全 文 ：在线二维液相色谱法快速测定桂枝茯苓胶囊中
芍药苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的含量
张艳海１，张大伟２，孟兆青３，４，刘绿叶１，金燕１
（１赛默飞世尔科技（中国）有限公司，上海 ２０１２０３；
２黑龙江省农垦总局总医院，黑龙江 哈尔滨 １５００８８；
３江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 ２２２００１；４中国药科大学，江苏 南京 ２１０００９）
［摘要］　使用双梯度液相色谱系统和紫外检测器，建立在线二维液相色谱方法，同时测定桂枝茯苓胶囊中芍药苷、丹皮
酚、苦杏仁苷和肉桂酸的含量。采用双梯度液相色谱的其中一个泵为一维分离泵，以乙腈为有机相，００８％磷酸＋００８％三乙
胺为水相，梯度洗脱，采用 Ｃ１８色谱柱（３０ｍｍ×１５０ｍｍ，３μｍ），流速０５ｍＬ·ｍｉｎ
－１；利用双梯度液相色谱的另外一个泵为二
维分离泵，以乙腈为有机相，以２０ｍｍｏｌ，ｐＨ３０的磷酸二氢钾为水相，梯度洗脱，采用 ＰＡⅡＣ１８色谱柱（４６ｍｍ×１５０ｍｍ，３
μｍ），流速０８ｍＬ·ｍｉｎ－１；检测波长２１８，２３０，２７５ｎｍ，采用波长切换方式。芍药苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的线性范围分
别为５５５～２２２，６６～２６４，３３～１３２，０３１５～１２６ｍｇ·Ｌ－１；ｒ分别为０９９９７，０９９９５，０９９９８，０９９９７；４个成分的平均回收
率在９６１２％～１０３９％。该方法快速，测定结果准确可靠，可用于评价药物质量。
［关键词］　二维液相色谱；双梯度液相色谱；桂枝茯苓胶囊；苦杏仁苷；肉桂酸
［收稿日期］　２０１３０４１８
［通信作者］　金燕，Ｔｅｌ：（０２１）５８９５７００１，Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｊｉｎ＠ｔｈｅｒ
ｍｏｆｉｓｈｅｒｃｏｍ
［作者简介］　张艳海，硕士，从事色谱分析工作，Ｅｍａｉｌ：ｙａｎ
ｈａｉ８８２００２＠ｙａｈｏｏｃｏｍｃｎ
　　高效液相色谱已成为中药复杂体系研究的重要
技术，随着新型色谱柱填料和键合技术的发展，为中
药中各类成分的分离提供了多种选择，然而中药的
复杂性已远远超出了人们的设想，Ｄａｖｉｓ等［１］曾经指
出用一维分离方法对含有１００个随机组分的样品进
行分离，完全分离８２个组分，至少需要４００万的理
论板数，且当色谱峰的数量超过峰容量的３７％时，
系统的分离度会大大降低，所以在现有技术条件下，
期望如此高的柱效和峰容量是不切实际的。多维液
相色谱分离是液相色谱发展的一个重要方向，它是
将多种不同分离机制的色谱体系进行联用，增加了
色谱系统的分离能力，扩大了分离空间，提高了系统
的峰容量，可以满足复杂样品的分离要求。在多维
色谱分离手段中，二维分离最为常见。二维色谱根
据一维组分是否直接进入到第二维进行分离可分为
离线［２４］和在线［５６］２类，其中在线方法具有自动化
程度高、避免人为误差及加快样品分析效率等优点，
二维液相色谱分离技术已被越来越多的应用到中药
的研究中［７９］。
桂枝茯苓胶囊系汉代张仲景《金匮要略》古方
桂枝茯苓丸的改进剂型，经现代制造工艺精制而成
为纯中药制剂，由桂枝、牡丹皮、桃仁、赤芍和茯苓组
成。在２０１０年版《中国药典》中收载的桂枝茯苓胶
囊含量测定项下分别采用３种高效液相色谱法测定
丹皮酚、芍药苷和苦杏仁苷的含量［１０］，不仅实际样品
的分析效率较低，且缺乏来自桂枝中的指标性成分。
本文利用双梯度高效液相系统（ｄｕａｌｇｒａｄｉｅｎｔｌｉｑｕｉｄ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＤＧＬＣ）在线二维色谱分离技术，样品提
取后，溶液直接进样分析，并同时测定了肉桂酸的含
量，含量测定结果与原方法基本一致，且样品分析效率
