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Effects of several factors on cell growth and ginsenoside accumulation of Panax ginseng suspension culture

几种因素对悬浮培养人参细胞生长和皂苷积累的影响



全 文 :几种因素对悬浮培养人参细胞生长和
皂苷积累的影响
李铁军,廉美兰,于丹,邵春绘,朴炫春
(延边大学 长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室,吉林 延吉133002)
[摘要] 为了完善人参细胞悬浮培养体系,论文研究了人参细胞悬浮培养的动态,探明了培养瓶瓶盖透气滤膜的有无,
摇床转速和接种量对人参细胞生长和皂苷积累的影响。结果表明人参细胞悬浮培养过程中,细胞生物量和皂苷产量在培养
20d时达到最大值,因此,可将培养期定为20d。培养瓶盖上有透气滤膜时有利于人参细胞生长和皂苷合成;悬浮培养时摇床
转速影响细胞生长但对皂苷合成无影响,转数为120r·min-1时,皂苷生产量最高。每个培养瓶接种6g鲜重的细胞时,细胞
生长和皂苷积累明显好于其他接种量,总皂苷质量分数达128mg·g-1DW,生产量达1466mg·L-1。
[关键词] 人参细胞;透气膜;摇床转数;接种量
[收稿日期] 20130618
[基金项目] 国家自然科学基金项目 (81160497)
[通信作者] 朴炫春,Tel:15567662998,Email:lianmeilan2001@
yahoocomcn
  人参PanaxginsengCAMeyer是五加科人参
属的多年生药用植物,主要活性成分人参是皂苷,具
有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、提高人体免疫力及延缓衰
老等功效[1]。目前,人参栽培以播种作为主要繁殖
方式,从播种到收获需要4~6年的时间,管理成本
较高,病害严重,且因为防治这些病虫害频繁使用的
农药带来的残留问题降低了人参产品质量[2],同时
阻碍其向国外市场出口。因此,利用植物细胞培养
工程手段,通过细胞、组织或器官培养获得人参皂苷
便成了解决这些问题的有效方法。
人参细胞和组织培养兴起于20世纪60年代,
其工厂化生产始于20世纪80年代[3]。在进行人参
细胞培养过程中,利用液态培养基进行的悬浮培养
被认为是一种取代传统固态培养基进行培养的方
式,其优势在于细胞增殖速度快,可提供大量均匀一
致的培养物[4]。因此,悬浮培养成为植物组织培养
走向工业化的必经步骤[5]。由于人参市场的需求
量逐年增加,工厂化生产过程中提高人参有效物质
的积累越来越受到人们的关注[6]。本试验调查了人
参细胞悬浮培养过程中细胞生长和底物消耗的动态,
研究了培养瓶的换气条件、摇床转数及接种量对细胞
生长和皂苷积累的影响,旨在完善人参细胞悬浮培养
技术,为人参皂苷的工厂化生产提供理论依据。
1 材料与方法
11 材料培养 将在长白山区采集的5年生新鲜
人参根部洗净,用洗衣粉稀释液中清洗5min,然后
在流水下冲洗5h。将洗净的人参根在无菌状态下
用70%乙醇浸泡1min,再用2%的次氯酸钠溶液消
毒20min,最后用无菌水冲洗3~4次。将已消毒的
人参根切成1cm×1cm的小块接种在 MS+2,4D
10mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂65g·L-1的
培养基中诱导愈伤组织。将诱导出的愈伤组织转接
到含30mL培养基(MS+2,4D10mg·L-1+激动
素(KT)03mg·L-1+蔗糖 30g·L-1+琼脂65
g·L-1)的培养皿(9cm×15cm)中进行继代培
养。继代培养3次后,将愈伤组织用刀打碎后接种至
含50mL液态培养基(MS+2,4D10mg·L-1+
KT03mg·L-1+蔗糖 30g·L-1)的250mL的三
角瓶中,在转数为100r·min-1的摇床上培养。培
养温度为(25±2)℃,相对湿度70%,暗培养。培
养20d后将细胞和培养基的混合液用滤纸过滤后,
收集细胞用于实验材料。
12 人参细胞生长和皂苷积累及物质消耗动态研
