全 文 ：光叉叶委陵菜的酪氨酸酶抑制作用
朴香兰１，田燕泽，秘效媛１，２，崔箭
（１．中央民族大学 中国少数民族传统医学研究院，北京 １０００８１；
２．延边大学 药学院，吉林 延吉 １３３００２）
［摘要］　目的：快速鉴定光叉叶委陵菜Ｐｏｔｅｎｔｉｌａｂｉｆｕｒｃａｖａｒ．ｇｌａｂｒａｔａ中的酪氨酸酶抑制成分。方法：利用活性高效液相
色谱跟踪方法（ｂｉｏａｓｓａｙｌｉｎｋｅｄＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄ），通过接收器接样，并用酪氨酸酶抑制强度，快速查找有效成分。结果：光叉叶委
陵菜的甲醇提取物及其正丁醇萃取物显示较强的酪氨酸酶抑制作用。从光叉叶委陵菜的正丁醇萃取物中分离并鉴定一种黄
酮类化合物，即槲皮素４′ＯβＤ葡萄糖苷。与已知的酪氨酸酶抑制剂熊果苷（ａｒｂｕｔｉｎ，ＩＣ５０＝０２８ｍｍｏｌ·Ｌ
－１）相比，槲皮素
４′ＯβＤ葡萄糖苷化合物具有更强的酪氨酸酶抑制作用。其ＩＣ５０值为０００１９ｍｍｏｌ·Ｌ
－１。结论：该方法对中药及其复方药
快速确定有效成分提供分析手段。
［关键词］　光叉叶委陵菜；酪氨酸酶抑制作用；活性高效液相色谱跟踪方法；槲皮素４′ＯβＤ葡萄糖苷
［收稿日期］　２００８１０２９
［基金项目］　中国博士后科学基金（２００６０３９０３７３）；２００８年度中央
民族大学青年教师基金项目
［通信作者］　 崔箭，教授，主要研究民族医药。Ｔｅｌ：（０１０）
６８９３３２５４（８０５），Ｆａｘ：（０１０）６８９３３２５４（８０９），Ｅｍａｌ：ｘｌｐｉａｏ＠ｃｕｎ．ｅｄｕ．
ｃｎ
　　酪氨酸酶（ＥＣ１１４１８１）是黑色素形成过程
中主要的限速酶，该酶的活性大小决定着黑色素形
成的数量。黑色素细胞以酪氨酸为原料，主要在限
速酶酪氨酸酶的氧化作用下生成黑色素。首先，酪
氨酸在酪氨酸酶作用下被氧化成多巴，多巴又在酪
氨酸酶作用下被氧化成多巴醌，多巴醌经过多巴色
素二羟基吲哚酮式吲哚等一系列反应，最终形成
黑色素（优黑色素或真黑色素）［１］。成熟的黑色素
颗粒堆积在黑色素胞浆中，通过树状突起向同表皮
黑色素单位的角质形成细胞转运，在表皮角质形成
细胞中起着吸收紫外线和清除自由基的作用，为细
胞核 ＤＮＡ、真皮蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白提供保
护。最后在角质形成细胞溶酶体内降解，随表皮细
胞的脱落而排出。黑色素形成是决定哺乳动物皮肤
颜色的最重要因素，抑制黑色素的形成可减少皮肤
黑暗。酪氨酸酶抑制剂可具有潜在的治疗异常色素
紊乱，在化妆品行业可应用于皮肤美白添加剂。酪
氨酸酶抑制剂广泛用于皮肤美白剂，其中包括熊果
苷和曲酸［２３］。
目前，越来越多的中草药被用于皮肤美白剂原
料，如甘草根和桑树根。在寻找新的酪氨酸酶抑制
剂过程中［４５］，发现光叉叶委陵菜 Ｐｏｔｅｎｔｉｌａｂｉｆｕｒｃａ
的正丁醇萃取物具有较强的活性。光叉叶委陵菜为
蔷薇科委陵菜属多年生草本植物，生于草原、山坡、
沙地、河堤等处，极耐干旱。分布于东北、华北、西
北、华中地区。对其研究很少，因此，利用活性高效
液相色谱跟踪方（ｂｉｏａｓｓａｙｌｉｎｋｅｄＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄ），快
速分离、鉴定了酪氨酸酶抑制成分。
１　材料
光叉叶委陵菜采集于延边地区，由延边大学吕
惠子副教授鉴定为 Ｐｂｉｆｕｒｃａ，ＰＢ０２０１。熊果苷购
自Ｓｉｇｍａ（美国）公司，所有化学试剂均为分析纯，购
自北京化工厂（北京）。硅胶购自青岛海洋化工厂
分厂。核磁共振仪 Ａｖａｎｃｅ５００（德国），质谱 Ｊｅｏｌ
ＪＭＳ７００（日本）。分析与半制备 ＨＰＬＣ采用吉尔森
色谱仪（美国），配备了吉尔森泵３２１、吉尔森收集器
（ＦｉｌｓｏｎＦＣ２０４，美国）和吉尔森 ＵＶ／ＶＩＳ１５５检测
器，检测波长为２８０ｎｍ。半制备Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ色谱柱
（ＲＰ１８，４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ，美国）和 Ａｌｔｅｃｈ
柱（ＲＰ１８，１０ｍｍ×２５０ｍｍ，１０μｍ，美国）。酶标仪
使用ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ３４０ＰＣ（美国）。
２　方法
２．１　提取　取光叉叶委陵菜５００ｇ，用甲醇加热回
流３次，每次３ｈ。溶剂减压浓缩回收，制得甲醇提
取浸膏（９０ｇ）。其甲醇提取物用溶剂二氯甲烷和正
丁醇依次萃取，分别得到光叉叶委陵菜的二氯甲烷、
正丁醇、水萃取物。光叉叶委陵菜的溶剂萃取物对
