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Expression of tissue transglutaminase on renal interstitial fibrosis rats and  intervention of GBE

银杏叶对大鼠肾脏中组织型转谷氨酰胺酶的表达及干预作用


目的:探讨组织型转谷氨酰胺酶(tTG)在单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾间质中的表达及银杏叶(GBE)对其表达的影响。方法:采用左侧输尿管结扎术复制肾间质纤维化模型,将雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、贝那普利(15 mg·kg-1)治疗组及银杏叶(300 mg·kg-1)治疗组。术后第14天处死各组大鼠,取左肾进行HE和Masson染色,观察肾间质纤维化病变;免疫组化法检测肾间质中纤维连接蛋白(FN)和tTG的表达;RT-PCR检测tTG mRNA表达。结果:模型组FN和tTG的表达明显高于假手术组(P<0.01);贝那普利组和银杏叶组治疗后二者显著低于模型组(P<0.05)。结论:贝那普利及银杏叶制剂可能通过下调tTG而减轻肾间质纤维化。

Objective: To investigate the expression of tissue transglutaminase(tTG)  in unilateral ureteral obstruction (UUO) rats and the intervention of Folium Ginkgo(GBE).  Method: The animal models of unilateral ureteral obstruction (UUO) were used. Wistar rats were randomly divided into four groups, the Sham-operated group, the UUO group, the benazepril (Bena)-treated UUO group and the GBE-treated group. The rats were sacrificed at day 14. Histological changes in renal tubular interstitium were observed with HE and Masson staining, and the mRNA and protein levels of tTG and FN were detected by RT-PCR and immunohistochemistry.  Result: Compared with the sham group, the expression of tTG and FN were significantly increased (P<0.01), and decreased after been treated by Bena and GBE (P<0.05).  Conclusion: Bena and GBE may suppress the development of fibrosis partially via down-regulation of tTG expression.


全 文 :银杏叶对大鼠肾脏中组织型转谷氨酰胺酶的
表达及干预作用
王 丹1,2,李相军1,于晓艳1,石 艳1,尹 俐1
(1.吉林大学 药学院,吉林 长春 130021;
2.北华大学 基础医学院,吉林 吉林 132001)
[摘要] 目的:探讨组织型转谷氨酰胺酶(tTG)在单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾间质中的表达及银杏叶(GBE)对其表
达的影响。方法:采用左侧输尿管结扎术复制肾间质纤维化模型,将雄性 Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、贝那普利