究 将悬浮培养的细胞称取4g鲜重(FW),接种到
含50mL培养基 (MS+2,4D10mg·L-1+KT
03mg·L-1+蔗糖 30g·L-1)的250mL的三角
瓶中,在转速为100r·min-1的摇床上培养。培养
温度为(25±2)℃,相对湿度70%,暗培养。培养
过程中,每隔5d停止培养其中一个培养瓶,用滤纸
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过滤混合物,收集滤纸上的细胞称鲜重,收集培养基
测糖及无机盐浓度。将测完鲜重的细胞放入50℃
烘干箱中,待完全干燥后(2d)记录干重,并测定皂
苷含量。
13 培养瓶换气膜的有无对悬浮培养细胞生长和
皂苷积累的影响 将4g人参细胞接种到250mL
的三角瓶中,培养基量为50mL。培养瓶盖分别用
有透气过滤膜(φ=1cm)和无透气过滤膜的铝箔纸
封盖,每组接种3瓶,20d后调查细胞鲜重和干重,
测定皂苷含量。培养条件与12相同。
14 摇床转速对细胞生长和皂苷积累的影响 根
据13的结果,培养瓶用有滤膜的铝箔纸封盖后进
行培养,每个培养瓶中细胞的初始接种量为4g。为
了探明摇床转数的影响,将接种的培养瓶分别置于
转数为80,100,120r·min-1的摇床上,20d后对细
胞生物量和皂苷含量进行测定。培养基和培养条件
与12相同。
15 接种量对人参细胞生物量及皂苷积累的影响
 为探明接种量对人参细胞生长和皂苷积累的影
响,在每个培养瓶中分别接种2,4,6,8g人参细胞,
用有滤膜的瓶盖封盖后,将摇床转数调节为120r·
min-1后培养。其他条件同13。
16 皂苷及糖和阴阳离子浓度测定 不定根中人
参皂苷测定:按《中国药典》方法[7],取人参细胞干
燥粉末(过100钼筛)1g,精密称定,置索氏提取器
中,加三氯甲烷约100mL,加热回流3h,弃去三氯
甲烷液,药渣挥干溶剂,连同滤纸筒移人具塞锥形瓶
中,精密加入水饱和正丁醇50mL,密塞,放置过夜,
超声(250W,40kHz)处理30min,滤过,弃去初滤
液,精密量取续滤液25mL,置蒸发皿中蒸干,残渣
加甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加甲醇稀释至刻
度,摇匀,滤过,取续滤液,即得待测样品。待测样品
利用配有 C18色谱柱(46mm ×250mm,5μm,
Theromoscientific,美国)的高效液相色谱(LC15C,
岛津公司,日本),在紫外可见检测器(SPD15C,岛
津公司,日本)203nm波长处进行检测;进样量为10
μL,流动相为乙腈与水,流速为10mL·min-1,柱
温为30℃。人参皂苷对照品 Rb1,Rb2,Rc,Rd,Re,
Rf,Rg1由成都曼斯特生物科技有限公司提供。总皂
苷含量为单体皂苷之和,皂苷生产量 =细胞干重 ×
20×皂苷含量。测定人参皂苷含量的流动相洗脱
条件参照Wu等[8]方法,流动相水乙腈,梯度洗脱
程序为 0~10min,75%水;10~15min,68%水;
15~20min,45%水;20~25min,40%水 25~40
min,0水;40~50min,75%水。
培养基中糖及离子浓度的测定:将收集的培养
液,用过滤器(滤膜孔径02μm)过滤,稀释10倍后
利用Lian[9]等的方法分别利用配有 C18色谱柱(78
mm×300mm,5μm,WatersCo,Milford,美国),
ICParAnionHR色谱柱(46mm×75mm,5μm,
WatersCo,Milford,美国)和 ICParCM/D色谱柱
(39mm×50mm,5μm,WatersCo,Milford,美
国)的高效液相色谱仪(LC15C,岛津公司,日本)测
定培养基中残留的糖浓度和无机盐的阴阳离子浓
度。糖浓度测定流动相为乙腈水 80∶20,阳离子浓
度测定流动相为05mmol·L-1EDTA与2mmol·
L-1HNO3的混合液,阴离子浓度测定流动相为16
mmol·L-1NaHCO3与 14mmol·L
-1Na2CO3混合
液,流速均为10mL·min-1。
17 数据分析 数据为3次重复的平均值,利用
SAS(statisticalanalysissystem,Cary,NC,USA)程序
