全 文 ：· 药剂与工艺 ·
人参细胞培养物中过氧化氢酶活力的测定
中国药科大学生化教研室
(南京 2 1 0 0 0 9 )
组织培养室
胡卓逸 守 史建勋
丁 家宜
摘 要 测定了不同生长期的人参细胞培养物中过氧化氢酶的活力 , 结果表明此酶活力随人参细
胞的培养时间而异 。 酶的单位鲜重活力从 10 d 到 21 d 内较快升高 , 在抽样测定中以 Zl d 时为最
高 , 约为 1 8 u / m g 人参细胞培养物 。
关键词 人参细胞培养物 过氧化氢酶
人参 P a n a x g in se n g , C . A . M e ye r 是一
种名贵的中药材 , 具有多方面的疗效 。野生药
材资源缺乏 , 人工栽培又有一定的困难和限
制 。 希望人参细胞培养能为人参的开发利用
提供新途径 , 为抗衰老药物研制提供新材料 。
根据衰老原因与机制学说 〔‘, , 认为生物大分
子交联和体细胞突变等因素对机体造成了不
可逆损伤 , 长此积累导致衰老 。而 自由基和过
氧化物是造成上述损伤的直接原因 。 抗氧化
酶在防 正此种损伤中起着重要作用 , 已有报
道从多种药用植物中检测到了抗氧化酶的活
性 〔2〕。 过氧化氢酶是 一种抗氧化酶 , 它能特异
地清除 H Z(〕: 〔3〕, H ZO : 与氧 自由基 的产生有
密切关系 〔‘〕 。 我们试图检测人参细胞培养物
(CMG C )中 的过氧 化 氢酶 (C A T )活性 , 以
C A T 为 目标 产 物 , 检 测 不 同 培 养 时 间 的
CMG C 中的 C A T 活力 , 可能为人参细胞培
养时间的确定提供依据 。
1 仪器与试剂
G L ZOA 型全 自动高速冷冻离心机 (湘西
仪器仪表总 厂 ) ; BH 一 2 型 显 微镜 (O LYM -
P U S)
;牛 血清 白蛋 白(B S A , 生化试剂 , 上海
生物制品研究所 ) ;考马斯亮兰 (C BB )G 一 2 50
(F fu ka )
; 过氧 化氢酶 (C A T , 中科院上海 生
化研究所 ) ; 其它试剂均为 A R 级 , 实验用水
均为重蒸馏水 。
2 供试样品
CMG C 及空 白培养基 (不含琼脂 ) 由本
校组织培养研究室提供 。 CMG C 培养时间分
别为 1 0 、 2 0 、 2 9 、 3 7 、 5 7 d 。 CMG C 培养基为固
体 MS 培养基〔4〕 。
3 方法与结果
3
,
1 粗酶提取液的制备 : 扭力天平称取新鲜
e M G e 2
.
5 0 0 9
, 加入 p H 7 . 5 5 磷酸盐缓冲
液 5 . 0 m L , 于冰浴中匀浆 3 m in , 取匀浆于
o ℃ , 8 o o o r / m in 离心 1 0 m in , 得上清液 (即
粗酶提取液 )待测 。
3
.
2 细胞破碎率的检测 : 取上述处理过程中
的匀浆 , 直接装片 , 于显微镜 (1 0 X 40 倍 )下
观察细胞破碎情况 , 测得细胞破碎率大于
9 5 %
。
3
.
3 蛋 白质含量测定 : 用 C BB G 一 2 50 法图
测定粗酶提取液中的蛋 白质含量 , 以 B S A 为
标准 。
3
.
4 过氧化氢酶活力测定 :采用改进的铝酸
钱 显 色 法 测 定 CMG C 粗提液 中 C A T 活
力 〔6 , 。基于底物 H 2 0 2 能与显色剂钥酸钱反应
生成稳定的黄色复合物 , 可在 4 05 n m 处测
, A d d r e s s
:
H u Z hu o yi
,
De p
a r tm e n t o f B io e h m is tr y
,
C h in a Ph a rm a e e u tie a l U n iv e r s ity
,
N a n jin g
《中草药》1 99 7 年第 28 卷第 6 期 · 3 3 5 ·
0
.
5 0
0
.