(15mg·kg-1)治疗组及银杏叶(300mg·kg-1)治疗组。术后第14天处死各组大鼠,取左肾进行HE和Masson染色,观察肾
间质纤维化病变;免疫组化法检测肾间质中纤维连接蛋白(FN)和 tTG的表达;RTPCR检测 tTGmRNA表达。结果:模型组
FN和tTG的表达明显高于假手术组(P<001);贝那普利组和银杏叶组治疗后二者显著低于模型组(P<005)。结论:贝那
普利及银杏叶制剂可能通过下调tTG而减轻肾间质纤维化。
[关键词] 组织型转谷氨酰胺酶;UUO;纤维化
[收稿日期] 20080927
[基金项目] 教育部博士点基金新教师项目(20070183059);吉林省
科技发展计划项目(20080141);吉林大学大学生创新性实验计划
[通信作者] 李相军,Tel:(0431)85619702,Email:lxj@jlu.edu.cn
[作者简介] 王丹,在读医学博士,主要从事肾脏病理学研究
  细胞外基质(extracelularmatrix,ECM)的合成
和降解失衡是肾间质纤维化病理特征之一。组织型
转谷酰胺酶(tissuetransglutaminase,tTG),是一类
Ca2+依赖的具有酰胺基作用的翻译后修饰酶,可使
细胞外包括纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)、层黏蛋
白(laminin,LN)和胶原在内的大部分 ECM蛋白成
分之间形成异肽键而交联,这种键是一种稳定的共
价键,可以抵抗蛋白酶降解[1],从而导致ECM堆积,
参与肾间质纤维化的发生。本课题采用单侧输尿管
结扎(unilateralureteralobstruction,UUO)大鼠模型,
观察肾组织内tTG的表达及其与细胞外基质成分的
关系,并阐明银杏叶提取物(ginkgobiobaextract,
GBE)的干预作用。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂 免疫组织化学 SP试剂盒(批号
457501A)和DAB显色剂为北京中杉金桥生物工程
公司产品,银杏叶片(批号20031209)为贵州信邦制
药股份有限公司产品,逆转录酶 SuperScriptⅡ购自
Invitrogen公司,TaqDNA聚合酶购自北京鼎国生物
技术公司,DNAMarkerDL2000为 Takara产品,
PCR引物由上海生工生物技术公司合成,小鼠抗大
鼠FN单克隆抗体、小鼠抗大鼠 tTG单克隆抗体为
LabVision公司产品。
1.2 动物模型复制与分组 雄性 Wistar大鼠 24
只,体重200~220g,由吉林大学实验动物中心提供
(动物合格证号 SCXK(吉)2007-0003),分为假手
术组、模型组、贝那普利治疗组及银杏叶治疗组。每
组6只。适应性饲养7d后,禁食12h。
模型组大鼠行左侧输尿管结扎术[2]。主要步
骤如下:10%水合氯醛2mL·kg-1腹腔麻醉大鼠,
无菌条件下行腹正中偏左纵向切口约2cm进入腹
腔,游离左侧输尿管,在靠近肾门处及输尿管下段分
别结扎,并从中间剪断输尿管,逐层缝合腹壁及皮
肤。假手术组大鼠只分离但不结扎和剪断输尿管即
逐层缝合皮肤。造模后第 2天起银杏叶组以 300
mg·kg-1体重(以总黄酮醇苷计)银杏叶片悬液灌
胃,每日1次;贝那普利治疗组以15mg·kg-1体重
盐酸贝那普利片混悬液灌胃,每日1次;模型组和假
手术组给予等量生理盐水灌胃,每日1次。在结扎
后的第14天处死各组大鼠,左侧肾脏一部分用4%
多聚甲醛固定,用于 Masson和免疫组化染色,另一
部分在液氮中保存以用来提取mRNA。
1.3 肾组织形态学观察 常规制备石蜡切片,进行
HE及Masson三色染色,光镜下观察肾脏形态改变。
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Masson三色染色定量分析,每例Masson染色切片观
察10个不含肾小球皮质区视野,借助病理图像分析
系统,计算每例切片肾间质Masson染色阳性面积占
整个视野百分比,定量分析肾间质纤维化程度[3]。
1.4 RTPCR检测 将肾组织经研磨器研磨后,
TRIzol提取肾皮质总RNA每毫升TRIzol加50~100
mg组织匀浆后移入 Eppendorf管,室温静止孵育5