中方差分析对试验数据进行分析,采用邓肯氏新复
极差法进行比较,显著水平为005。
2 结果与分析
21 人参细胞生长、皂苷积累以及培养基消耗动态
变化 人参细胞的鲜重与干重的变化趋势类似,随
着培养时期呈增加的趋势,从培养开始到第10天,
细胞的鲜重与干重增加缓慢,第10~25天时,鲜重
与干重迅速增加,鲜重(111g·L-1)和干重(4960
mg·L-1)在第25天时达到最大,25d后鲜重和干
重不再继续增加(图1)。
图1 悬浮培养过程中人参细胞鲜重和干重的变化
Fig1 Changesoffreshweightanddryweightduringcelsus
pensioncultureofPanaxginseng
  人参细胞中的皂苷含量在培养0~10d变化不
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大,而在10~20d增加迅速,20d时达到66mg·
g-1DW;皂苷生产量变化趋势与总皂苷质量分数变
化趋势相同,同样在第20天达到高峰,为532mg
·L-1。20~25d皂苷含量和生产量下降,25d后
保持稳定(图2)。因此,为了得到最大量的皂苷,人
参细胞培养以20d为宜。
图2 悬浮培养过程中人参细胞中皂苷含量和皂苷生产量
的变化
Fig2 Changesofginsenosidecontentandproductivityduring
celsuspensioncultureofPanaxginseng
  在人参细胞培养过程中,对培养基中糖浓度进
行测定的结果(图3),0d时蔗糖浓度为268g·
L-1,同时葡萄糖和果糖的质量浓度分别为14,25
g·L-1,这是因为在培养基经过高压灭菌后,培养基
配制时加入的300g·L-1的蔗糖部分分解为葡萄
糖和果糖。在培养的前5d,蔗糖质量浓度急速下降
为040g·L-1,而从 10d之后,培养基中无蔗糖。
果糖浓度在培养过程中呈现不断的波动变化,最大为
58g·L-1,最小为23g·L-1;葡萄糖浓度则在0~5
d有所上升到37g·L-1,而在5d后则一直呈缓慢下
降趋势,到培养第30天时降到005g·L-1。
图3 人参细胞培养过程中培养基中糖浓度的变化
Fig3 Changesofsugarconcentrationduringcelsuspension
cultureofPanaxginseng
  对培养基中残留的 NH4
+,K+,Mg2+,Ca2+等阳
离子和 NO3
-,Cl-,SO4
2,H2PO4
-等阴离子进行了
测定,所有离子浓度在培养的0~5d出现急速下降的
趋势,但在5~30d,各离子浓度变化不大,趋势相似
(图4)。人参细胞对SO4
2-和H2PO4
-的吸收最为迅
速,其中SO4
2-由培养0d的85mmol·L-1下降到第5
天的08mmol·L-1,从10d后为0;而H2PO4
-则从0
d的58mmol·L-1下降到5d的05mmol·L-1,之后
浓度缓慢下降,第30天时全部被吸收。
图4 人参细胞培养过程中培养基中离子浓度的变化
Fig4 Changesofionconcentrationduringcelsuspensioncul
tureofPanaxginseng
  阳离子中Mg2+与 NH4
+浓度变化趋势相同,在
培养的5~15d时几乎不变,15d后浓度逐渐减小,
到第30天时降到最低;K+在培养的5~15d有所
减少,而在 15~25d则有所上升之后逐渐减少;
Ca2+则在培养的5~35d的浓度变化都不明显,在
25~30d时降低到最小浓度。
22 培养瓶盖换气膜的有无对振荡培养人参细胞
生长和皂苷积累的影响 通过上述动态学研究,人
参细胞进行悬浮培养20d后,调查了培养瓶盖换气
膜的有无对细胞生物量及皂苷积累的影响,结果发
现培养瓶盖换气膜的有无对细胞生物量和皂苷积累
有影响。有换气膜时,人参细胞的鲜重(95g/瓶)
和干重(4087mg/瓶)明显高于无换气膜处理。皂
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苷含量在换气膜处理也显著高于无换气膜处理,细
胞中皂苷总量达到83mg·g-1DW,生产量达到678
mg·L-1(表1)。说明在人参细胞振荡培养时,使用有
