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Antitussive constituents of Disporum cantoniense

百尾参止咳活性成分研究



全 文 :百尾参止咳活性成分研究
甘秀海1,赵超2,梁志远1,龚小见2,陈华国2,周欣2
(1贵州师范学院 化学与生命科学学院,贵州 贵阳 550018;
2贵州师范大学 天然药物质量控制研究中心,贵州 贵阳 550001)
[摘要] 采用小鼠氨水引咳法研究百尾参Disporumcantoniense的止咳作用,利用各种现代色谱技术手段对止咳活性部位
进行化学成分分离与纯化,并根据化合物的理化性质和光谱数据鉴定结构。结果表明百尾参水提取物及乙醇提取物均有止
咳活性,而乙醇提取物高剂量组的止咳作用高于阳性对照;从乙醇提取物中首次分离并鉴定了8个化合物,分别为豆甾4烯
3酮(1),麦角甾5,7,22三烯3β醇(2),obtucarbamateA(3),obtucarbamateB(4),neotigogenin(5),偶氮2,2′双 [Z(2,3
二羟基4甲基5甲氧基)苯基乙烯](6),dimethyl{[carbonylbis(azanediyl)]bis(2methyl5,1phenylene)}dicarbamate(7),槲
皮素3OβD吡喃葡萄糖苷(8),活性跟踪显示化合物3,4,6具有止咳作用,其中化合物6的止咳作用与阳性对照相当。
[关键词] 百尾参;止咳活性;偶氮化合物;化学成分
[收稿日期] 20130731
[基金项目] 贵州省科学技术基金项目(黔科合 J字[2011]2314
号);贵州省普通高等学校特色重点实验室项目(黔教合 KY[2012]
005号);贵州省应用化学特色重点学科项目(黔教科研发[2012]442
号)
[通信作者] 周欣,教授,博士生导师,研究方向中药质量控制及
新药开发,Email:alice9800@sinacom
[作者简介] 甘秀海,副教授,研究方向中药有效成分及生物活性,
Email:gxh200719@163com
  百尾参为百合科Liliaceae万寿竹属植物万寿竹
Disporumcantoniense(Lour)Mer。其味甘、淡,性
平,具有润肺止咳、健脾消积的功效,可用于治疗虚
损咳喘、痰中带血、肠风下血、食积胀满等症[12]。百
尾参是苗族习用药材,是复方制剂咳速停系列药物
的主药。目前,关于百尾参的研究主要集中在栽培
方面[36],对其化学成分及生物活性研究较少[710]。
为了探究百尾参的止咳活性成分,采用小鼠氨水引
咳法首先研究了百尾参的止咳活性部位,其乙醇提
取物具有明显的止咳作用;其次对乙醇提取部位的
化学成分进行了系统的分离,从中分离鉴定了8个
化合物,分别为豆甾4烯3酮(1),麦角甾5,7,
22三烯3β醇(2),obtucarbamateA(3),obtucar
bamateB(4),neotigogenin(5),偶氮2,2′双 [Z
(2,3二羟基4甲基5甲氧基)苯基乙烯](6),
dimethyl{[carbonylbis(azanediyl)]bis(2methyl5,
1phenylene)}dicarbamate(7),槲皮素3OβD吡喃
葡萄糖苷(8),以上化合物均为首次从该植物中分
离得到;最后对分离得到的量大的化合物3,4及6
进行了活性测试,结果显示3个化合物均有止咳作
用,其中化合物6的止咳活性与阳性对照相当。
1 材料
昆明种小鼠(SPF级),雌雄对半,体重18~22
g,由长沙东创实验动物科技服务部提供,合格证号
SCXK(湘)20090012。
磷酸可待因口服液Ⅲ,香港万辉药业有限公司,
批号110401。乙醇为食用级,其余试剂均为分析纯
试剂,重庆川东化工(集团)有限公司化学试剂厂。
X4型熔点仪,温度未校正,北京泰克仪器有限
公司生产;ZF7三用紫外分析仪,购于巩义市予华仪
器有限责任公司;INOVO400MHz型核磁共振波谱
仪(TMS为内标),美国Varian公司生产,JEOLECX
500MHz型核磁共振波谱仪(TMS为内标),日本电
子株式会社生产;HP5973质谱仪,美国安捷伦公司
生产;柱色谱硅胶(200~300目)和薄层用硅胶
GF254,青岛海洋化工厂生产;SephadexLH20,购自
Pharmacia公司。
药材于2010年8月采自贵州省安顺市,原植物
经贵州师范学院朱富寿教授鉴定为百尾参
