全 文 ：温补肾阳药对甲状腺切除的肾阳虚大鼠
肝线粒体蛋白质组的影响
卢德赵，沃兴德，沃立科，李　毅，唐利华，杨　贞
（浙江中医药大学 生命科学学院，浙江 杭州 ３１００５３）
［摘要］　目的：研究温补肾阳药对肾阳虚动物肝线粒体蛋白质组的影响。方法：１２只ＳＤ大鼠，随机分为３组，每组４只。
模型组和治疗组切除两侧甲状腺，正常组做相应的假手术，但不切除甲状腺。喂养７ｄ后模型组和治疗组大鼠出现拱背耸毛、
大便稀溏等肾阳虚的症状。从第８天开始，治疗组每天喂饲温补肾阳药１次，给药剂量６７ｇ·ｋｇ－１，其他２组喂饲等体积的
生理盐水，连续６ｄ后，断头处死３组大鼠，分离提取其肝线粒体蛋白质，分别用荧光染料Ｃｙ３，Ｃｙ５标记，每个Ｃｙ３及Ｃｙ５标记
的样品与等量Ｃｙ２标记的内标混合后在同一块凝胶中进行电泳分离，经不同光激发后扫描得到不同样品的蛋白质组图谱。
经ＤｅＣｙｄｅｒ６５软件进行差异蛋白质组分析，并对差异蛋白质进行质谱鉴定。结果：双向电泳后，平均每块胶检测到９９７个蛋
白质点，其中所有图谱共有的点有６８７个，并从中筛选到２２个差异蛋白，其中热休克蛋白６０、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化
物、氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ，ＡＴＰ合成酶、乳铁传递蛋白、ＡＴＰ酶质子通道蛋白、电子传递黄素蛋白和类钙离子激活中性蛋白酶
１２在肾阳虚状态下表达量均增加，而二氢硫辛酰胺支链酰基转移酶、脂酰辅酶Ａ脱氢酶、鸟氨酸转氨酶和ＧＴＰ结合调节蛋白
在肾阳虚状态下表达量均降低。经温补肾阳药治疗后，热休克蛋白６０、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物、ＡＴＰ合成酶、乳铁传
递蛋白、ＡＴＰ酶质子通道蛋白、电子传递黄素蛋白二氢硫辛酰胺支链酰基转移酶、脂酰辅酶Ａ脱氢酶和ＧＴＰ结合调节蛋白表
达量均增加，而氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ和类钙离子激活中性蛋白酶１２表达量减少。结论：温补肾阳药可能通过调节物质代谢、
保护线粒体膜稳定性和维护细胞内信号传导而起到治疗肾阳虚的作用。
［关键词］　蛋白质组；肾阳虚；温补肾阳药；线粒体
［收稿日期］　２００８０６２０
［基金项目］　国家自然科学基金项目（３０３７１７１０）；浙江省中医药管
理局重点项目（２００６Ｚ００２）
［通信作者］　沃兴德，教授，博士生导师，Ｔｅｌ：（０５７１）８６６１３５９８，Ｅ
ｍａｉｌ：ｗｏｘｄｔｃｍ＠１２６．ｃｏｍ
　　肾阳，又称命门之火，为人体阳气之根本。中医
基础理论认为，肾阳是建立在肾之精气基础上，具有
温煦、蒸腾、气化、推动、激发以及固摄等生理作用，具
体表现在能增强脏腑组织器官的功能，促进机体新陈
代谢作用，制约体内阴寒之气，并不断化生人体所必
需的阴精物质等方面。因此，肾阳被视作为人体生命
活动的原动力，在整个生命活动过程中占有至关重要
的地位，受到历代医家的重视。肾阳虚证是指由于肾
阳虚衰，温煦失职，气化失权所表现的一类虚寒证候。
临床主要表现为腰膝酸软、畏寒肢冷、头晕目眩、精神
萎靡、面色恍白、舌淡苔白和脉沉细［１］。综合肾阳虚
临床症状和实验造模后的症状，不难看出肾阳虚其中
一个很明显的表现为能量代谢功能障碍［２３］。临床上
用温肾助阳药治疗后可改善脾肾阳虚症状。本实验
采用切除动物甲状腺造成肾阳虚动物模型，利用凝胶
内差异显示电泳技术（ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｎｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｓ，ＤＩＧＥ）技术，建立正常大鼠、肾阳虚模型大鼠及治
