全 文 ：［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ，ｂａｉｃａｌｉｎａｎｄｂｅｒｂｅｒｉｎｅｏｎｈｙｐｏｘｉａａｎｄｒｅｏｘｙｇｅｎ
ａｔｉｏｎｉｎｊｕｒｙｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｒａｔｃｅｒｅｂｒａｌｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｏｄｅｌｏｆｈｙｐｏｘｉａｆｏｕｒｈｏｕｒｓａｎｄｒｅｏｘｙｇｅｎ
ａｔｉｏｎｔｗｅｌｖｅｈｏｕｒｓｉｎｊｕｒｙｉｎｒａｔｃｅｒｅｂｒａｌｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓｉｎｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅｉｎｊｕｒｅｄｃｅｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ（０１２８，
００６４，００３２μｍｏｌ·ｍＬ－１），ｂａｉｃａｌｉｎ（００２８，００１４，０００７μｍｏｌ·ｍＬ－１）ａｎｄｂｅｒｂｅｒｉｎｅ（００２４，００１２，０００６μｍｏｌ·
ｍＬ－１）．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐ６５ｓｕｂｕｎｉｔｏｆＮＦκＢｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌａｓｓａｙａｎｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆｉｍａｇｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌ
ｙｓｉｓ．ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮＦκＢｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｅａｎｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙａｎｄｍｅａｎａｒｅａ．ＴｈｅｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｏｆＮＦκＢ
ｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｓａｎｄｒａｔｉｏｓｏｆｌｉｇｈｔｔｒａｎｓｍｉｔａｎｃｅｏｆｃｙｔｏｐｌａｓｍａｎｄｃｅｌｎｕｃｌｅｕｓ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｃｏｍｐａｒｅｄ
ｗｉｔｈｔｈｅｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ，ｂｏｔｈｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｔｈｅｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｏｆＮＦκＢｏｆｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｄ
（Ｐ＜００１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｍｅａｎｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙｏｆａｌｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐｓｗａｓｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｂｕｔｔｈｅｓｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉ
ｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｍ．Ａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｍｅａｎａｒｅａｏｆａｌｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜
００１）．Ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｏｆａｌｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐｓｉｓｎｏｔｏｎｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｂｕｔｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔ
ｏｆｔｈｅｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜００１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｒａｔｉｏｓｏｆｌｉｇｈｔｔｒａｎｓｍｉｔａｎｃｅｏｆｃｙｔｏｐｌａｓｍａｎｄｃｅｌｎｕｃｌｅｕｓｏｆａｌ
ｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｅｌｅｖａｔｅｄ（Ｐ＜００１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｅｄｔｈａｔｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ，ｂａｉｃａｌｉｎａｎｄｂｅｒｂｅｒｉｎｅｃｏｕｌｄ
ｐｒｏｔｅｃｔｈｙｐｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎｉｎｊｕｒｉｅｄｒａｔｃｅｒｅｂｒａｌｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓｉｎｊｕｒｙ．Ｏｎｅｏｆｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｍａｙｌｉｅｉｎｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ
ｂｏｔｈｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｔｈｅｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｏｆＮＦκＢ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　ｃｅｒｅｂｒａｌｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌ；ｈｙｐｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ；ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢ；ｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ；ｂａｉｃａｌｉｎ；
ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ
［责任编辑　古云侠］
［收稿日期］　２００７０６１０
［基金项目］　国家科技支撑计划项目（２００６ＢＡＩＯ６Ａ２００９）
［通讯作者］　姚新生，Ｔｅｌ：（０２０）８５２２５８４９，Ｅｍａｉｌ：ｙａｏｘｉｎｓｈｅｎｇ＠ｖｉｐ．ｔｏｍ．ｃｏｍ；栗原博，Ｔｅｌ：（０２０）８５２２１３５２，Ｅｍａｉｌ：ｈｉｒｏｓｈｉ＿ｋｕｒｉｈａｒａ＠
１６３．ｃｏｍ．
广东凉茶颗粒对拘束负荷诱发小鼠应激性
肝损伤的保护作用
宝　丽１，姚新生１，２，何蓉蓉１，栗原博２
（１．沈阳药科大学 中药学院，辽宁 沈阳 １１００１６；
２．暨南大学 中药及天然药物研究所，广东 广州 ５１０６３２）
［摘要］　目的：研究广东凉茶颗粒对拘束负荷诱发小鼠应激性肝损伤的保护作用。方法：将实验小鼠随机分
成正常对照组、拘束模型组、维生素Ｃ２５０ｍｇ·ｋｇ－１给药组、广东凉茶颗粒５００，２５０ｍｇ·ｋｇ－１给药组。１８ｈ拘束负
荷后诱发小鼠应激性肝损伤，分别用赖氏法测定小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶（ＡＬＴ）活性，硫代巴比妥酸法测定肝
组织和血浆丙二醛（ＭＤＡ）水平，ＨＰＬＣ法测定谷胱甘肽（ＧＳＨ）含量，比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨＰＸ）活
性、谷胱甘肽Ｓ转移酶（ＧＳＴ）活性，Ｇｒｉｅｓｓ化学法测定一氧化氮（ＮＯ）水平和荧光酶标仪测定抗氧化能力指数
（ＯＲＡＣ）。结果：与拘束负荷模型组相比，广东凉茶颗粒可以明显降低因拘束负荷引起的小鼠血浆 ＡＬＴ活性
（９２７５±１９１ｖｓ３９２９±２５６，３２６９±１４６）Ｕ·Ｌ－１，保护拘束负荷诱发的应激性肝损伤。此外，广东凉茶颗粒有
效地提高应激小鼠肝组织中ＯＲＡＣ指数、ＧＳＨ含量、ＧＳＨＰＸ及ＧＳＴ活性，降低ＭＤＡ和 ＮＯ水平。结论：广东凉茶
颗粒对拘束负荷诱发小鼠应激性肝损伤具有一定的保护作用，其作用机制可能部分来自于减少拘束负荷小鼠氧化
应激水平和改善组织脂质过氧化过程。
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第３３卷第６期
２００８年３月
　　　　　　　　　
　　　 中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
　　　　　　　
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ　６
Ｍａｒｃｈ，２００８
［关键词］　广东凉茶颗粒；拘束负荷；谷丙转胺酶；谷胱甘肽；抗氧化能力指数