Dcantoniense,标本保存于贵州师范学院药用植物
研究所。
2 方法
21 提取物的制备
取上述2份百尾参药材粗粉各40g,精密称定,
分别加入8倍量食用乙醇、蒸馏水加热回流提取2
·9904·
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次,每次3h,合并2次滤液,减压浓缩至浸膏,精密
称定,计算各溶剂提取物得膏率:乙醇 57%,水
258%。
22 止咳活性研究[11]
取小鼠90只,雌雄各半,随机分成9组,即乙醇
提取物高、低剂量组,水提取物高、低剂量组(生药
量580,125g·kg-1),生理盐水对照组(空白对照
组),磷酸可待因口服液阳性对照组(3000mg·
kg-1),单体化合物3,4,6组(3000mg·kg-1),每
组10只。每天灌胃(ig)给药1次,给药体积按20
mL·kg-1,连续给药6d。末次给药1h后,利用氨
水气雾引咳法,用超生雾化器均匀地雾化浓氨水于
倒扣的500mL密闭玻璃钟罩内,然后迅速将小鼠放
入钟罩内,喷雾5s,观察记录小鼠的咳嗽潜伏期(从
放入开始至咳嗽的时间)和2min内咳嗽的次数。
结果以 珋x±s表示,实验数据采用 SPSS180统
计软件进行统计学处理,采用单因素方差分析,显著
性检验标准为P<005。
23 化学成分的提取分离
百尾参干燥根15kg粉碎后,用85%工业乙醇
加热回流提取3次,滤过,合并提取液,减压浓缩得
浸膏16kg,加入2倍量水分配,依次用醋酸乙酯、
正丁醇萃取,减压回收溶剂,得到醋酸乙酯萃取物
217g、正丁醇萃取物386g。醋酸乙酯萃取物经硅
胶柱色谱分离,以三氯甲烷甲醇(1∶0,20∶1,5∶1,
1∶1)梯度洗脱,得到Ⅰ~Ⅵ6个部分。第Ⅱ部分(56
g)经硅胶柱色谱分离,用石油醚醋酸乙酯(8∶1,
3∶1,1∶1)洗脱,得3个亚组分(Ⅱ1~Ⅱ3),Ⅱ1组
分经硅胶柱色谱分离,用石油醚丙酮(10∶1)洗脱,
再经重结晶纯化,得到化合物1(12mg),2(16mg);
组分Ⅱ3经硅胶柱色谱分离,以石油醚醋酸乙酯
(5∶1)洗脱,经石油醚醋酸乙酯重结晶得到化合物
3(158g),4(96g)。第Ⅲ部分(28g)经柱色谱分
离,用石油醚丙酮(5∶1)洗脱、再经重结晶纯化,得
到化合物5(16mg),6(14g)。第Ⅳ部分(29g)经
反复柱色谱分离,用三氯甲烷甲醇(10∶1)和石油
醚丙酮(3∶1)洗脱,再 SephadexLH20和重结晶纯
化得到化合物7(21mg)。正丁醇萃取物经硅胶柱
色谱分离,以三氯甲烷甲醇(10∶1,5∶1,1∶1)梯度
洗脱,得到A~D4个部分,B部分(65g)经反复柱
色谱分离,以三氯甲烷甲醇(5∶1)洗脱,再经Sepha
dexLH20及重结晶纯化,得到化合物8(18mg)。
3 结果与分析
31 百尾参提取物及单体化合物对氨水气雾致小
鼠咳嗽的影响
实验结果表明,阳性药物、水及食用乙醇提取物
高、低剂量组均有延长小鼠咳嗽潜伏期和减少小鼠
咳嗽次数的作用(P<005),均有止咳作用,其中乙
醇高剂量组能显著延长小鼠咳嗽潜伏期和减少小鼠
咳嗽次数(P<0001),高于阳性对照,说明乙醇提
取物具有明显的止咳作用。利用小鼠氨水引咳模型
对量大的3个化合物(3,4,6)的止咳活性进行测
试,结果表明 3个化合物均能够延长咳嗽潜伏期
(P<001),减少咳嗽次数(P<0001),显示了止
咳作用,其中化合物6的止咳活性与阳性对照相当。
结果见表1。
表1 各药物组对氨水所致小鼠咳嗽的影响(珋x±s,n=10)
Table1 Efectofdiferentdruggroupsoncoughofmicein
ducedbyammonia(珋x±s,n=10)
组别 剂量/mg·kg-1 咳嗽潜伏期/s 咳嗽次数
空白对照 - 2687±465 1178±116
阳性给药 3000 5102±5523) 496±0683)
乙醇高剂量 3310 6296±4183) 400±0633)
乙醇低剂量 714 4857±4963) 644±1021)
水高剂量 14743 4490±6302) 628±1883)
水低剂量 3286 4129±9451) 544±1113)
化合物3 3000 4474±6212) 540±1063)
化合物4 3000 4583±6002) 580±1893)
化合物6 3000 5231±8772) 491±1503)
  注:与空白对照组比较1)P<005,2)P<001,3)P<0001;剂量