滤膜的瓶盖有利于细胞生长和皂苷的合成。
表1 培养瓶盖有无透气过滤膜对不定根生长和皂苷含量
及生产量的影响
Table1 Efectsofventilatedfilteroncelgrowth,ginsenoside
content,andproductivityofPanaxginseng
处理
鲜重
/g/瓶
干重
/mg/瓶
总皂苷
/mg·g-1DW
皂苷生产量
/mg·L-1
有滤膜 95a 4087a 83a 678a
无滤膜 79b 3769b 70b 528b
  注:不同字母表示在005水平上差异显著(表2,3同)。
23 摇床转速对振荡培养的人参细胞生长和皂苷
积累的影响 将振荡培养的摇床转数分别设置为
80,100,120r·min-1后培养20d,发现转数为120r·
min-1时细胞鲜重和干重明显高于80,100r·min-1
处理,而80,100r·min-1间无明显差异。皂苷含量
不受摇床转数的影响,在3种转数处理间皂苷含量
无明显差异,但在120r·min-1处理中由于细胞干
重值高,导致皂苷生产量出现最高值(716mg·
L-1)(表2)。因此,进行人参细胞培养时将摇床的
转数调节为120r·min-1较适宜。
表2 摇床转速对细胞生长和皂苷含量及生产量的影响
Table2 Efectsofrevolutionspeedsoncelgrowthandginsen
osidecontentandproductivityofPanaxginseng
转数
/r·min-1
鲜重
/g/瓶
干重
/mg/瓶
总皂苷
/mg·g-1DW
皂苷生产量
/mg·L-1
80 91b 4003b 76a 608b
100 90b 4065b 77a 626b
120 104a 4774a 75a 716a
24 接种量对人参细胞生长和皂苷积累的影响
为了调查细胞初始接种量对其生长和皂苷合成
的影响,在每个培养瓶中接入2,4,6,8g细胞进行
培养,发现随着接种量的增加细胞鲜重和干重逐渐
增加,但接种量在多于6g时干重不再增加(表3)。
从表4还可知,人参皂苷在接种量为6g时皂苷含
量最高(128mg·g-1DW),接种量高于或低于6g
时不利于总皂苷含量的提高;皂苷生产量也在6g
接种量处理出现最大值(1466mg·L-1)。
表3 接种量对人参细胞生长和皂苷含量及生产量的影响
Table3 Efectsofinoculationdensityoncelgrowth,ginsen
osidecontentandproductivityofPanaxginseng
接种量
/g/瓶
鲜重
/g/瓶
干重
/mg/瓶
总皂苷
/mg·g-1DW
皂苷生产量
/mg·L-1
2 33d 1865d 75d 280d
4 91c 3965c 114b 904c
6 124b 5726a 128a 1466a
8 157a 5891a 101c 1190b
3 讨论
人参细胞的生长是一个动态变化的过程,细胞
生物量的增加需要经历生长的缓冲阶段、生长快速
阶段及生长的平稳阶段3个阶段,这与李慧娟等[10]
研究的反应器培养人参不定根的生长趋势相一致。
无机盐是植物生长发育不可缺少的营养成分,人参
细胞培养过程中,细胞不断吸收培养液中的无机盐,
总体上都是在前5d利用最多,之后便达到相对平
衡,这其中以阴离子中的SO4
2-和H2PO4
-的吸收最
为迅速,且对 SO4
2-的利用率最高,这与吕连媛
等[11]的研究结果不同,说明不同的植物对于营养液
中无机盐的需求量不同。
利用瓶盖具有透气滤膜的培养瓶对人参细胞悬
浮培养的效果优于无透气滤膜的情况,说明人参细
胞的生长发育也是需要进行气体交换的有氧新陈代
谢过程。培养基中溶氧量不足时,细胞的新陈代谢
受到抑制,细胞的生长和皂苷的合成速率也会相应
下降。氧气作为氧化磷酸化代谢的最终电子受体,
在能量代谢中起重要作用同时参与许多次生代谢产
物的合成反应。因此,系统中的溶氧浓度对培养效
果的影响很大[12]。悬浮培养过程中,摇床的转数影
响培养基的溶氧,长春花细胞过低转数下生长不良,
较高转数促进细胞生长[13];此外转速还影响着细胞
与培养液的接触与吸收利用情况,摇床转速过低,细
胞在培养基中不能形成均匀的离散系,导致营养吸