［中图分类号］Ｒ２８５．５　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１５３０２（２００８）０６０６６４０５
　　随着现代生活方式的改变，体力劳累已不再是
人们疲劳的主要原因，现代人更多是在面对环境变
化，生活习惯改变及物理化学等各种应激源所带给
人们的身心疲劳。应激对于机体的影响是广泛的，
涉及到神经、内分泌和免疫等多方面的生理功能。
Ｒｏｓｃｈ等人的研究证明，长期的应激负荷不仅严重
影响身心健康，而且会导致情绪和行为异常［１］。
在本实验中，笔者将小鼠放置在狭窄的拘束环
境中，限制自由运动，使其烦躁和焦虑，来模拟心理
应激状态。采用拘束负荷诱发小鼠氧化应激是目前
被广泛采用的一种模拟心理压力的应激模型［２］。
中医理论认为各种刺激源所引起的气机变化，主要
由肝脏来调整。在心理方面对于情绪变化，尤其在
调节情志因素引起的各种变化时，肝脏起着决定性
的作用［３］。这提示中医学中肝脏功能与西医学的
神经内分泌免疫系统表示的机体内环境稳定状态
密切相关。
广东凉茶颗粒是由港梅根，木蝴蝶，火炭母，金
钱草，布渣叶，淡竹叶，金沙藤，五指柑，山芝麻，金樱
根等 １０味甘淡清利，性凉的天然植物组成，用作
“泻火”已有近２００年的历史。虽然迄今为止的研
究提示广东凉茶颗粒的某些组成中药具有抗菌消
炎，提高免疫力及平衡人体机能等作用，但并没有回
答广东凉茶颗粒的作用机制。笔者认为“上火”这
种传统文化上的概念表达，至少应部分包括近代医
学中的应激反应过程或者是身心疲劳的临床症状。
因此本实验从应激的角度对广东凉茶颗粒进行研
究，旨在揭示广东凉茶颗粒对人体健康调节功效的
科学内涵。
１　材料
１．１　动物　清洁级 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠，雄性，７周龄，
购自南方医科大学实验动物中心，动物许可证号
ＳＣＸＫ（粤）２００６００１５。饲养温度（２３±２）℃，照明
时间每天１２ｈ（７：００～１９：００）。小鼠饲养１周后进
行实验。
１．２　药品　广东凉茶颗粒（凉茶颗粒浸膏，批号
０６０５１２５，国药准字：ＷＳ３Ｂ３５４９８２００３）由广州王
老吉药业股份有限公司提供。组方：岗梅根 Ｉｌｅｘ
ａｓｐｒｅｌａ，木蝴蝶Ｏｒｏｘｙｌｕｍｉｎｄｉｃｕｍ（Ｌ．）Ｖｅｎｔ，火炭母
ＰｏｌｙｇｏｎｕｍｃｈｉｎｅｎｓｅＬ．，金钱草Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍｓｔｙｒａｃｉｆｏｌｉ
ｕｍＭｅｒ，布渣叶 ＭｉｃｒｏｃｏｓｐａｎｉｃｕｌａｔａＬ．，淡竹叶 Ｌｏ
ｐｈａｔｈｅｒｕｍｇｒａｃｉｌｅＢｒｏｎｇｎ．，金沙藤 Ｌｙｇｏｄｉｕｍｊａｐｏｎｉ
ｃｕｍ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｓｗ．，五指柑 ＣｉｔｒｕｓｍｅｄｉｃａＬ．ｖａｒ．ｓａｒ
ｃｏｄａｃｔｙｌｉｓ，山芝麻 ＨｅｌｉｃｔｅｒｅｓａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａＬｉｎｎ，金樱根
ＲｏｓａｌａｅｖｉｇａｔａＭｉｃｈｘ，均由广州市药品检验所中药室
鉴定。
１．３　试剂　丙氨酸氨基转移酶（ａｌａｎｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓ
ｆｅｒａｓｅ，ＡＬＴ）、丙二醛（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ，ＭＤＡ）、谷胱
甘肽Ｓ转移酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＧＳＴ）、谷胱
甘肽过氧化物酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＧＳＨＰｘ）及
考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程
研究 所 （批 号 ２００６１１２０，２００６０３１６，２００６０５２３，
２００６０４２１，２００６０２１４）。谷胱甘肽（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，ＧＳＨ，
ＫｏｈｊｉｎＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ），辛烷磺酸钠
（ＳＯＳ，ＴｏｋｙｏＫａｓｅｉＫｏｇｙｏＣｏ．，Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ），
磺胺为天津大茂化学试剂厂生产，Ｎ１奈乙二胺（盐
酸盐）为天津市福晨化学试剂厂生产。甲醇（色谱
纯）为江苏汉邦科技有限公司产品，６ｈｙｄｒｏｘｙ２，５，
７，８ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎ２ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ（Ｔｒｏｌｏｘ，为
维生素Ｅ的水溶性衍生物），２，２′ａｚｏｂｉｓ（２ａｍｉｄｉｎｏ
ｐｒｏｐａｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＡＡＰＨ），荧光素钠（ｓｏｄｉ
ｕｍｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）均购自 ＷａｋｏＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓ
ｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）。
１．４　分析仪器　高效液相色谱系统包括 ＨＩＴＡＣＨＩ
Ｌ－６２００型输液泵，Ｌ－５０２０型柱温箱（Ｈｉｔａｃｈｉ
Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ），Ｅｉｃｏｍ公司 ＥＣＤ－１００型电化学检测
器，浙江大学 Ｎ２０００色谱数据工作站，ＭＫ３型酶标
仪（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ，Ｈｅｌｓｉｎｋ，Ｆｉｎｌａｎｄ），ＧＥＮｉｏｓ系列荧光
酶标仪及 Ｍａｇｅｌａｎ工作站（ＴｅｃａｎＩｎｃ，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，
Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），ＵＬＴＲＡ－ＴＵＲＲＡＸＴ８型组织匀浆机
（ＩＫＡＬａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ，Ｓｔａｎｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及３－１８Ｋ型
台式高速冷冻离心机（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａ
ｎｙ），ＢＳ２１０Ｓ电子分析天平（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｔｉｎｇｅｎ，
Ｇｅｒｍａｎｙ），ＷＨ－８６１型漩涡混合器（太仓市科教器
材厂）及ｐＨＳ－２５型酸度计（上海伟业仪器厂）。
２　方法
２．１　动物分组及给药　将小鼠随机分成正常组、拘
束模型组、维生素Ｃ２５０ｍｇ·ｋｇ－１给药组、广东凉茶
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颗粒５００，２５０ｍｇ·ｋｇ－１组，每组７只。正常组和拘
束负荷模型组均灌胃同体积蒸馏水，每天１次，第４
天模型组和广东凉茶颗粒组以及维生素 Ｃ给药组
小鼠灌胃３０ｍｉｎ后进行拘束应激实验，拘束期间小
鼠不能进食饮水，正常组小鼠为非拘束禁食禁水小
鼠。小鼠拘束装置参考文献［４］改制，为通风良好
的５０ｍＬ尖底聚丙烯塑料离心管，给予一次性拘束
１８ｈ（１４∶００～８∶００），其后乙醚麻醉，心脏采血，并迅
速在冰上分离得到肝组织。
２．２　血浆ＡＬＴ活性的测定　小鼠全血置于肝素处
理过的离心管中，以５０００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ分离
血浆。取应激负荷小鼠血浆样品利用赖氏法（Ｒｅｉｔ
ｍａｎＦｒａｎｋｅｌ）检测试剂盒测定，以 ＭＫ３型酶标仪
（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ，Ｈｅｌｓｉｎｋ，Ｆｉｎｌａｎｄ）在 ４９２ｎｍ下测定
ＡＬＴ活性。
２．３　血浆和肝组织 ＭＤＡ水平的测定　小鼠肝组
织的５％生理盐水匀浆液在４℃条件下以１万 ｒ·
ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，取上清液稀释成２％后以考马斯
亮蓝蛋白试剂盒测定蛋白含量。小鼠血浆和肝组织
匀浆中 ＭＤＡ水平利用 ＭＤＡ检测试剂盒测定，以
ＭＫ３型酶标仪（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ，Ｈｅｌｓｉｎｋ，Ｆｉｎｌａｎｄ）在５３２
ｎｍ下测定ＭＤＡ水平。
２．４　肝组织ＧＳＨ含量的测定　小鼠肝组织称重后
按质量体积比１∶２０添加３％高氯酸，再用 ＩＫＡＵＬ
ＴＲＡＴＵＲＲＡＸＴ８型 组 织 匀 浆 机 在 冰 浴 下 以
１５０００ｒ·ｍｉｎ－１的转速匀浆３０ｓ并去蛋白。匀浆液
在４℃条件下以１２０００ｒ·ｍｉｎ－１的速度离心１５ｍｉｎ，
取上清液用０４５μｍ微孔滤膜过滤后－２０℃保存用
于ＧＳＨ分析。ＧＳＨ测定使用日本ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ公
司Ｃｏｓｍｏｓｉｌ系列５Ｃ１８柱（４６ｍｍ×１５０ｍｍ，５μｍ），
流动相［５］９９ｍｍｏｌ·Ｌ－１磷酸二氢钠缓冲液（ｐＨ
２５），１％甲醇，２００ｍｇ·Ｌ－１ＳＯＳ，５ｍｇ·Ｌ－１ＥＤＴＡ，
用磷酸调ｐＨ至２５。柱温２５℃，流速１ｍＬ·ｍｉｎ－１，
电压６００ｍＶ，进样体积１５μＬ。标准对照ＧＳＨ以０１
ｍｏｌ·Ｌ－１ＨＣＬ溶解并稀释后－２０℃保存。对照品储