按浸膏量计。
32 结构鉴定
化合物 1 白色粉末;mp99~101℃;EIMS
m/z(%)412(M+·),397,368,229,124(100),57,
43;1HNMR(CDCl3,400MHz)δ:572(1H,s,H4),
118(3H,s,19CH3),092(3H,d,J=64Hz,
21CH3),085(3H,d,J=72Hz,29CH3),084
(3H,d,J=72Hz,26CH3),081(3H,d,J=64
Hz,27CH3),071(3H,s,18CH3);
13 CNMR
(CDCl3,100MHz)δ:358(C1),336(C2),1995
(C3),1241(C4),1710(C5),327(C6),323
(C7),354(C8),540(C9),387(C10),211
(C11),401(C12),426(C13),560(C14),
238(C15),284(C16),561(C17),124(C
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18),175(C19),368(C20),189(C21),345
(C22),262(C23),458(C24),290(C25),
202(C26),186(C27),229(C28),121(C
29)。以上数据与文献[12]报道的豆甾4烯3酮
基本一致。
化合物2 白色晶体(石油醚丙酮);mp151~
152℃;EIMSm/z(%)396(M+·)(100),382,329,
255,69,55;1HNMR(CDCl3,400MHz)δ:562(1H,
m,H6),535(H,m,H7),512~524(2H,m,22,
H23),358(1H,m,H3),105(3H,d,J=68Hz,
21CH3),093(3H,s,19CH3),089(3H,d,J=70
Hz,28CH3),084(3H,d,J=70Hz,27CH3),082
(3H,d,J=68Hz,26CH3),065(3H,s,18
CH3);
13CNMR(CDCl3,100MHz)δ:388(C1),
322(C2),705(C3),406(C4),1400(C5),
1202(C6),1163(C7),1414(C8),462(C9),
377(C10),211(C11),398(C12),427(C
13),550(C14),232(C15),280(C16),560
(C17),121(C18),165(C19),408(C20),
214(C21),1355(C22),1322(C23),428(C
24),330(C25),200(C26),196(C27),178
(C28)。以上光谱数据与文献[13]报道的麦角甾
5,7,22三烯3β醇基本一致。
化合物3 无色针状晶体(石油醚醋酸乙酯);
mp176~178℃;EIMSm/z(%)238(M+·)(100),
206,191,179,147,77,59;1HNMR(DMSOd6,400
MHz)δ:955(1H,s,1′NH),882(1H,s,1″NH),
746(1H,s,H2),714(1H,d,J=80Hz,H6),
704(1H,d,J=80Hz,H5),362(6H,s,2′,2″
OCH3),209(3H,s,4CH3);
13CNMR(C5D5N,125
MHz)δ:1372(C1),1131(C2),1363(C3),
1235(C4),1295(C5),1138(C6),1540(C
2′),1535(C2″),503(2′OCH3),502(2″
OCH3),159(4CH3)。以上光谱数据与文献[14]
报道的obtucarbamateA基本一致。
化合物4 无色针状晶体(石油醚醋酸乙酯);
mp172~174℃;EIMSm/z(%)238(M+·),206,
174,147(100),77,59;1HNMR(DMSOd6,400
MHz)δ:892(2H,s,1′,1″NH),710(3H,s,H4~
6),361(6H,s,2′,2″OCH3),201(3H,s,
2CH3);
13CNMR(C5D5N,125MHz)δ:1367(C1,
3),1204(C2),1246(C4,6),1255(C5),1543
(C2′,2″),504(2′,2″OCH3),117(2CH3)。以上
光谱数据与文献[14]报道的 obtucarbamateB基本