酪氨酸酶抑制作用比较结果，正丁醇萃取物具有较
·２５９１·
第３４卷第１５期
２００９年８月
　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　１５
　Ａｕｇｕｓｔ，２００９
强的活性。于是，取上面萃取的光叉叶委陵菜正丁
醇萃取物，用制备型 ＴＬＣ方法，氯仿甲醇水
（７０∶３０∶４）溶剂系统展开，得到７个组分，其中，组
分１具有较强的酪氨酸酶抑制作用。
２．２　活性跟踪与有效成分的分离、鉴定　光叉叶委
陵菜正丁醇萃取物的组分１用甲醇溶剂配成１ｇ·
Ｌ－１，进样 ２５μＬ于分析柱。用乙腈（５％乙酸）与
５％乙酸水溶液梯度洗脱（０ｍｉｎ，２０％ ＣＨ３ＣＮ；８
ｍｉｎ，４０％ ＣＨ３ＣＮ；９ｍｉｎ，１００％ ＣＨ３ＣＮ；９～３０ｍｉｎ，
１００％ ＣＨ３ＣＮ）。流速为１ｍＬ·ｍｉｎ
－１。洗脱液用收
集器以３００μＬ／ｗｅｌ收集于９６孔板。每孔中的溶剂
用减压箱抽干，剩余的馏分用来检测酪氨酸酶抑制
活性。活性跟踪高效液相色谱显示在１２６ｍｉｎ出
现的峰可观察到较强的活性。这个化合物用半制备
柱在乙腈水（４０∶６０）条件进行分离。根据此化合物
的理化性质、波谱数据与文献基本一致，故鉴定为槲
皮素４′ＯβＤ葡萄糖苷［６］。
２．３　酪氨酸酶抑制活性　酪氨酸酶抑制活性是参
照前人文献［７］稍加修改后用光谱仪检测。４０μＬ酪
氨酸酶溶液的００６７ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸钾缓冲液（６０单
位／ｍＬ，ｐＨ６８），４０μＬ酪氨酸的００６７ｍｏｌ·Ｌ－１磷
酸钾缓冲液（ｐＨ６８），８０μＬ的００６７ｍｏｌ·Ｌ－１磷
酸钾缓冲液（ｐＨ６８）和４０μＬ的５％二甲亚砜溶液
加入９６孔板的每个孔中。对分离纯化的化合物的
酪氨酸酶抑制活性检测，用５％二甲基亚砜溶解的
样品溶液４０μＬ代替上面４０μＬ的５％二甲亚砜溶
液。在３７℃孵化３０ｍｉｎ。对于空白实验，用５％二
甲亚砜溶液代替样品溶液即可。孵化前后的反应混
合物所生成的色素量，用酶标仪在４７５ｎｍ波长处检
测。酪氨酸酶的抑制率计算公式如下：
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ＝（Ａ－Ｂ）－（Ｃ－Ｄ）Ａ－Ｂ ×％
Ａ是空白溶液孵育后的吸收度，Ｂ是空白溶液孵育前的
吸光度，Ｃ是样品溶液孵育后的吸收度，Ｄ是样品溶液孵化
前的吸收度。
２．４　统计分析　每组结果以（珋ｘ±ｓ）表示，控制组与
样品处理组间用 ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ软件，用 ｏｎｅｗａｙ
ＡＮＯＶＡ分析数据。Ｐ＜００５则可认为组间具有统
计学的显著差异。
３　结果
３．１　光叉叶委陵菜抑制酪氨酸酶的作用　光叉叶
委陵菜的甲醇提取物显示较强的酪氨酸酶抑制活
性。因此，溶剂萃取方法，对光叉叶委陵菜的甲醇提
取物进行萃取，得到其二氯甲烷、丁醇和水萃取物，
并检测它们的酪氨酸酶抑制活性。结果，光叉叶委
陵菜的甲醇提取物及其二氯甲烷、正丁醇萃取物均
呈浓度依赖性的活性增强（Ｐ＜００５）（图２），正丁
醇萃取物显示较强的抑制活性（Ｐ＜００５），在 ５０，
１００ｍｇ·Ｌ－１时抑制率９４５４％。因此，可以通过生
物活性高效液相色谱跟踪方法，快速寻找光叉叶委
陵菜中的酪氨酸酶抑制成分。图３显示了高效液相
色谱活性图谱，在 １２６ｍｉｎ洗脱下来的成分显示
最强的酪氨酸酯酶抑制活性。进一步使用半制备高
效液相色谱法，分离、纯化有效成分，并根据它的波
谱数据与相关文献对比，有效成分被鉴定为槲皮素
４′ＯβＤ葡萄糖苷［６］。
图２　光叉叶委陵菜各萃取物对酪氨酸酶的
抑制作用
图３　光叉叶委陵菜正丁醇萃取物组分１的高效液相
色谱图（Ａ）和活性分布图（Ｂ）
·３５９１·
第３４卷第１５期
２００９年８月
　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　１５
　Ａｕｇｕｓｔ，２００９
３．２　光叉叶委陵菜有效成分的酪氨酸酶抑制作用
　光叉叶委陵菜的有效成分槲皮素４′ＯβＤ葡萄
糖苷与已知酪氨酸酶抑制熊果苷相比，具有更强的
酪氨酸酶抑制活性。熊果苷的 ＩＣ５０为０２８ｍｍｏｌ·
Ｌ－１，而槲皮素４′ＯβＤ葡萄糖苷则为 ０００１９
ｍｍｏｌ·Ｌ－１。
４　讨论
在黑色素形成过程中酪氨酸酶是一个主要的限
速酶，根据中国中医古籍记载的有关治疗老年斑、雀
斑、改善面部黑色素的处方中对酪氨酸酶活性的影
响的中药有多种，其中乌梅、桂皮、蔓荆子、山茱萸、
夏枯草抑制率为１００％，其次为白头翁、附子、黄连、
益母草、皂荚等。桑白皮、地榆、苦参、金银花、甘草、
川芎、车前子、茯苓、芦荟、熟地黄的乙醇提取液对酪