备液的制备过程在低温条件下进行操作。
２．５　肝组织 ＧＳＨＰｘ活性的测定　小鼠肝组织的
５％生理盐水匀浆液在４℃条件下以１万 ｒ·ｍｉｎ－１
离心 １０ｍｉｎ，取上清液采用 ＧＳＨＰｘ试剂盒检测
ＧＳＨＰｘ活性。在４１２ｎｍ下，通过比色法利用 ＭＫ３
型酶标仪（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ，Ｈｅｌｓｉｎｋ，Ｆｉｎｌａｎｄ）检测 ＧＳＨ
浓度的高低来反映ＧＳＨＰｘ活性。
２．６　肝组织 ＧＳＴ活性的测定　鼠肝组织的５％生
理盐水匀浆液在４℃条件下以１万 ｒ·ｍｉｎ－１离心
１０ｍｉｎ，取上清液采用 ＧＳＴ试剂盒检测 ＧＳＴ活性。
在４１２ｎｍ下，通过比色法利用ＭＫ３型酶标仪（Ｌａｂ
ｓｙｓｔｅｍ，Ｈｅｌｓｉｎｋ，Ｆｉｎｌａｎｄ）检测 ＧＳＨ浓度的高低来
反映ＧＳＴ活性。
２．７　抗氧化能力指数（ＯＲＡＣ）的测定　参照Ｄａｖａ
ｌｏｓ等人方法并加以改进［６］。具体测定方法是将９６
孔板每个微孔中加入待测样品溶液２０μＬ，再加入
磷酸钾缓冲液２０μＬ和ＡＡＰＨ１４０μＬ（终浓度１２８
ｍｍｏｌ·Ｌ－１），最后添加荧光素钠２０μＬ至终浓度为
６３ｎｍｏｌ·Ｌ－１，立即启动反应并迅速将酶标板置于
预温３７℃的荧光酶标仪中开始测定。采用动力学
方式，每２ｍｉｎ测定一个点，至荧光强度衰减为零时
止。ＯＲＡＣ值参照下列公式，以 １μｍｏｌ·Ｌ－１的
Ｔｒｏｌｏｘ在荧光衰减曲线上对应的保护积分面积
（ＡＵＣ）作为标准对照进行计算。
ＯＲＡＣ＝［（ＡＵＣ样品 －ＡＵＣＡＡＰＨ）／（ＡＵＣＴｒｏｌｏｘ－ＡＵＣＡＡＰＨ）
］×（Ｔｒｏｌｏｘ浓度／样品浓度）
２．８　ＮＯ水平的测定［７］　取 ４０μＬ的样品，加入
１６０μＬ的Ｇｒｉｅｓｓ试剂（０１％萘乙二胺溶液与１％磺
胺（５％）磷酸溶液，使用前１２ｈ内等体积混合）后静
置２０ｍｉｎ，５５０ｎｍ波长测定溶液吸光度（Ａ），根据
ＮＯ标准曲线计算 ＮＯ水平（μｍｏｌ·ｍＬ－１）。ＮＯ标
准曲线的制备是将不同浓度的亚硝酸钠 ＰＢＳ溶液
４０μＬ加至１６０μＬＧｒｉｅｓｓ试剂中，混匀，静置２０ｍｉｎ
后，５５０ｎｍ波长测定溶液Ａ。以亚硝酸钠为横坐标，
所测Ａ为纵坐标，做出标准曲线。
２．９　统计学处理　实验数据以 珋ｘ±ｓ表示，采用
ＳＰＳＳ１３０软件，利用 ＡＮＯＶＡ检验和 Ｄｕｎｎｅｔ’ｓ检
验进行统计学处理，Ｐ＜００５有统计学意义。
３　结果
３．１　对拘束负荷小鼠血浆 ＡＬＴ活性的影响　与正
常组相比，拘束负荷诱发小鼠血浆 ＡＬＴ活性明显升
高。维生素Ｃ给药组和广东凉茶颗粒高，低剂量组
均能显著降低拘束负荷小鼠血浆 ＡＬＴ活性（Ｐ＜
００１），并显示有一定的量效关系，见表１。
３．２　对拘束负荷小鼠血浆和肝组织 ＭＤＡ水平的
影响　与正常组相比，拘束负荷小鼠血浆 ＭＤＡ水
平显著升高（Ｐ＜００１）。维生素Ｃ给药组和广东凉
茶颗粒高，低剂量组均能降低拘束负荷小鼠血浆
ＭＤＡ水平，其中维生素Ｃ给药组和广东凉茶颗粒高
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第３３卷第６期
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　　 表１　广东凉茶颗粒对拘束负荷小鼠血浆ＡＬＴ活性和血浆、肝组织ＭＤＡ水平的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝７）
组别
剂量
／ｍｇ·ｋｇ－１
ＡＬＴ
／Ｕ·Ｌ－１
ＭＤＡ
肝组织／ｎｍｏｌ·ｍｇ－１ 血浆／ｎｍｏｌ·ｍＬ－１
正常 － ３７２５±１６５ ２９１３±２１０ ２６３１±０７３
模型 － ９２７５±１９１１） ４１６３±２３２１） ３６４２±０７２１）
维生素Ｃ ２００ ３１０２±２１１２） １８２９±０２３２） ２７３４±０６１２）
广东凉茶颗粒 ２５０ ３９２９±２５６２） ２２５３±１６１２） ３２６７±０８０
　 ５００ ３２６９±１４６２） １９７３±１４７２） ２８４６±０７７２）
　　注：与正常组比较１）Ｐ＜００１；与模型组比较２）Ｐ＜００１（表２同）
剂量组显著低于拘束负荷小鼠（Ｐ＜００１）。拘束负
荷肝小鼠肝组织中 ＭＤＡ水平也显著高于正常组，
并且维生素 Ｃ给药组和广东凉茶颗粒高，低剂量组
显著改善这种变化（Ｐ＜００１）。见表１。
３．３　对拘束负荷小鼠肝组织ＧＳＨ含量的影响　与
正常组相比，拘束负荷小鼠肝组织ＧＳＨ含量显著降
低（Ｐ＜００１）。维生素Ｃ给药组和广东凉茶颗粒各
剂量组对拘束负荷小鼠肝组织 ＧＳＨ含量的降低均
有一定的改善作用，与拘束负荷模型组相比有显著
性差异（Ｐ＜００１），见表２。
３．４　对拘束负荷小鼠肝组织 ＧＳＨＰｘ和 ＧＳＴ活性
的影响　与正常组相比，拘束负荷小鼠肝组织ＧＳＨ
表２　广东凉茶颗粒对拘束负荷小鼠肝组织ＧＳＨ含量及ＧＳＴ，ＧＳＨＰｘ活性的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝７）
分组 剂量／ｍｇ·ｋｇ－１ ＧＳＨ／μｇ·ｍｇ－１ ＧＳＨＰｘ／Ｕ·ｍｇ－１ ＧＳＴ／Ｕ·ｍｇ－１
正常 － ０９４±００５ １３９７±０１０ ５９３８±１０６