一致。
化合物5 无色针状晶体(石油醚醋酸乙酯);
mp201~203℃;EIMSm/z(%)416(M+·),344,
302,287,273,139(100),115,69,41;1HNMR
(CDCl3,500MHz)δ:544(1H,brs,OH),449
(1H,m,H16),394(1H,dd,J=108,28Hz,H
26a),358(1H,brs,H3),328(1H,dd,J=108,
28Hz,H26b),109(3H,d,J=68Hz,27CH3),
101(3H,d,J=68Hz,21CH3),083(3H,s,19
CH3),077(3H,s,18CH3);
13CNMR(CD3COCD3,
125MHz)δ:370(C1),316(C2),714(C3),
383(C4),449(C5),287(C6),323(C7),
352(C8),544(C9),357(C10),211(C11),
402(C12),406(C13),564(C14),318(C
15),810(C16),621(C17),161(C18),125
(C19),422(C20),144(C21),1098(C22),
271(C23),258(C24),260(C25),652(C
26),166(C27)。以上碳谱数据与文献[15]报道
的neotigogenin基本一致,但该文献中缺 C27的数
据。因而结合文献[16],鉴定该化合物为neotigoge
nin。
化合物6 淡黄色粉末;mp307~309℃;EIMS
m/z(%)386(M+·),322,206,180,148(100),121,
77;1HNMR(C5D5N,500MHz)δ:978,924(各
2H,s,OH),838(2H,s,H6′),764(2H,d,J=86
Hz,H2),717(2H,d,J=86Hz,H1),366(3H,
s,OCH3),232(3H,s,CH3);
13CNMR(C5D5N,125
MHz)δ:1309(C1),1158(C2),1379(C1′),
1391(C2′),1538(C3′),1248(C4′),1555(C
5′),1152(C6′),518(OCH3),175(CH3)。以
上数据与文献[17]报道的偶氮2,2′双 [Z(2,3二
羟基4甲基5甲氧基)苯基乙烯]基本一致。
化合物7 白色粉末;mp230~232℃;EIMS
m/z(%)386(M+·),354,206,180(100),148,121,
77,59;1HNMR(DMSOd6,400MHz)δ:881(2H,
s,NHCONH),853(2H,s,NHCOO),752(2H,s,
H2,2′),714(2H,dd,J=84,20Hz,H6,6′),
706(2H,d,J=84Hz,H5,5′),364(6H,s,
OCH3),213(6H,s,7,7′CH3);
13CNMR(C5D5N,
125MHz)δ:1370(C1,1′),1148(C2,2′),1383
·1014·
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(C3,3′),1152(C4,4′),1308(C5,5′),1252
(C6,6′),176(CH37,7′),522(OCH3),1553
(NHCONH),1530(NHCOO)。结合文献[18]
鉴定该化合物为dimethyl{[carbonylbis(azanediyl)]
bis(2methyl5,1phenylene)}dicarbamate,其波谱数
据为首次报道。
化合物8 黄色粉末,Molish反应呈阳性,薄层
色谱喷AlCl3后荧光增强;ESIMSm/z4630[M-
H]-,4871[M+Na]+;1HNMR(DMSOd6,500
MHz)δ:1262(1H,s,5OH),756(1H,d,J=68
Hz,H6′),754(1H,s,H2′),68(1H,d,J=68
Hz,H5′),638(1H,d,J=23Hz,H8),617(1H,
d,J=23Hz,H6),544(1H,d,J=75Hz,H
1″);13CNMR(DMSOd6,125MHz)δ:1568(C2),
1338(C3),1780(C4),1617(C5),992(C6),
1646(C7),940(C8),1567(C9),1045
(C10),1217(C1′),1157(C2′),1453(C3′),
