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Effect of nourishing Yin, strengthening Qi and activating blood decoction on Fas/FasL in salivary glands of NOD mice with sjogren’s syndrome and their mRNA expression

养阴益气活血方药对干燥综合征NOD小鼠颌下腺Fas/FasL及其mRNA表达的影响



全 文 :养阴益气活血方药对干燥综合征 NOD小鼠颌下腺
Fas/FasL及其 mRNA表达的影响
吴国琳1,李天一2,卢雯雯1,余国友1,范永升2
(1浙江大学 医学院 附属第一医院,浙江 杭州 310003;
2浙江中医药大学,浙江 杭州 310053)
[摘要] 目的:观察养阴益气活血方药对干燥综合征NOD小鼠颌下腺组织 Fas/FasL及其 mRNA表达的影响。方法:32
只NOD小鼠随机分为模型组、中药组(每天按100g·kg-1灌胃养阴益气活血煎剂04mL)、羟氯喹组(每天按60mg·kg-1灌
胃羟氯喹04mL)、中西药组(每天灌胃养阴益气活血煎剂50g·kg-1+羟氯喹60mg·kg-1,04mL),每组8只,选8只
Balb/C小鼠做为正常对照组。实验进行8周后处死小鼠,解剖摘取颌下腺,免疫组织化学法检测颌下腺组织Fas,FasL蛋白的
表达;RTPCR法检测颌下腺组织Fas,FasLmRNA的表达。结果:模型组小鼠颌下腺组织Fas,FasL表达均高于其他各组(P<
005)。对照组FasL表达明显低于羟氯喹组(P<005)。模型组小鼠颌下腺 FasmRNA相对表达量均高于其他组,对照组明
显低于其他各组(P<005)。模型组小鼠颌下腺FasLmRNA表达高于中药组、中西药组(P<005);中西药组表达明显低于
羟氯喹组(P<005)。结论:养阴益气活血煎剂能下调干燥综合征NOD小鼠颌下腺Fas,FasL及其mRNA的表达,且与羟氯喹
合用效果较好。养阴益气活血煎剂可能通过减少Fas/FasL调控的细胞凋亡达到治疗SS的作用。
[关键词] 干燥综合征;NOD小鼠;养阴益气活血中药;Fas/FasL
[收稿日期] 20130822
[基金项目] 浙江省教育厅课题(Y201223940)
[通信作者] 李天一,副教授,Tel:(0571)87236341,Email:wu
guolin28@aliyuncom
  干燥综合征(Sjogren′ssyndrome,SS)是一种侵
犯唾液腺、泪腺等外分泌腺的慢性系统性自身免疫
性疾病。多见于40~50岁的女性,女性与男性比例
为9∶1[1]。临床主要表现为口干、眼干、关节酸痛、
便秘、皮肤干燥、鼻腔干燥等症状,严重者影响患者
生活质量。目前干燥综合征的病因和发病机制尚不
清楚。有研究[2]发现Fas/FasL在SS患者唇腺组织
细胞和导管上皮内大量表达,浸润的淋巴细胞内很
少表达FasL。提示Fas/FasL在SS唇腺腺胞及导管
上皮细胞内的异常表达可能是 SS患者唾液腺破坏
的一个重要机制。通过前期临床研究观察,运用中
药养阴益气活血中药配合西药治疗 SS疗效确
切[34]。动物实验研究表明,其具有改善 NOD小鼠
唾液分泌量、减少饮水量以及改善小鼠颌下腺淋巴
病理浸润的作用[5],同时能调节小鼠血清和颌下腺
Th1型细胞因子TNFα和 Th2型细胞因子 IL1β水
平[6]。为此,通过研究中药养阴益气活血煎剂对干
燥综合征NOD小鼠颌下腺组织 Fas,FasL蛋白及其
mRNA表达的影响,以进一步明确其治疗干燥综合
征的可能机制。
1 材料
11 动物 选择 NOD小鼠32只及 Balb/C小鼠8
只,8周龄,雌性,均为SPF级,于无特殊病菌的恒温
恒湿度条件下喂养。实验动物均由上海斯莱克动物
实验中心提供,动物合格证号2007000512526。
12 药品 中药养阴益气活血煎剂(由太子参24
g、白芍15g、玉竹12g、五味子10g、黄精15g、乌梅
10g、红景天15g、肿节风12g、青蒿15g、桑椹12g
等中药组成),所有中药饮片均购于浙江大学医学
院附属第一医院中药房,由浙江中医药大学中药实
验室煎制浓缩而成。制备方法:将药物按组方比例
混合,装入三角烧瓶中,加10倍量水浸泡1h,电磁
炉加热煮沸后,改用文火煎煮2h,过滤药液;药渣再
加8倍量水煮沸1h,药渣共煎煮2次,合并3次滤
液,浓缩成质量浓度为6g·mL-1的药液,4℃冰箱
保存备用。硫酸羟氯喹片(上海中西制药有限公
司,批号091008),用蒸馏水稀释成含生药量3g·
L-1。
13 试剂 兔抗鼠 Fas,FasL多克隆抗体(一抗)
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(美国SantaCruz公司);Sp9001(北京中杉金桥分
装Zymed,18mL,批号861208);Pv9003(北京中杉
金桥分装 Zymed,3mL,批号861129);Fas,FasL原
位杂交检测试剂盒(武汉博士德公司);原位杂交检
测试剂盒(武汉博士德公司);原位杂交专用 PBS
