周期蛋白依赖
性蛋白激酶 ( CDKs) 是主要的细胞周期调控分子,
与 G2 / M 期有关的 cyclins 和 CDKs 分别为 Cyclin
B1 和 Cdk1。Cyclin B1 能与 Cdk1 形成细胞促分
裂因子, 是参与 G2 / M 期转变的调节复合物, 是启
动有丝分裂的关键因子。本研究采用 Wester n
blo tt ing 法检测 Cyclin B1 和 Cdk1 蛋白表达,发现
冬凌草甲素能够显著降低 SGC7901 细胞中 Cdk1
和 Cyclin B1 蛋白的表达, 直接导致 Cyclin B1
Cdk1复合物的形成显著减少[ 12] , 启动有丝分裂关
键因子减少,从而抑制了细胞的有丝分裂,最终导致
细胞发生 G 2 / M 期阻滞。
综上所述, 冬凌草甲素通过下调 SGC7901 细
胞内 Cdk1、Cyclin B1两种蛋白的表达,阻滞细胞于
G2 / M 期而抑制 SGC7901细胞生长。
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