1490(C4′),1167(C5′),1221(C6′),1013
(GluC1),746(GluC2),770(GluC3),704
(GluC4),781(GluC5),615(GluC6)。以上
波谱数据与文献[19]报道的槲皮素3OβD吡喃
葡萄糖苷基本一致。
[致谢] 贵州省、中国科学院天然产物化学重点实验
室的张建新副研究员和王道平副研究员在化合物波谱数据
测定方面提供了帮助。
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第38卷第23期
2013年12月
                             
Vol38,Issue 23
December,2013
AntitussiveconstituentsofDisporumcantoniense
GANXiuhai1,ZHAOChao2,LIANGZhiyuan1,GONGXiaojian2,CHENHuaguo2,ZHOUXin2
(1TheSchoolofChemistryandLifeScience,GuizhouNormalColege,Guiyang550018,China;
2TheResearchCenterforQualityControlofNaturalMedicine,GuizhouNormalUniversity,Guiyang550001,China)
[Abstract] TheantitussiveactivityassayfortherootextractionofDisporumcantoniensewascariedoutwithcoughingmicein
ducedbyammonialiquor.TheresultsshowedthattheethanolandwaterextractionsofD.cantoniensepossessstrongantitussiveactivi
ty,andthehighdoseoftheformerwasbeterthanpositivecontrol,andthentheconstituentsoftheethanolextractionwereseparated
andpurifiedbyvariousmodernchromatographictechniques.Theirstructureswereidentifiedbyphysicochemicalpropertiesandspec
troscopicdata.Asaresult,eightcompoundswereisolatedandidentifiedasstigmast4en3one(1),(22E,24R)ergosta5,7,22
trien3βol(2),obtucarbamateA(3),obtucarbamateB(4),neotigogenin(5),azo2,2′bis[Z(2,3dihydroxy4methyl5methoxy)
phenylethylene](6),dimethyl{[carbonylbis(azanediyl)]bis(2methyl5,1phenylene)}dicarbamate(7),andquercetin3OβD
glucopyranoside(8).Alcompoundswereisolatedfromthisplantforthefirsttime,andtheresultofbioactivitydirectedisolation
showedthatcompounds3,4,and6hadobviousefectonantitussiveactivity,andcompound6hadthesamelevelaspositivecontrol.
[Keywords] Disporumcantoniense;antitussiveactivity;azotypecompounds;chemicalconstituents
doi:10.4268/cjcmm20132322
[责任编辑 孔晶晶]
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第38卷第23期
2013年12月
                             
Vol38,Issue 23
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