大大提升，可用于桂枝茯苓胶囊的质量分析。
１　材料
双三元液相色谱 ＲＳ系统（美国赛默飞世尔公
司），配置６通道真空脱气机 ＳＲＤ３６００，双梯度分析
型色谱泵ＤＧＰ３６００ＲＳ，自动进样器ＷＰＳ３０００ＴＳＬ，柱
温箱ＴＣＣ３０００（配有１个六通阀和１个十通阀），二
极管阵列检测器ＤＡＤ３０００ＲＳ，变色龙色谱管理软件
Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ６８ＳＲ１１；ＡｃｃｌａｉｍＰＡⅡ（４６ｍｍ×１５０
ｍｍ，３μｍ，美国赛默飞世尔公司，批号０６３１９１）；Ａｃ
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ｃｌａｉｍＣ１８色谱柱（３０ｍｍ×１５０ｍｍ，３μｍ，美国赛默
飞世尔公司，批号０６３６９１）。
磷酸二氢钾（分析纯，国药集团化学试剂有限
公司）；乙腈、甲醇（色谱级，Ｆｉｓｈｅｒ公司）；去离子水
（１８２ＭΩ，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）；丹皮酚对照品（ｐａｅｏｎｏｌ，纯度
９６８％，中国食品药品检定研究院，批号 １１０８２１
２０１１１２）；芍药苷（ｐｅｎｉｆｌｏｒｉｎ，纯度＞９８％，上海安谱，
ＳＴＡ０７０１３００１）；苦杏仁苷（ａｍｙｇｄａｌｏｓｉｄｅ，纯度 ＞
９９％，上海安谱，ＳＴＡ２０１０７００７）；肉桂酸 （ｃｉｎｎａｍｉｃ
ａｃｉｄ，纯度＞９９％，上海安谱，ＳＴＡ４３２０００００）。桂枝
茯苓胶囊（江苏康缘药业股份有限公司，产品批号
１１０６２５，１１０６２６，１１０７３０）。
２　方法和结果
２１　色谱条件　一维分析泵的流动相 Ａ为乙腈，
流动相 Ｂ为 ００８％磷酸 ＋００８％三乙胺，Ａｃｃｌａｉｍ
１２０Ｃ１８为一维分析柱，流速为０５ｍＬ·ｍｉｎ
－１，梯度
洗脱，０～１０ｍｉｎ，１５％Ａ，１０～２５ｍｉｎ，１５％～７５％Ａ，
２５～３０ｍｉｎ，７５％～８５％Ａ，３０～３３ｍｉｎ，８５％Ａ，３３～
３５ｍｉｎ，８５％～１５％Ａ；二维分析泵的流动相 Ａ为乙
腈，流动相Ｂ为２０ｍｍｏｌ，ｐＨ３０的磷酸二氢钾，Ａｃ
ｃｌａｉｍＰＡⅡＣ１８为二维分析柱，梯度洗脱程序，０～
５ｍｉｎ，５％Ａ，５～１５ｍｉｎ，５％ ～４０％Ａ，１５～１５２
ｍｉｎ，４０％～５％Ａ，１５２～２０ｍｉｎ，５％Ａ，２０～３０ｍｉｎ，
５％～７０％Ａ，３０～３５ｍｉｎ，７０％Ａ，流速 ０８ｍＬ·
ｍｉｎ－１，柱温 ３５℃，检测波长 ０～１０ｍｉｎ，２３０ｎｍ，
１０～１５ｍｉｎ，２１８ｎｍ，１５～３５ｍｉｎ，２７５ｎｍ，进样量
５μＬ。
２２　对照品溶液的制备　分别精密称取肉桂酸、芍
药苷、苦杏仁苷和丹皮酚对照品适量，按照２０１０年
版《中国药典》桂枝茯苓胶囊项下对照品溶液制备
方法，制得各对照品质量浓度分别为 ０６３，１１１，
０６６，１３２ｇ·Ｌ－１。
２３　样品溶液的制备　取桂枝茯苓胶囊１０粒，将
内容物至研钵中研匀，取细粉约０２５ｇ，精密称定，
置具塞的锥形瓶中，加入５０％甲醇２５ｍＬ，密塞，称
定质量，超声提取３０ｍｉｎ，放冷，再称定质量，补足失
重，摇匀，滤过，取续滤液适量，即得。
２４　专属性试验　分别取缺少桂枝、桃仁、白芍和
牡丹皮的阴性制剂，按照２３项下方法制备阴性样
品。按照上述色谱条件进样分析，对照品、样品、阴性
样品的分离谱图见图１～３。从阴性样品叠加谱图可
以看出，不干扰目标物的测定，方法专属性较好。其
中，０～１０ｍｉｎ为一维色谱分离过程，波长２３０ｎｍ；
１０～１５ｍｉｎ为二维色谱分离过程，波长 ２１８ｎｍ；
１５～２５ｍｉｎ为一维色谱分离过程，波长 ２７５ｎｍ；
２５～３５ｍｉｎ为二维色谱分离过程，波长为２７５ｎｍ。
１芍药苷；２苦杏仁苷；３丹皮酚；４肉桂酸（图２，３同）
图１　混合对照品分离谱图