氨酸酶活性也有抑制作用［８］。
在过去的１０年中，有些酪氨酸酶抑制剂用于美
白化妆品，但因其副作用而停止使用。因此，有必要
发掘新的美白添加剂，使其既有美白作用，又无副作
用。本研究通过活性高效液相图谱跟踪方法（ｂｉｏ
ａｓｓａｙｌｉｎｋｅｄＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄ），快速查找光叉叶委陵菜
的有效成分。结果，有效成分被鉴定为槲皮素４′Ｏ
βＤ葡萄糖苷。因此，利用活性高效液相图谱跟踪
方法，可以快速分离、鉴定中草药中的酪氨酸酶抑制
剂，并可应用于其他活性成分的筛选。
［参考文献］
［１］　ＳａｎｃｈｅｚＦｅｒｅｒＡ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚＬｏｐｅｚＪＮ，ＧａｒｃｉａＣａｎｏｖａＦ，ｅｔａｌ．
Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ：Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗｏｆｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍ［Ｊ］．Ｂｉｏ
ｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，１９９５，１２４７：１．
［２］　ＭａｅｄａＫ，ＦｕｋｕｄａＭ．Ｉｎｖｉｔｒｏｅｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｏｆｓｅｖｅｒａｌｗｈｉｔｅｎｉｎｇ
ｃｏｓｍｅｔｉｃｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎｈｕｍａｎｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］ＪＳｏｃＣｏｓｍｅｔ
Ｃｈｅｍ，１９９１，４２：３６１．
［３］　ＭｉｓｈｉｍａＹ，ＨａｔａＳ，ＯｈｙａｍａＹ，ｅｔａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｍｅｌａｎｏｇｅｎｅ
ｓｉｓｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｃｅｌｕｌａｒｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄｍｏｄｅｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌａｃ
ｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｉｇｍｅｎｔＣｅｌＲｅｓ，１９８８，１：３６７．
［４］　ＪｉｎＹＨ，ＬｅｅＳＪ，ＣｈｕｎｇＭＨ，ｅｔａｌ．Ａｌｏｅｓｉｎａｎｄａｒｂｕｔｉｎｉｎｈｉｂｉｔ
ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎａｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃｍａｎｎｅｒｖｉａａｄｉｆｅｒｅｎｔａｃｔｉｏｎ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍ［Ｊ］．ＡｒｃｈｉｖｅｓＰｈａｒｍａｃａｌＲｅｓ，１９９９，２２：２３２．
［５］　ＰｉａｏＬＺ，ＰａｒｋＨＲ，ＰａｒｋＹＫ，ｅｔａｌ．Ｍｕｓｈｒｏｏｍｔｙｒｏｓｉｎａｓｅｉｎｈｉ
ｂｉｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｓｏｍｅｃｈｒｏｍｏｎｅｓ［Ｊ］．ＣｈｅｍＰｈａｒｍａＢｕｌ，２００２，
５０：３０９．
［６］　ＭａｒｋｈａｍＫＰ，ＴｅｒｎａｉＢ，ＳｔａｎｌｅｙＲ，ｅｔａｌ．Ｃａｒｂｏｎ１３ＮＭＲｓｔｕｄ
ｉｅｓｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ（Ⅲ）［Ｊ］．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９７８，３４：１３８９．
［７］　ＰｏｍｅｒａｎｔｓＳＨ．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｗｏｔｙ
ｒｏｓｉｎａｓｅｓｆｒｏｍｈａｍｓｔｅｒｍｅｌａｎｏｍａ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍ，１９６３，
２３８：２３５１．