min后加入02mL氯仿,强力振动15秒,室温孵育
2~3min。12000×g离心15min(2~8℃)。离心
后分为两层(酚、水相),将上清(水相)移入新管。
每管加 05mL异丙醇,室温 10min沉淀 RNA。
12000×g离心10min(2~8℃)后,RNA表现为凝
胶样小丸于管底。去除上清,加至少1mL75%乙
醇。漩涡振荡后7500×g离心 5min。干燥 RNA,
加入20μLDEPC处理水。用紫外分光光度计分别
测260nm和280nm的紫外吸光度(A),重复测定3
次。计算A260/A280,该比值 >18时,说明所提取的
RNA纯度高,可用于逆转录。按逆转录试剂盒操作
说明将RNA逆转录为 cDNA,进行 PCR扩增。tTG
引物序列:上游 5′GGCAATGACTTTGACGTGTTTG
3′;下游5′ATACAGGGAATCAGAAAGTGGGTTC3′,
扩 增 产 物 片 段 长 396 bp[4]。 GAPDH (gi:
113422088)引物序列:上游5′ACCACAGTCCATGC
CATCAC3′,下 游 5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA
3′,扩增产物片段长度450bp。取 PCR产物经2%
琼脂糖凝胶电泳,并用凝胶成像分析软件进行吸光
度分析,以 GAPDH吸光度作为参考定量标准,用
tTG产物吸光度与 GAPDH条带吸光度之比表示
tTG的相对表达量。
1.5 免疫组织化学检测 操作步骤按SP免疫组化
试剂盒说明书进行。石蜡切片常规脱蜡至水,用
1%H2O2灭活内源性过氧化物酶,于枸橼酸盐缓冲
液中微波修复抗原并冷却后,用01mol·L-1PBS
洗1~2次,正常山羊血清封闭非特异性抗原,滴加
适当稀释的特异性一抗(小鼠抗大鼠 FN单克隆抗
体或小鼠抗大鼠 tTG单克隆抗体,稀释比例为 1∶
300),4℃过夜。滴加 HRP标记的山羊抗小鼠,室
温孵育40min后,于辣根过氧化物酶(SA/HRP)工
作液中室温孵育20min,PBS充分洗涤后用二氨基
联苯胺双氧水(DABH2O2)显色。切片经苏木素复
染后,常规脱水、透明、封片。显微镜下观察,棕褐色
细颗粒为阳性表达。根据文献方法[3],用 ImagePro
彩色病理图像分析软件进行分析 FN和 tTG表达情
况。计算每例切片20个不重叠的200倍视野中,阳
性染色面积与视野内肾小管间质总面积(去除肾小
管管腔)的比值并取平均值。
1.6 统计学处理 所有计量数据以 珋x±s表示,采
用SPSS110软件进行统计学分析,组间比较采用
单因素ANVOA分析,组间两两比较采用最小显著
差法(LSD)。
2 结果
2.1 形态学染色结果判定 同假手术组相比,模型
组大鼠肾小管间质增宽,炎细胞浸润,纤维组织增
多,肾小管明显扩张,上皮细胞肿胀、变性。银杏叶
组及贝那普利组大鼠肾脏病变较模型组明显减轻,
间质纤维增生不明显,肾小管上皮细胞结构未见明
显改变。Masson三色染色可将胶原纤维染成蓝色,
镜检可见假手术组大鼠肾脏胶原染色主要位于肾小
管基底膜、系膜区,而小管间质染色较少。与假手术
组比较模型组大鼠肾脏胶原染色明显增多,且主要
分布在增宽的肾间质,差异具有显著性(P<001);
银杏叶治疗组及贝那普利治疗组与模型组比较,间
质胶原成分明显减少(P<001),见表1。
表1 各组大鼠肾组织纤维化程度比较(珋x±s,n=6)
组别 剂量/mg·kg-1 阳性面积/%
假手术  - 161±12
模型   - 290±181)
贝那普利 15 177±192)
银杏叶  300 209±142)
  注:与假手术组比较 1)P<001;与模型组比较2)P<001。
2.2 tTGmRNA表达 与假手术组比较,模型组
tTGmRNA表达水平明显增加(P<001);银杏叶治
疗组大鼠 tTGmRNA表达水平明显低于模型组
(P<001);贝那普利治疗组大鼠 tTGmRNA表达
亦明显低于模型组(P<005),见图1。
2.3 免疫组织化学结果 假手术组大鼠肾脏 FN
表达量极低,仅肾小球基底膜有少量表达,模型组大
鼠肾间质FN表达明显增多,与假手术组比较,差异
具有显著性(P<001),贝那普利治疗组和银杏叶