(武汉博士德公司);反转录试剂盒(TAKARA公
司)。
2 方法
21 动物分组 将32只NOD小鼠随机分为4组,
即模型组、中药组、羟氯喹组、中西药组,每组8只。
Balb/C小鼠8只做为正常对照组。实验动物均喂
养于无特殊病菌的恒温恒湿度条件下,饮水瓶给水。
22 给药方法 对照组和模型组每天正常饲养。
各给药组在正常饲养基础上,于实验开始后每天定
时给药1次,给药量按动物与人等效剂量换算表计
算(相当于临床人用药剂量9倍)。中药组每天按
照100g·kg-1剂量分别灌胃养阴益气活血煎剂04
mL。羟氯喹组每天按照60mg·kg-1剂量灌胃羟氯
喹片稀释液04mL;中西药组每天分别灌胃中药+
羟氯喹(养阴益气活血煎剂50g·kg-1+羟氯喹60
mg·kg-1)04mL。实验进行8周后处死小鼠,解
剖摘取双侧颌下腺进行指标检测。实验至第2周,
中药组有1只小鼠死亡,经解剖后发现是因灌胃不
当引起食管损伤而死。
23 免疫组化法检测小鼠颌下腺组织 Fas,FasL含
量 动物给药喂养8周后,处死后摘取双侧颌下腺
组织,采用免疫组化 SP法检测小鼠颌下腺组织
Fas,FasL含量,具体步骤严格按照说明书操作。采
用多功能真彩色细胞图象分析管理系统进行图像分
析,选取400倍图像,细胞质或胞膜着棕黄色为阳性
表达细胞。选择有意义的组织相,经登录、编号、采
集、分析、读取数据。随机选取5个视野进行平均吸
光度测定,取其平均值作为该切片的代表值进行统
计分析。
24 RealtimePCR法检测小鼠颌下腺组织 Fas,
FasLmRNA的表达 以 GAPDH为内参,实验过程
按试剂盒说明书进行,具体步骤如下:用 Trisol试剂
盒提取颌下腺总 RNA,取1μL进行 RTPCR分析。
Fas引物序列为上游 5′AGGCCGCCCGCTGTTTTC
3′,下游5′ACGAACCCGCCTCCTCAGC3′,产物长度
145bp,Tm值60;FasL引物序列为上游5′GCCGC
CACTGACCCCTCTAA3′,下游 5′CCACACTCCTCG
GCTCTTTT3′,产物长度242bp,Tm值60;GAPDH
引物序列为上游 5′AAATGGTGAAGGTCGGTGTG
3′,下游 5′TGAAGGGGTCGTTGATGG3′,产物长度
108bp,Tm值60。PCR反应参数为94℃ 5min,再
将反应条件变为94℃15s,60℃45s,循环扩增40
次。60℃检测荧光值。
Fas,FasL及内参 GAPDH分别在2个管中同时
进行反应,除探针和引物外,2管中加入的 RNA模
板和其他反应试剂均一致。通过 ABI7500定量
PCR仪器取其循环阈值均值(Ct值),描述各组基因
的扩增曲线和溶解曲线。结果采用相对定量分析
法[7]:2ΔΔCt法进行计算 mRNA相对表达量,以各组
ΔCt值进行统计学分析,同时本实验以模型组做为
未处理组,与其他各组进行对照比较。
ΔCt=实验组目的基因 Ct值该组内参基因 Ct
值,ΔΔCt=实验组(目的基因 Ct内参基因 Ct)模型
组(目的基因 Ct内参基因 Ct),ΔCt值越小表示
Fas,FasLmRNA在颌下腺组织中的表达越高,而
2-ΔΔCt值越高,表明样本中 Fas,FasLmRNA相对于
模型组表达量越大。
本实验结果显示,所有样本中 Fas,FasLmRNA
显示呈指数增长,并达到平台期,扩增效率较高。荧
光定量 Fas及 FasLmRNAPCR产物的熔解曲线表
现为单一的峰值,表明扩增产物单一,避免了检测过
程中假阳性结果。
25 统计学分析 实验数据用 SPSS150软件进
行统计分析。计量资料采用 珋x±s表达,组间比较采
用OneWayANOVA检验方法,结果以 P<005为
差异有统计学意义。
3 结果
31 各组小鼠颌下腺组织 Fas,FasL蛋白表达比较
 免疫组织化学阳性染色显示 Fas,FasL表达呈棕
黄色颗粒。对照组小鼠颌下腺组织偶见 Fas,FasL
表达,模型组小鼠颌下腺细胞质和细胞膜,及导管上
皮可见较多的 Fas和 FasL蛋白表达。各给药组小
鼠颌下腺组织细胞质、细胞膜、导管上皮等可见部分
散在Fas和FasL蛋白表达,明显少于模型组。各组
小鼠颌下腺组织 Fas,FasL平均吸光度比较见表1。
模型组小鼠颌下腺组织 Fas以及 FasL蛋白表达均
高于其他各组(P<005)。对照组 FasL表达与羟
氯喹组相比,统计有显著性差异(P<005);而与中
药组、中西药组相比无显著性差异。
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表1 各组小鼠颌下腺组织Fas,FasL平均吸光度比较(珋x±s)
Table1 ComparisonofmeanopticaldensitiesofFasandFasL
insubmandibularglandsofeachgroupmice(珋x±s)
组别 n Fas FasL
对照  8 0110±00622) 0100±00412)
模型  8 0450±01511) 0563±01921)
中药  7 0150±00652) 0154±00812)
羟氯喹 8 0200±00762) 0288±01361,2)