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奥堪月闷日、灿朝如妈扣断
时 I’ti I t ( ‘l)
图 1 不同培养时间 CM G C 粗提液中蛋
白质的含里
定其吸收值 。 CA T 催化 H ZO : 分解成 H ZO 和
O
: , 从而降低底物量 , 使黄色复合物生成 的
量减少 。 以 CA T 标准品建立了扣除空 白培
养基对该酶活力影响的标准曲线 。
表 1 不同培养时间的 CM G C
酶活力 ( tJ、
图 2 C A T 活力测定标准曲线
样品中 CA T 活力测定 : 取粗酶提取液
2 0 0 拜L 同制作标准曲线条件 , 测定其 C A T
活力 。粗酶提取液与底物反应后 , 加显色剂测
A 40
5 。m , 再查标准曲线得出相应的 C A T 活力
单位 (U ) 。 进而求出酶的 比活力 (C A T 单位 /
中的 C A T 活力 ( n = 4 ) ( x 士 : )
培养时间 ( d)
CA T 活力 , (U / m g 蛋白质 )
C A T 单位鲜重活力 (U / m g CM G C )
I 0
5 8
.
2 2士 7 . 14
9 5
.
0 8士 1 0 . 4 8
8 5
.
2 6 士 4 . 0 8 1 0 6 . 7 9士 1 0 . 5 5 1 28 . 5 1士 17 . 2 5 5 6 3 . 0 7士 6 2 . 8 6
1 8 8
.
1 1士 6 . 7 5 1 3 6 . 1 5士 5 . 1 3 1 34 8 6士 2 . 5 6 1 5 6 , 0 4士 3 . 2 3
m g 蛋白质 )及单位鲜重酶活力 (单位鲜重酶
活力 ~ C A T 活力 单位/ 对应的新鲜 CM G C
重量 , g ) 。
4 讨论
4
.
1 在 低 温 情 况 下 手 动 匀 浆 器 破 碎
CM G C
, 经显微镜检查破碎效果 良好 , 细胞破
碎率在 95 %以上 , 使酶的释放较为完全 , 因
而测得粗提液中的酶活力单位较为可靠 。
4
.
2 由于培养条件 、成分及细胞生长 、代谢
成分的复杂性 , 操作中特别注意保持被测酶
活力免受其它 因素的影响 , 如保持 在 o ℃ 一
4
‘
C操作及样品液的低温贮存 , 提取溶剂的低
温处理 , 割除文献 〔7 〕上用有机溶剂 、 E D T A 等
处理的过程等等 。
4
.
3 用钥酸钱显色 后的 比色法比之高锰酸
钾滴定法测 CA T 活力 , 前者快速 、 简便 、专
一性强 , 本实验 已扣 除培养基对酶活力的影
响 , 提高了实验的准确性 。
4. 4 如果能测定不同生长期 的栽培人参中
的 C A T 活力 , 比较 CM G C 细胞和栽培人参
细胞生长过程中 C A T 酶活力和蛋白质含量
变化 , 将有助于优选人参细胞的培养条件 , 或
许可以作为判断人参细胞培养物的诸多质量
指标中的一个指标 。
参 考 文 献
l 冯新为. 病理 生理学 (第三版 ) . 北京 : 人民卫生出版社 ,
1 9 9 3
.
1 8
、
2 2 0
2 吴国荣. 南京师范大学学报 , 1 9 9 1 , 1 4 ( 2 ) : 9 3
3 莫 简. 生物化学与生物物理学进展 , 19 81 , ( 2) ; 23
4 江苏省植物组织培养研 究协会编 . 经济植物组织培养实
用技术 . 南京 : 江苏科学技术出版社 , 19 8 . 2 37
5 B r
a
d fo r d M M
.
A n a l Bio e h e m
,
1 9 7 6
, 7 2 : 2 4 8
6 G o t h L
.
C lin ie a C h im ie a A e t a , 1 99 1 , 1 9 6 : 1 43
7 陆 玲 . 南京师范大学学报 , 19 90 , 1 3( 2) : 93
( 1 9 9 6
一
0 9
一
0 3 收稿 )
D e te r m i n a tio n o f C a t a la s e A e t iv ity in C u ltu r e M e d iu m o f G i n s e n g C e lls
H u Z h u o y i
, D i n g Jia y i
, e t a l
Ca t a la s e a e t i v it y i n e u lt u r e m e d i u m o f G i n s e n g e e lls ( CM G C )
a t d iffe r e n t e u lt u r a l t im e w a s a s s a y e d
.