Ｆｉｇ１　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｍｉｘｅｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ
图２　桂枝茯苓胶囊分离谱图
Ｆｉｇ２　ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＧｕｉｚｈｉｆｕｌｉｎｇｃａｐｓｕｌｅ
１．缺少桂枝的阴性对照样品；２．缺少桃仁阴性对照样品；３．混合对照
品；４．缺少白芍和牡丹皮的阴性对照样品。
图３　专属性试验谱图
Ｆｉｇ３　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｔｅｓｔ
２５　线性关系考察　分别取各对照品溶液 ２ｍＬ
（肉桂酸对照品２００μＬ）至１０ｍＬ量瓶中，加５０％甲
醇至刻度，作为混合对照溶液１，再分别从对照品溶
液１中精密量取５０，２５，１０，０５，０２５ｍＬ至１０
ｍＬ量瓶中，加５０％甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系
列混合对照品溶液。按照２１项下色谱条件进样分
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析，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行线
性回归，肉桂酸、芍药苷、苦杏仁苷、丹皮酚分别在
０３１５～１２６，５５５～２２２０，３３～１３２，６６～２６４ｍｇ
·Ｌ－１线性关系良好，ｒ分别为 ０９９９７，０９９９７，
０９９９８，０９９９５。
２６　精密度试验　取混合对照品溶液连续进样５
次，结果表明，肉桂酸、芍药苷、苦杏仁苷和丹皮酚峰面
积的ＲＳＤ分别为０３３％，０５１％，０３９％，０６４％。
２７　稳定性试验　取待测样品溶液，分别于配制后
０，２，４，６，１０，１２ｈ进样，测定待测成分的峰面积，结
果表明，肉桂酸、芍药苷、苦杏仁苷和丹皮酚峰面积
的ＲＳＤ分别为１４％，０４５％，１１％，０４６％。
２８　重复性试验　取同一批号的桂枝茯苓胶囊样
品粉末５份，每份０２５ｇ，精密称定。按照样品溶液
制备方法制备样品，按照上述色谱条件进行测定，结
果表明，肉桂酸、芍药苷、苦杏仁苷和丹皮酚含量的
ＲＳＤ分别为０３９％，０６５％，０６８％，０７８％。
２９　加样回收率试验　取已知含量的样品６份，每
份０１ｇ，精密称定，置锥形瓶中，加入芍药苷、苦杏
仁苷、丹皮酚和肉桂酸对照品溶液适量，按照供试品
溶液制备方法制备样品并测定含量，计算回收率，结
果见表１。
表１　芍药苷、苦杏仁苷、丹皮酚和肉桂酸的加样回收率
Ｔａｂｌｅ１　Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｏｆｐｅｎｉｆｌｏｒｉｎ，ａｍｙｇｄａｌｏｓｉｄｅ，ｐａｅｎｏｌａｎｄｃｉｎｎａｍｉｃａｃｉｄｉｎＧｕｉｚｈｉｆｕｌｉｎｇｃａｐｓｕｌｅ
成分 样品中量／ｍｇ 加入量／ｍｇ 测得值／ｍｇ 回收率／％ 平均回收率／％ ＲＳＤ／％
芍药苷　 １５６０ １２２０ ２７９０ １００２ ９９０７ １８
１５９０ １２２０ ２８１０ ９９９５
１６１０ １５５０ ３１３０ ９７８２
１５３０ １５５０ ３０７０ ９９３５
１５７０ １７８０ ３２８０ ９６１２
１５２０ １７８０ ３３２０ １０１０
苦杏仁苷 ０９２０ ０７３０ １６４０ ９８７４ ９８２４ １４
０９４０ ０７３０ １６７０ １０１０
０９５０ ０９２０ １８５０ ９８２７
０９００ ０９２０ １７９０ ９６７８
０９２０ ０８６０ １７６０ ９７３５
０９００ ０８６０ １７４０ ９７６７
丹皮酚　 ０７３０ ０５３０ １２５０ ９７７５ ９９６８ ２９
０７４０ ０５３０ １２８０ １０１４
０７５０ ０６６０ １４４０ １０３９
０７１０ ０６６０ １３８０ １００８
０７３０ ０７９０ １５１０ ９８１８