模型 － ０５７±００５１） １２３０±０１１１） ４０９１±１２７１）
维生素Ｃ ２００ １５０±０１５２） １３１８±０１４２） ５７６６±１４２２）
广东凉茶颗粒 ２５０ １１５±０１０２） １２３５±００８ ５１３４±０７８２）
　 ５００ １６８±０１５２） １３４５±００９２） ５６２５±１３５２）
Ｐｘ和ＧＳＴ活性显著降低（Ｐ＜００１）。广东凉茶颗
粒各剂量组对拘束负荷小鼠肝组织 ＧＳＨＰｘ和 ＧＳＴ
活性降低均有改善作用，广东凉茶颗粒高剂量组和
维生素Ｃ给药组的ＧＳＨＰｘ活性与模型组相比有显
著性差异（Ｐ＜００１）。见表２。
３．５　对拘束负荷小鼠肝组织 ＯＲＡＣ指数和 ＮＯ水
平的影响　与正常组相比，拘束负荷小鼠肝组织
ＯＲＡＣ指数显著降低（Ｐ＜００１）。广东凉茶颗粒各
剂量组对拘束负荷小鼠肝组织 ＯＲＡＣ指数的降低
均有改善作用。另外，模型组小鼠肝组织 ＮＯ的水
平显著高于正常组，维生素 Ｃ给药组和广东凉茶颗
粒给药组显著降低肝组织ＮＯ水平（Ｐ＜００１）。见
表３。
４　讨论
与正常组相比，小鼠拘束负荷１８ｈ后血浆 ＡＬＴ
活性显著上升的同时，脂质过氧化产物 ＭＤＡ水平
明显增加。采用 ＯＲＡＣ方法分析小鼠肝组织的抗
氧化能力指数时发现，应激负荷小鼠肝组织的抗氧
化能力指数水平与正常组相比显著降低。拘束负荷
引起小鼠肝组织内ＧＳＨ含量明显下降，说明拘束负
荷诱发的氧化应激增加了对巯基蛋白质和含巯基酶
的破坏作用。实验中还发现肝组织内 ＧＳＨＰｘ活性
　　表３　广东凉茶颗粒对拘束负荷小鼠肝组织ＯＲＡＣ指数
和ＮＯ水平的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝７）
分组
剂量
／ｍｇ·ｋｇ－１
ＯＲＡＣ
／μｍｏｌ·Ｌ－１
ＮＯ
／μｍｏｌ·ｍＬ－１
正常 － １０４０±００９ ８９４１±１９８
模型 － ４８０±００６１） １１２３４±０９６１）
维生素Ｃ ２００ １１２０±０１０２） ９１５５±２４６３）
广东凉茶颗粒 ２５０ １５２０±０１２３） ９３５６±２２６３）
　 ５００ １６６０±０１８３） ８８７９±３３９３）
　　注：与正常组比较１）Ｐ＜００１；与模型组比较２）Ｐ＜００５，３）Ｐ＜
００１
因应激负荷明显降低。ＧＳＨＰｘ是生物体内重要的
抗氧化酶之一，具有减少自由基产生，增强机体的抗
氧化能力作用。这一现象可能与肝组织内的自由基
增加及内源性抗氧化能力消耗有关。一般认为机体
在应激状态下，过剩产生的氧自由基不能及时清除，
蓄积的氧自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸而引
发脂质过氧化反应，结果导致脂肪酸链和细胞膜完
整性的破坏。肝脏是机体中最主要的代谢器官，容
易受各种应激刺激的影响。肝细胞膜在受损伤的同
时产生大量新的活性氧基团，促发脂质过氧化的链
式反应，损伤肝脏组织。
肝脏是机体应激反应的敏感器官，因此肝脏功
能可以部分反应机体的氧化应激状态［８］。以生物
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第３３卷第６期
２００８年３月
　　　　　　　　　
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Ｍａｒｃｈ，２００８
膜中不饱和脂肪酸的脂质过氧化反应的最终产物
ＭＤＡ水平作为间接反映肝损伤程度的指标，实验结
果显示，广东凉茶颗粒降低血浆及肝脏中 ＭＤＡ水
平，同时显著减少拘束负荷引起小鼠血浆 ＡＬＴ活性
的升高。上述结果说明广东凉茶颗粒能有效减缓拘
束负荷小鼠机体的氧化应激状态，降低氧化应激诱
发脂质过氧化对肝脏的损伤作用。近年来的研究证
明机体在应激负荷下可以诱发 ＮＯ合成异常，由于
ＮＯ在体内的作用与ＮＯ浓度有关，当组织内 ＮＯ浓
度过高时，会通过其代谢产物引起组织损伤。Ｇｒｉｅｓｓ
化学法测定ＮＯ水平结果显示，广东凉茶颗粒对肝
组织中ＮＯ水平的上升有一定的改善作用，减少氧
化应激状态对机体功能的影响。在体内 ＯＲＡＣ实
验中发现，广东凉茶颗粒能够提高拘束负荷小鼠血
浆抗氧化能力指数，明显升高肝组织匀浆中的 ＧＳＨ
含量。ＧＳＨ不仅可以抑制肝细胞膜脂质过氧化，还
具有保护蛋白巯基免受氧化损伤的作用。此外，广
东凉茶颗粒也改善了拘束负荷小鼠肝组织中 ＧＳＴ
活性，提高ＧＳＴ催化ＧＳＨ反应能力。广东凉茶颗粒
对ＧＳＨ含量的影响说明，其作用通过缓解机体的应
激负荷有效的防止氧化应激状态下活性氧引起的过
氧化损伤，从而改善了应激性肝损伤的发生。
应激对于机体的影响是广泛的，涉及到神经、内
分泌和免疫各个方面。在长期应激状态下，机体内
稳态失衡，会出现神经内分泌失调、免疫力低下等明
显的生理变化，并导致情绪和行为异常，严重影响着
人类的身心健康。随着现代生活模式的转变，与情
志相关因素引起的生活习惯病已成为人们关注的课
题。具有清热解暑，去湿生津等功效的广东凉茶颗
粒，有着悠久的饮用历史，并被消费者接受。实验证
明广东凉茶颗粒可以通过缓解机体氧化应激状态改
善肝组织机能，但其作用机制尚有待进一步研究。