收不完全,使得细胞生长缓慢,影响次生代谢产物的
积累;摇床转速过高,则存在着细胞与培养液之间剪
切力过大,导致细胞产生破碎现象使培养液变浑
浊[14],本试验中低转数条件下细胞生长不良,这可
能是因为培养基中溶氧量多低而至。这与周煜
等[12]的研究结果相似,因此人参细胞悬浮培养的摇
床转速可调节至120r·min-1。
已有研究表明,植物组织培养过程中,外植体接
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入量与培养基量、空气量等比值直接影响其生长发
育[15]。接种量过少,不仅浪费空间资源,也达不到
大规模生产的目的[16],接种量过多则导致培养初期
外植体间竞争养分激烈,致使一部分外植体褐变死
亡,不利于后期的继代培养与皂苷生产。王娟等[17]通
过研究发现接种量的多少对西洋参悬浮细胞生长以及
人参皂苷Re和Rb1的合成有显著影响,而本试验中确
定的悬浮培养人参细胞的最佳接种量为鲜重6g。
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Efectsofseveralfactorsoncelgrowthandginsenosideaccumulationof
Panaxginsengsuspensionculture
LITiejun,LIANMeilan,YUDan,SHAOChunhui,PIAOXuanchun
(KeyLaboratoryofNatureResourceofChangbaiMountain&FunctionalMolecular,Yanbian
University,MinistryofEducation,Yanji133002,China)
[Abstract] ToimprovecelsuspensionculturesystemofPanaxginseng,thedynamicofcelgrowthandmediumconsumption
werestudied,andtheefectsoffilterontheculturevessel,revolutionnumber,andinoculationdensityoncelgrowthandginsenoside
accumulationwerealsoinvestigated.Themaximumcelgrowthandginsenosideaccumulationwasfoundonthe20thdaysofsuspension
culture,therefore,20dayswereconfirmedasasuitablecultureperiodformassproductionofginsenoside.Celgrowthandginsenoside
contentwerepromotedwhentheculturevesselhadaventilatedfilter.Revolutionspeedduringsuspensioncultureafectedcelgrowth,
butnotginsenosidecontent,apeakofginsenosideproductivitywasfoundinthetreatmentof120r·min-1.Inoculationdensityalsoin
fluencedcelgrowthandginsenosideaccumulation,inoculationdensityof6gwasbeterthanotherinoculationdensities,theginsen
osidecontentandproductivitywereupto12.8mg·g-1DWand146.6mg·L-1,respectively.
[Keywords] ginsengcel;ventilatedfilter;revolutionspeed;inoculationdensity
doi:10.4268/cjcmm20132311
[责任编辑 吕冬梅]
·1504·
第38卷第23期
2013年12月
                             
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