０７１０ ０７９０ １４７０ ９６０８
肉桂酸　 ００１８１ ００１２６ ００３０６ ９９２１ ９７２１ １３
００１８４ ００１２６ ００３０８ ９８３３
００１８６ ００１８９ ００３６９ ９６８３
００１７７ ００１８９ ００３５８ ９５７１
００１８２ ００２５２ ００４２６ ９６８３
００１７６ ００２５２ ００４１９ ９６３４
２１０　含量测定　取批号为１１０７３０，１１０６２５，１１０６２６
的桂枝茯苓胶囊０２５ｇ，精密称定，按照样品前处理
方法制备样品溶液，分别采用本法与药典方法测定，
结果见表２。
３　讨论
３１　分析流路构建　样品中芍药苷与丹皮酚的含
量较高，样品基质成分干扰较少，利用一维色谱进行
分离，而苦杏仁苷与肉桂酸的含量较低，受到基质成
分干扰影响较大，因此采用中心切割的二维分离方
法，将２种成分分别切至二维色谱中进行分离。为
避免在切换转移过程中系统压力的骤然变化对色谱
柱造成的影响，试验中采用定量环储存样品。为减
少一维溶剂效应的影响，试验中采用３００μＬ的定量
环，并尽量减小一维色谱柱的柱体积。同时在一维
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　　　　表２　桂枝茯苓胶囊中芍药苷、苦杏仁苷、丹皮酚和肉桂酸
的质量分数（ｎ＝２）
Ｔａｂｌｅ２　Ｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｐｅｎｉｆｌｏｒｉｎ，ａｍｙｇｄａｌｏｓｉｄｅ，ｐａｅｎｏｌａｎｄｃｉｎ
ｎａｍｉｃａｃｉｄｉｎＧｕｉｚｈｉｆｕｌｉｎｇｃａｐｓｕｌｅ ｍｇ·ｇ－１
批号 分析方法 芍药苷 苦杏仁苷 丹皮酚 肉桂酸
１１０６２５ 本法 １４．９４ ８．７７ ７．２７ ０．１７４
药典 １４．８９ ９．２３ ７．２２ －
１１０６２６ 本法 １４．８５ ８．７２ ７．２５ ０．１７２
药典 １４．８０ ９．２４ ７．３３ －
１１０７３０ 本法 １５．１２ ８．８９ ７．０６ ０．１７５
药典 １５．１８ ９．３０ ７．１３ －
和二维色谱柱的柱后通过１个六通阀实现了检测器
的共用，使方法更具普适性。整个系统流路和阀切
换过程见图４，表３。
３２　色谱条件确定　本文为实现一维和二维分离
选择的正交性，在色谱柱选择上先后尝试了 ＰＦＰ＋
Ｃ１８，ＰＦＰ＋ＰＡⅡＣ１８，Ｃ１８＋ＰＡⅡＣ１８等组合，最终确定
Ｃ１８＋ＰＡⅡＣ１８组合（柱选择性对比函数 ＦＳ ＝
６１［１１］）。可获得良好的峰形和分离度；在流动相选
择上，试验中曾尝试在一维和二维分离中的有机相
分别采用甲醇和乙腈，但由于苦杏仁苷与肉桂酸的
色谱峰在一维分离过程中峰宽较大，切割过程中可
　　
图４　在线二维柱切换系统流路连接示意图
Ｆｉｇ４　Ｆｌｏｗｓｃｈｅｍｅｏｆｆｕｌｙｏｎｌｉｎｅｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｃｏｌｕｍｎｓｗｉｔｃｈｉｎｇｓｙｓｔｅｍ
表３　阀切换过程
Ｔａｂｌｅ３　Ｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｖａｌｖｅｓｗｉｔｃｈｉｎｇ
阀切换时间／ｍｉｎ 右阀位置 左阀位置 说明
０ １０１ ６１ 一维色谱柱与ＵＶ相连，用于芍药苷的测定　
３５ １２ ６１ 将苦杏仁苷切换至ｌｏｏｐ中　
４０ １０１ ６１ 转移结束，一维色谱柱继续分离芍药苷　
１００ １０１ １２ 芍药苷分离结束，二维色谱柱与ＵＶ连接，分析测定苦杏仁苷　
１５０ １０１ ６１ 苦杏仁苷分离结束　
１９０ １２ ６１ 将肉桂酸转移至ｌｏｏｐ环　
１９５ １０１ ６１ 一维色谱柱与ＵＶ连接，分析测定丹皮酚　
２５０ １０１ １２ 二维色谱柱与ＵＶ连接，测定肉桂酸　
能会造成损失，若一维分离的有机相也采用乙腈，则
２种成分的峰宽较小，且与二维色谱流动相相溶性
较好。在水相选择上，本文为使芍药苷和丹皮酚在