R e
-
·
3 3 6
.
s u lts s ho w e d th a t t h e e n z y m e a e tiv it y v a r ie d w ith e u ltu r a l tim e o f CM G C
.
T h e e n z ym e a e tiv ity p e r g r a m o f
fr e s h CMG C in
e re a s e d r a p idly fr o m d a y o f 1 0 to d a y 2 1
, t o r e a e h a m a x im u m v a lu e o f 1 8 8 U / m g CMG C
a t d a y
2 1
.
木香挥发油的超临界 CO : 萃取及质量研究
红修陈邓四川轻化工学院化工系 (自贡 6 43 0 3 3)
华东理工大学化学工程研究所
摘 要 用超临界 CO : 流体萃取法代替传统水蒸汽蒸馏法对木香挥发油的提取及其中主要活性
成分之一去氢木香内醋的相对含量进行了研究 。 结果表明超临界萃取法不仅挥发油的收率高 , 而
且活性成分含量也高 。
关镇词 木香 去氢木香内酷 超临界萃取
木香系菊科植物木香 A u ck la n di a laP 。
D ec n e
. 的干燥根 , 具有行气止痛 、 消食健脾
之功效 。木香主含挥发油 , 其活性成分主要为
倍半菇内醋 〔1 , , 其中主要成分之一去氢木香
内酷 (d e h yd r o e o s t u s la e t o n e )具有松弛 平滑
肌 、解痉 、抑制由 KCI 诱导的主动脉收缩作
用 〔2 , 3“及中度降低血压作用〔1 , 。
超临界流体萃取是近年来广泛应用的一
种新型分离 、提取技术 〔们 。超临界流体具有和
液体相近的密度 , 其粘度虽高于气体但明显
低于液体 , 扩散系数为液体的 10 ~ 1 0 倍 。因
此 , 对物料有较好的渗透性和较强的溶解能
力 。 CO : 由于临界温度较低 (T 。 ~ 31 . 3 ℃ ) 、
无毒、不 易燃 、化学惰性 、价廉等优点而成为
药用有效成分超临界提取的首选介质 。 我们
对木香挥发油 的超临界 CO : 萃取进行了研
究 , 并用 G C 分析了其中主要活性成分去氢
木香内醋的相对含量 。结果表 明 ,无论是挥发
油的收率还是去氢木香内酷的含量均优于水
蒸汽蒸馏法 。 超临界流体萃取可成为药用有
效成分提取及质量研究的有效方法 。
1 实验部分
1
.
1 材料 : 木香 : 云南省宜 良县 1 9 9 4 年产云
木香切片 , 购于四川省自贡市药材公司 , 粉碎
后过 20 目筛备用 。 CO Z 上海市西 比欧气体有
限公司产 C O Z 气 。 去氢木香内酷 : 将木香挥
发油用重结晶方法提取其中去氢木香内酷晶
体 , 熔点 (5 9 ℃一 6 0 ℃ ) ; M S 、 ‘H NM R 与文献
值一致 〔” , ”〕。 所用试剂均为分析纯 。
1
.
2 仪器 : 超临界萃取装置为瑞士 N O V A
公司小型超临界萃取装置 。 气相色谱为日本
岛津 G C 一 3A 型气相色谱 , C 一R 3 A 数据处理
机 。
1
.
3 实验方法 : 超临界萃取 : 称取 1 0 9 木
香粉于 萃取器中 , 用 CO : 排除萃取器中空
气 , 调节萃取器 、分离器压力 、温度 、CO : 流量
至实验值 。 连续萃取 Z h 后从分离器中取 出
产物 , 除去其中水分 , 称量得木香挥发油 , 收
率按下式计算 。
挥发油收率 刀- 木香油质量木香粉质量 X 1 0 0 %
水蒸汽蒸馏 : 称取木香粉 10 0 9 于 圆底
. A d d r e s s : C he n h o n g
,
S ie h u a n In s tit u te o f L ig ht In d u s tr y a n d C h e m ie a l T e e h n o lo g y
,
Z ig o n g
陈虹 , 1 9 8 3 年 7 月毕业于成都科技大学化学工程系化学工程专业 , 现在化学工程系化工原理教研室从事教学工作 , 讲师 。研究方向 : 传质与分离 。
《中草药》19 97 年第 2 8 卷第 6 期 一 3 3 7 -