治疗组FN表达量较模型组明显下降,差异具有显
著性(P<005)。
tTG在正常肾间质中有少量表达,呈弱阳性。
模型组大鼠肾间质 tTG表达明显高于假手术组,差
异具有显著性,P<001;贝那普利治疗组大鼠肾间
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1.假手术组;2.模型组;3.贝那普利治疗组;4.银杏叶治疗组
与假手术组比较P<001;与模型组比较△P<005,△△P<001。
图1 UUO术后各组大鼠tTGmRNA的表达
质tTG表达量则明显低于模型组大鼠(P<001),
银杏叶治疗组也呈现相同趋势,与模型组大鼠比较,
tTG表达量明显降低(P<005)(表2)。
表2 各组大鼠tTG,FN表达比较(珋x±s,n=6) % 
组别
剂量
/mg·kg-1
tTG FN
假手术  - 1324±311 624±140
模型   - 2547±3751) 2260±2841)
贝那普利 15 1532±4873) 1760±1322)
银杏叶  300 1831±7562) 1491±2832)
  注:与假手术组比较1)P<001;与模型组比较2)P<005,P<
001。
3 讨论
tTG属于转谷氨酰胺酶家族,是一个能通过催
化蛋白质谷氨酰胺残基与赖氨酸残基间的转谷氨酰
胺反应使蛋白质发生交联的酶,tTG作为一种多功
能的蛋白质在人体内起着相当广泛的作用,许多生
理和病理过程都包含了 tTG的作用,一般情况下
tTG分布在胞浆内,没有活性[5]。病理情况下细胞
合成tTG增多并释放到细胞外,被激活后发挥使基
质蛋白交联的作用。Skil等[6]在糖尿病肾病大鼠模
型中研究了tTG及其产物的变化,结果显示与肾间
质纤维化模型中相似,ε(γ谷氨酰胺)赖氨酸交联
产物的水平有明显增加;主要分布在肾小管间质周
围细胞外区和个别肾小球;对肾小球的进一步研究
发现其中tTG和其产物有平行的明显增加,并且基
质性质已经发生了变化。Johnson等[78]发现慢性肾
脏疾病和肾移植患者的肾脏病理标本中 ε(γ谷氨
酰胺)赖氨酸交联产物及 tTG水平明显增加,并且
和肾间质纤维化程度呈显著正相关。Johnson等[9]
发现细胞内可溶性tTG的增多可引起一种新型的细
胞死亡方式,这种细胞死亡可能导致肾小管上皮细
胞的减少,而小管间质中不溶性 tTG的增多可能是
从细胞中释放出来的tTG尚未连接到其底物上。本
研究发现,UUO2周后,大鼠肾间质tTGmRNA及蛋
白表达均明显增加,免疫组化结果显示 tTG在肾间
质中广泛表达,而经银杏叶治疗后 tTG表达量明显
下降,提示tTG在肾间质纤维化形成过程中可能起
重要作用。
研究表明 GBE对肝纤维化有一定的预防作
用[1011],有学者将其应用在肾脏缺血再灌注损伤及
中药肾脏毒性的实验研究中,发现GBE对肾脏功能
有明显保护作用[1213]。作者既往的研究结果也表
明,银杏叶制剂对UUO大鼠肾脏功能和结构具有明
显保护作用[14]。本研究中,银杏叶制剂可明显抑制
UUO大鼠梗阻侧肾脏组织中 FN蛋白表达水平,从
而延缓肾间质纤维化的发生发展。如前所述,tTG
增多并释放到细胞外被激活时,可促进基质蛋白交
联,减少其降解。作者应用 RTPCR及免疫组化技
术研究发现,银杏叶制剂可明显抑制 tTGmRNA及
蛋白水平,说明抑制 tTG转录及翻译,减少 tTG分
泌,加速ECM降解可能是银杏叶提取物防治肾间质
纤维化的机制之一。
[参考文献]
[1]  JohnsonTS,ElKoraieAF,SkilNJ,etal.Tissuetransglu
taminaseandtheprogressionofhumanrenalscaring[J].JAm
SocNephrol,2003,14(8):2052.
[2]  李 才.人类疾病动物模型的复制[M].北京:人民卫生出版
社,2008:320.
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Vol.34,Issue 9
  May,2009
[3]  左 川,谢席胜,邓 尧,等.黄芪对单侧输尿管梗阻大鼠肾
组织结缔组织生长因子表达的影响[J].中药材,2008,31
(8):1185.