一维分离过程中获得良好的峰形和分离度，选择了
００８％磷酸系统，并加入了 ００８％的三乙胺，而二
维水相中加入磷酸缓冲盐，可以减少一维溶剂 ｐＨ
变化对二维分离造成的影响。
３３　含量测定结果比较　比较样品的含量测定结
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果发现，芍药苷、丹皮酚的含量基本一致，但苦杏仁
苷的含量差异较大（本法较药典方法低近５％）。本
文首先对比了采用药典方法和本法的样品谱图中苦
杏仁苷色谱峰的 ＵＶ光谱均匀性，结果二者基本一
致，且光谱均匀性均较好，无法通过ＵＶ二极管阵列
检测器来判断方法的专属性。因此本文采用二维分
离手段，在常规药典方法基础上，将苦杏仁苷峰的主
体中心切割至第二维色谱柱中进行分离，结果见图
５，由于一维和二维色谱柱存在分离选择性的差异，
结果在同样检测波长下，在二维分离的谱图中可见
明显杂质峰（ｔＲ＝１６９５３ｍｉｎ），说明常规药典的分
离手段存在基质干扰。因而造成了最后的含量测定
结果偏高。
图５　桂枝茯苓胶囊二维分离谱图
Ｆｉｇ５　ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＧｕｉｚｈｉｆｕｌｉｎｇｃａｐｓｕｌｅｂｙｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎ
ａｌｓｅｐａｒａｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ
４　结论
中药成分较为复杂，理化性质差异较大且结构
类似的化合物较多，因此谱峰重叠现象较常见。通
过系统的方法学验证，表明本试验所建立二维色谱
分析方法，简便快速，自动化程度高，且可同时进行
桂枝茯苓胶囊中４种成分的含量测定。利用一维和
二维色谱柱分离机制的差异，提高了系统的分离能
力，消除了基质成分的干扰，测定结果更加准确，对
提高分析效率，控制药物质量具有一定意义。
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ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡ，２００６，１１３７（１）：４２
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２００４，１０６０：７７
·２９０４·
第３８卷第２３期
２０１３年１２月
　　　　　　 　 　 　 　 　 　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ３８，Ｉｓｓｕｅ　２３
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２０１３
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３ＪｉａｎｇｓｕＫａｎｉｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ，Ｌｔｄ，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ２２２００１，Ｃｈｉｎａ；
４ＣｈｉｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
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［责任编辑　曹阳阳］
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第３８卷第２３期
２０１３年１２月
　　　　　　 　 　 　 　 　 　　　　 　 　 　 　
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