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ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｅｃｔｓｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＬｉａｎｇｃｈａｇｒａｎｄｅｓｏｎｒｅｓｔｒａｉｎｔ
ｓｔｒｅｓｓｉｎｄｕｃｅｄｌｉｖｅｒｄａｍａｇｅｉｎｍｉｃｅ
ＢＡＯＬｉ１，ＹＡＯＸｉｎｓｈｅｎｇ１，２，ＨＥＲｏｎｇｒｏｎｇ１，ＫＵＲＩＨＡＲＡＨｉｒｏｓｈｉ２
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，ＳｈｅｎｙａｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１００１６，Ｃｈｉｎａ；
２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＮａｔｕｒａｌｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＪｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３２，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＬｉａｎｇｃｈａＫｅｌｉｏｎｒｅｓｔｒａｉｎｔｓｔｒｅｓｓｉｎｄｕｃｅｄｌｉｖｅｒｄａｍａｇｅｉｎｍｉｃｅ．
Ｍｅｔｈｏｄ：ＴｈｉｒｔｙｆｉｖｅｍａｌｅＣ５７ＢＬ／６Ｊｍｉｃｅｏｆ７ｗｅｅｋｓｏｌｄｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ５ｇｒｏｕｐｓｒａｎｄｏｍｌｙｗｉｔｈ７ｍｉｃｅｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ：ｎｏｒｍａｌ
ｇｒｏｕｐ，ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓｔｒｅｓｓｇｒｏｕｐ，２５０ｍｇ·ｋｇ－１ＶｉｔａｍｉｎＣ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＬｉａｎｇｃｈａＫｅｌｉ５００ｍｇ·ｋｇ－１ａｎｄ２５０ｍｇ·ｋｇ－１．Ａｆｔｅｒ１８ｈｒｒｅ
ｓｔｒａｉｎｔｓｔｒｅｓｓ，ｔｈｅＡＬＴａｃｉｔｉｖｉｔｙｉｎｐｌａｓｍａ，ＭＤＡｌｅｖｅｌｉｎｐｌａｓｍａａｎｄｌｉｖｅｒ，ＧＳＨｃｏｎｔｅｎｔ，ＧＳＨＰＸａｎｄＧＳＴａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，ＮＯｌｅｖｅｌａｎｄ
ＯＲＡＣｖａｌｕｅｉｎｌｉｖｅｒｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｒｅｓｔｒａｉｎｔｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＬｉａｎｇｃｈａＫｅｌｉｃｏｕｌｄｍａｒｋｅｄｌｙｒｅｄｕｃｅ
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Ｍａｒｃｈ，２００８
ＡＬＴａｃｔｉｖｉｔｙ（９２７５±１９１ｖｓ３９２９±２５６，３２６９±１４６）Ｕ·Ｌ－１，ａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｔｈｅｌｉｖｅｒｄａｍａｇｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ．Ｉｎ
ａｄｄｉｔｉｏｎ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＬｉａｎｇｃｈａＫｅｌｉｃｏｕｌｄｅｆｅｃｔｉｖｅｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅＯＲＡＣｖａｌｕｅ，ＧＳＨｃｏｎｔｅｎｔ，ＧＳＨＰＸａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＧＳＴａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄ
ｒｅｄｕｃｅｔｈｅＭＤＡｌｅｖｅｌａｎｄＮＯｌｅｖｅｌｉｎｌｉｖｅｒ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＯｒａｌｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＬｉａｎｇｃｈａＫｅｌｉｉｓｆｏｕｎｄｔｏｒｅｄｕｃｅｒｅｓｔｒａｉｎｔ
ｓｔｒｅｓｓｉｎｄｕｃｅｄｌｉｖｅｒｄａｍａｇｅｉｎｔｅｒｍｓｏｆａｂｏｖｅｍｅｎｔｉｏｎｅｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，ａｎｄｔｈｅｓｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｅｃｔｓｍａｙｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｉｔｓｆｒｅｅ
ｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｌｉｐｉｄｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｅｃｔｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　ＧｕａｎｇｄｏｎｇＬｉａｎｇｃｈａＫｅｌｉ；ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓｔｒｅｓｓ；ａｌａｎｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ）；ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（ＧＳＨ）；ｏｘｙｇｅｎｒａｄｉ
ｃａｌａｂｓｏｒｂａｎｃｅｃａｐａｃｉｔｙ（ＯＲＡＣ）
［责任编辑　古云侠］
［收稿日期］　２００７０５０８
［基金项目］　重庆市教委科学技术研究项目（ＫＪ０６０７０２）
［通讯作者］　陈刚，Ｔｅｌ：（０２３）６２７６９６５２，Ｆａｘ：（０２３）６２７６９６５２，
Ｅｍａｉｌ：ｌｉｃｏｒｉｃｅｃｈ＠ｃｔｂｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
白芍总苷对巨噬细胞核转录因子
κＢ活化的影响及其机制研究
陈　刚，邓小红，郭莉霞，刘建辉
（重庆工商大学 药物化学与化学生物学研究中心，重庆 ４０００６７）
［摘要］　目的：研究白芍总苷（ＴＧＰ）对核转录因子κＢ（ＮＦκＢ）活化的调节作用及其机制。方法：不同剂量
（１０，３０，１００，３００μｇ·ｍＬ－１）的ＴＧＰ作用于大鼠腹腔巨噬细胞２ｈ后，加入脂多糖（ＬＰＳ）刺激２０ｍｉｎ或１ｈ，Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ方法分别观察ＮＦκＢ抑制蛋白ＩκＢα在胞浆中的含量及ＮＦκＢ亚基ｐ６５在胞核中的含量，同时检测 ＮＦκＢ与
ＤＮＡ的结合活性。结果：ＴＧＰ显著增加了ＬＰＳ刺激后的巨噬细胞胞浆中ＩκＢα蛋白的含量，同时显著减少了胞核中
ＮＦκＢｐ６５蛋白含量，并对ＬＰＳ诱导的ＮＦκＢ与ＤＮＡ的结合活性也有明显抑制作用。结论：ＴＧＰ可抑制ＬＰＳ诱导
的巨噬细胞ＮＦκＢ的活化，其机制与ＴＧＰ抑制ＩκＢα蛋白的降解，阻遏 ＮＦκＢｐ６５蛋白的核转移和抑制 ＮＦκＢ与
ＤＮＡ的结合密切相关。
［关键词］　白芍总苷；核转录因子κＢ；抑制蛋白ＩκＢ；巨噬细胞
［中图分类号］Ｒ２８５．５　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１５３０２（２００８）０６０６６９０３
　　核转录因子 ＮＦκＢ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒκＢ，ＮＦκＢ）
通常以同源或异源二聚体形式存在于多种类型细胞
中。ｐ６５ｐ５０是 ＮＦκＢ最常见的活性二聚体形式，
此二聚体与抑制蛋白ＩκＢ相结合而以非活性状态存
在于细胞胞质中［１］。研究证实，ＮＦκＢ的活化在炎
症过程中扮演了关键性角色，其活化后可启动多种
促炎症基因的转录，如白细胞介素１β（ＩＬ１β），ＩＬ２，
ＩＬ６，肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）、诱导型一氧化氮合酶
（ｉＮＯＳ）、环加氧酶２（ＣＯＸ２）、细胞间黏附分子１
（ＩＣＡＭ１）等［２］。在类风湿关节炎、系统性红斑狼
疮、系统性硬化症、支气管哮喘等疾病中均发现有
ＮＦκＢ的异常过度活化［３］。因此，调控 ＮＦκＢ的活
化被认为是抗炎药物研发的一个重要作用靶点。本
试验观察了白芍总苷（ｔｏｔａｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓｏｆｐａｅｏｎｙ，
ＴＧＰ）对ＮＦκＢ活化的影响并探讨了其作用机制，为
ＴＧＰ的抗炎作用提供新的理论依据。
１　材料
１．１　药物与试剂　白芍总苷由朗生医药控股有限
公司惠赠，含量，批号 ０５０９１５；脂多糖（ＬＰＳ）购自
Ｓｉｇｍａ公司；ＮＦκＢｐ６５抗体、ＩκＢα抗体、βａｃｔｉｎ抗
体、Ｓｐ１抗体、ＥＣＬ检测试剂盒均购自 ＳａｎｔａＣｒｕｚ公
司；ＤＭＥＭ培养基、小牛血清均购自 Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；
ＴｒａｎｓＡＭＴＭＮＦκＢｐ６５活性检测试剂盒购自 Ａｃｔｉｖｅ
Ｍｏｔｉｆ公司；其余试剂为进口分装或市售分析纯。
１．２　动物　ＳＤ大鼠，清洁级，体重（２００±２０）ｇ，购自
第三军医大学大坪医院实验动物中心，动物合格证号。
１．３　主要仪器　电泳仪和垂直电泳槽（ＢｉｏＲａｄ），
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第３３卷第６期
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