中西药 8 0131±00592) 0169±00802)
  注:与对照组比较1)P<005;与模型组相比2)P<005(表2同)。
32 养阴益气活血方药对 NOD小鼠颌下腺组织
Fas,FasLmRNA表达的影响 模型组小鼠颌下腺组
织 FasmRNA相对表达量均高于其他各组(P<
005);对照组明显低于其他各组,具有显著性差异
(P<005),见表2。模型组小鼠颌下腺组织 FasL
mRNA表达均高于其他组,与中药组、中西药相比具
有显著性差异(P<005);对照组明显低于其他各
组,相比统计具有显著性差异(P<005);中西药组
表达明显低于羟氯喹组(P<005),见表3。
表2 各组小鼠颌下腺组织FasmRNA相对表达量比较(珋x±s)
Table2 ComparisonofrelativeFasmRNAexpressioninsub
mandibularglandsofeachgroupmice(珋x±s)
组别 n ΔCt ΔΔCt 2-ΔΔCt
对照  8 1576±1262) 976±177 0001
模型  8 695±1251) 000±168 100
中药  7 1270±2221,2) 557±255 0021
羟氯喹 8 1154±1281,2) 459±179 0042
中西药 8 1361±1991,2) 666±235 0010
表3 各组小鼠颌下腺组织 FasLmRNA相对表达量比较
(珋x±s)
Table3ComparisonofrelativeFasLmRNAexpressioninsub
mandibularglandsofeachgroupmice(珋x±s)
组别 n ΔCt ΔΔCt 2-ΔΔCt
对照  8 1972±1672) 946±198 0001
模型  8 1026±1071) 000±151 1000
中药  7 1458±2581,2) 432±279 0050
羟氯喹 8 1183±2131) 157±238 0337
中西药 8 1655±3361,2,3) 629±353 0013
  注:与对照组比较1)P<005;与模型组相比2)P<005;与羟氯
喹组相比3)P<005。
4 讨论
Fas系统是目前研究较为深入的一类与细胞凋
亡(apoptosis,APO)有关的基因。Fas/FasL作为介
导细胞凋亡的一对蛋白质,是调控细胞凋亡的重要
因子,在人体细胞凋亡、免疫赦免、维护机体稳态平
衡有重要的生理功能[8]。研究显示[9]pSS患者唇腺
腺泡上皮细胞(AEC)和导管上皮细胞(DEC)细胞
凋亡率及Fas/FasL蛋白表达较正常人显著升高,且
二者呈正相关,提示唇腺组织细胞凋亡可能是 Fas/
FasL途径介导的。Saegusa[10]发现在原发性干燥综
合征动物模型中,唾液腺组织CD4(+)T细胞浸润,
出现很大比率 Fas配体,唾液腺导管上皮细胞不断
的产生Fas。均提示Fas/FasL途径介导的细胞凋亡
可能是pSS唇腺组织功能失调的原因之一。
目前SS治疗方法主要是采取措施改善症状,控
制和延缓病情进展,根据病情进行局部治疗或系统
治疗,而中医药配合西药在治疗SS方面有一定的优
势,取得了较好临床疗效。在长期的临床观察中发
现,SS患者辩证以气阴两虚兼有血瘀为多见,故运
用养阴、益气、活血的方法治疗 SS与之相应。中药
养阴益气活血方具有滋肾养阴、益气生津、活血化瘀
之功,有效针对阴虚气虚兼血瘀病机,达到治疗 SS
之目的。临床运用中西医结合治疗后,患者临床症
状明显缓解,同时改善 SS患者机体的细胞免疫、体
液免疫以及炎症过程,减轻自身免疫性炎症,有效缓
解SS的病情[3]。通过临床研究发现,本方药还能
改善SS患者生活质量和整体状况[4]。故有必要更
深入研究其具体作用机制。
本研究结果显示,模型组小鼠颌下腺组织 Fas
以及FasL蛋白表达均高于其他各组,提示 SS颌下
腺组织存在 Fas及 FasL的高表达,促进细胞凋亡,
导致淋巴细胞浸润而使颌下腺受损而发病,说明细
胞凋亡在SS发病中有一定的作用。正常组FasL表
达明显低于羟氯喹组;而与中药组、中西药组相比无
显著性差异。表明中药养阴益气活血方药能降低干
燥综合征 NOD小鼠颌下腺组织 Fas,FasL蛋白表
达。模型组小鼠颌下腺组织 FasLmRNA表达均高
于对照组、中药组、中西药组;中西药组表达明显低
于羟氯喹组。提示中药养阴益气活血煎剂和羟氯喹
均能够降低NOD小鼠颌下腺组织 Fas,FasLmRNA
的表达,中药与羟氯喹合用效果更好。说明中药养
阴益气活血煎剂可能通过下调干燥综合征 NOD小
鼠颌下腺组织 Fas,FasL及其 mRNA表达来调节细
胞凋亡,从而改善颌下腺组织的损害,达到有效
治疗。
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EfectofnourishingYin,strengtheningQiandactivatingblooddecoctionon
Fas/FasLinsalivaryglandsofNODmicewithsjogren′ssyndrome
andtheirmRNAexpression