［８］　王建华，雷帆，崔景荣．２０种中药对酪氨酸酶抑制作用的研究
［Ｊ］．中国药学杂志，２０００，３５（４）：２３２．
ＴｙｒｏｓｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＰｏｔｅｎｔｉｌａｂｉｆｕｒｃａ
ＰＩＡＯＸｉａｎｇｌａｎ１，ＴＩＡＮＹａｎｚｅ，ＭＩＸｉａｏｙｕａｎ１，２，ＣＵＩＪｉａｎ
（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｉｎｏｒｉｔｙＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＣｅｎｔｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｆｏｒＮａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＹａｎｂｉａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｌｉｎ１３３００２，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｔｙｒｏｓｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｑｕｉｃｋｌｙｆｒｏｍＰｏｔｅｎｔｉｌａｂｉｆｕｒｃａ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅａｃｔｉｖｅ
ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈｒｏｕｇｈｆｒａｃｔｉｏｎｃｏｌｅｃｔｉｎｇａｎｄｔｙｒｏｓｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｂｙｂｉｏａｓｓａｙｌｉｎｋｅｄＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅｍｅｔｈ
ａｎｏｌｅｘｔｒａｃｔｓａｎｄＢｕＯＨｆｒａｃｔｉｏｎｏｆＰｏｔｅｎｔｉｌａｂｉｆｕｒｃａｓｈｏｗｅｄｓｔｒｏｎｇｔｙｒｏｓｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．ＦｒｏｍＢｕＯＨｆｒａｃｔｉｏｎｏｆＰｏｔｅｎｔｉｌａｂｉ
ｆｕｒｃａ，ｔｈｅｔｙｒｏｓｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓｆｌａｖｏｎｏｉｄ，ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ４′ＯβＤｇｌｕｃｏｓｉｄｅ．Ｉｔｅｘｐｒｅｓｓｓｔｒｏｎｇｅｒｔｙ
ｒｏｓｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｔｈａｎｔｈｅｋｎｏｗｎｔｙｒｏｓｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｋｏｊｉｃａｃｉｄ（ＩＣ５０＝０２８ｍｍｏｌ·Ｌ
－１）ｗｉｔｈＩＣ５０ｖａｌｕｅｏｆ０００１９ｍｍｏｌ·Ｌ
－１．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＢｉｏａｓｓａｙｌｉｎｋｅｄＨＰＬＣｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓｐｒｏｖｉｄｅｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｔｈｅａｃｔｉｖｅｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｑｕｉｃｋｌｙｆｒｏｍｈｅｒｂａｌ
ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　Ｐｏｔｅｎｔｉｌａｂｉｆｕｒｃａ；ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ；ｂｉｏａｓｓａｙｌｉｎｋｅｄＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄ；ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ４′ＯβＤｇｌｕｃｏｓｉｄｅ
［责任编辑　王亚君］
·４５９１·
第３４卷第１５期
２００９年８月
　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　１５
　Ａｕｇｕｓｔ，２００９