[4]  刘亚红,程丽静,高政南.组织型转谷氨酰胺酶在糖尿病大鼠
肾组织中的表达及意义[J].中华肾脏病杂志,2006,22(9):
559.
[5]  GrifinM,CasadioR,BergaminiCM.Transglutaminases:na
ture'sbiologicalglues[J].JBiochem,2002,368(pt2):377.
[6]  SkilNJ,GrifinM,ElNahasAM,etal.Increasesinrenalep
silon(gglutamyl)Iysinecrosslinksresuitfromcompartmentspe
cificchangesintissuetransglutaminaseinearlyexperimentaldia
beticnephropathy:pathologicimplications[J].LabInvest,
2001,81(5):705.
[7]  JohnsonTS,ELKoraieAF,SkilNJ,etal.Tissuetransglu
taminaseandtheprogressionofhumanrenalscaring[J].JAm
SocNephol,2003,14(8):2052.
[8]  JohnsonTS,AbozenahH,SkilNJ,etal.Tissuetransglutami
nase:amediatorandpredictorofchronicalograftnephropathy
[J].Transplatation,2004,77(11):1667.
[9]  JohnsonTS,GrifinM,ThomasGL.Theroleoftransglutami
naseintheratsubtalnephrectomymodelofrenalfibrosis[J].J
ClinInvest,1997,99(12):2950.
[10] 罗燕军,于皆平,罗和生,等.银杏叶提取物对四氯化碳诱发
大鼠肝纤维化的预防作用[J].中华消化杂志,2004,24(5):
307.
[11] 刘 浩,于皆平,时昭红,等.银杏叶提取物对实验性大鼠肝
纤维化的预防作用[J].胃肠病学和肝病学杂志,2005,14
(5):476.
[12] 赵艳玲,王宗谦,冯江敏,等.银杏叶提取物对大鼠马兜铃酸
肾病纤维化相关免疫组化指标的影响[J].中国中西医结合
肾脏病杂志,2005,6(11):636.
[13] 刘晓刚,刘素雁,隋满姝.银杏叶提取物治疗实验性肾病综合
征的实验研究[J].中国中西结合肾病杂志,2006,7(4):205.
[14] 李相军,李 才,孙广东.银杏叶片对单侧输尿管梗阻大鼠肾
脏的保护作用[J].吉林大学学报:医学版,2007,33(1):29.
Expressionoftissuetransglutaminaseonrenalinterstitialfibrosisratsand
interventionofGBE
WANGDan1,2,LIXiangjun1,YUXiaoyan1,SHIYan1,YINLi1
(1.DepartmentofExperimentalPharmacologyandToxicology,SchoolofPharmacy,JilinUniversity,Changchun130021,China;
2.DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,BeihuaUniversity,Jilin132001,China)
[Abstract] Objective:Toinvestigatetheexpressionoftissuetransglutaminase(tTG)inunilateralureteralobstruction(UUO)
ratsandtheinterventionofFoliumGinkgo(GBE).Method:Theanimalmodelsofunilateralureteralobstruction(UUO)wereused.
Wistarratswererandomlydividedintofourgroups,theShamoperatedgroup,theUUOgroup,thebenazepril(Bena)treatedUUO
groupandtheGBEtreatedgroup.Theratsweresacrificedatday14.Histologicalchangesinrenaltubularinterstitiumwereobserved
withHEandMassonstaining,andthemRNAandproteinlevelsoftTGandFNweredetectedbyRTPCRandimmunohistochemistry.
Result:Comparedwiththeshamgroup,theexpressionoftTGandFNweresignificantlyincreased(P<001),anddecreasedafter
beentreatedbyBenaandGBE(P<005).Conclusion:BenaandGBEmaysuppressthedevelopmentoffibrosispartialyviadown
regulationoftTGexpression.
[Keywords] FoliumGinkgo;tissuetransglutaminase;UUO;fibrosis
[责任编辑 古云侠]
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