WUGuolin1,LITianyi2,LUWenwen1,YUGuoyou1,FANYongsheng2
(1FirstAfiliatedHospital,MedicalColege,ZhejiangUniversity,Hangzhou310003,China;
2ZhejiangChineseMedicineUniversity,Hangzhou310053,China)
[Abstract] Objective:ToobservetheefectofnourishingYin,strengtheningQiandactivatingblooddecoctiononFas/FasLin
salivaryglandsofNODmicewithSjogren′ssyndromeandtheirmRNAexpressionMethod:ThirtytwoNODmicewererandomlydi
videdintothemodelgroup,thetraditionalChinesemedicinegroup(TCMgroup,oralygiven04mLnourishingYin,strengtheningQi
andactivatingblooddecoctionasper100g·kg-1everyday),thehydroxychloroquinegroup(given04mLhydroxychloroquineasper
60mg·kg-1everyday),thetraditionalChinesemedicineandwesternmedicinegroup(TCMWMgroup,givennourishingYin,
StrengtheningQiandactivatingblooddecoction50g·kg-1andhydroxychloroquine60mg·kg-1,04mLeveryday),witheightmice
ineachgroupEightBalb/Cmicewereselectedasthenormalcontrolgroup(normalgroup)Alofmicewerekiledaftereightweeks,
andtheirsubmaxilaryglandsweredissectedTheexpressionlevelsofFas/FasLwereexaminedbyimmunohistochemicalmethod,and
theFasLmRNAwasdetectedbyRTPCRResult:TheexpressionlevelsofFas/FasLinsalivaryglandsofthemodelgroupwerehigher
thanthatofothergroups(P<005)TheexpressionlevelofFasLofthenormalgroupwasmuchlowerthanthatinthehydroxychloro
quinegroup(P<005)TherelativeexpressionlevelofFasmRNAinsalivaryglandsofthemodelgroupwashigherthanthatinother
groups,butthecontrolgroupwasnotablylowerthanothergroups(P<005)TheexpressionlevelofFasLmRNAinsalivaryglands
ofthemodelgroupwashigherthanthatinTCMandTCMWMgroups(P<005)ButtheexpressionlevelinTCMWMgroupwasno
tablylowerthanthehydroxychloroquinegroup(P<005)Conclusion:ThenourishingYin,strengtheningQiandactivatingblood
decoctioncoulddownregulatetheexpressionlevelofFas/FasLinsalivaryglandsofNODmicewithSjogren′ssyndromeandtheir
mRNAexpression,andhadabetereficacyafterbeingcombinedwithhydroxychloroquineThenourishingYin,strengtheningQiand
activatingblooddecoctionmighttreattheSjogren′sSyndromebyreducingapoptosiswhichisregulatedbyFas/FasL
[Keywords] sjogren′ssyndrome;nonobesediabeticmouse;traditionalChinesemedicinefornourishingYin,strengtheningQi
andactivatingblood;Fas/FasL
doi:10.4268/cjcmm20132332 [责任编辑 张宁宁]
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