疗后肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组图谱，并进行差异
蛋白质组分析，从蛋白质表达变化的角度研究肾阳虚
证的物质基础和温补肾阳药的作用机制，用以指导中
医肾阳虚证的临床治疗［４］。
１　材料
１．１　动物　清洁级的 ＳＤ大鼠１２只，雄性，体重在
２６０～３００ｇ，购自浙江中医药大学实验动物中心，动
物合格证号 ＳＣＸＫ（沪）２００３０００３，于室温下饲养，
控制空气干湿度，随意饮水和进食。
１．２　药物　仙茅 Ｃｕｒｃｕｌｉｇｏｏｒｃｈｉｏｉｄｅｓ１０ｇ、淫羊藿
Ｅｐｉｍｅｄｉｕｍｂｒｅｖｉｃｏｒｎｕｍ１０ｇ、肉苁蓉Ｃｉｓｔａｎｃｈｅｄｅｓｅｒｔｉ
ｃｏｌａ１５ｇ、附子Ａｃｏｎｉｔｕｍｃａｒｍｉｃｈａｅｌｉ６ｇ、干姜Ｒｒｈｉｚｏ
ｍａｚｉｎｇｉｂｅｒｉｓ６ｇ，购自浙江省中医院，经本校洪行球
研究员鉴定。药物常规水煎２次，每次４５ｍｉｎ，合并
煎液，浓缩至含生药８００ｇ·Ｌ－１，冰箱内保存待用。
１．３　试剂　三羟甲基氨基甲烷（批号２１０００２６０６）、
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ＳＤＳ（批号２１０００３５６５）、甘氨酸（批号２１０００２７５１）、
丙烯酰胺（批号２１０００２３６８）、甲叉基双丙烯酰胺（批
号２１０００１５３２）、ＤＴＴ（批号 ＬＪ０５０７Ａ１００７Ｊ）、碘乙酰
胺（批号 １９４５Ｂ２８）、固相 ｐＨ梯度胶条 （批号
９２２８０４Ｅ）均购自 ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ公司；２Ｄ
ＱｕａｎｔＫｉｔ蛋白定量试剂盒（批号 ０８０７０３）、２Ｄ
ｃｌｅａｎｕｐ（批号０８０７０１）和 ＣｙｅＤｙｅ荧光染料试剂盒
（批号２１５０１３）均购自ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ公司。
１．４　仪器　ＥｔａｎＴＭ ＩＰＧｐｈｏｒＴＭ等电聚焦电泳仪，Ｅｔ
ｔａｎＴＭＤＡＬＴＳｉｘ垂直板电泳仪，Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００多功能
荧光扫描成像系统，ＤｅＣｙｄｅｒＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ Ｖ６５凝
胶图像分析软件，均为美国 ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ公司产
品。Ｐ８０ＭＸ超速冷冻离心机和ＵＶ８２００分光光度计
为日本日立公司产品。飞行时间串联质谱仪 ＭＡＬ
ＤＩＴＯＦ／ＴＯＦＴＭ Ａｎａｌｙｚｅｒ４８００为美国应用生物系统
公司产品。
２　方法
２．１　模型制备及分组给药　将动物随机分为３组，
每组４只，于室温下饲养，控制空气干湿度，随意饮
水和进食。肾阳虚模型组大鼠（模型组）和温补肾
阳药治疗组（治疗组）切除两侧甲状腺，正常对照组
（正常组），做相应的假手术，但不切除甲状腺。喂
养７ｄ后，模型组和治疗组大鼠出现少食少饮、体重
减轻、反应迟钝、活动减少、拱背耸毛、大便稀溏等症
状，其血清甲状腺激素（ＦＴ３，ＦＴ４）水平下降，说明其
证候符合肾阳虚模型辨证［５］。从第８天开始，治疗
组每天灌胃温补肾阳药 １次，给药剂量 ６７ｇ·
ｋｇ－１，连续６ｄ，另外２组喂饲同样体积的生理盐水。
２．２　肝线粒体蛋白制备　用药后第６天上午断头
处死动物，取肝脏用 ０２５ｍｏｌ·Ｌ－１蔗糖液冲洗 ２
次，在４℃ １０倍体积 ｐＨ７４的清洗缓冲液（０２２
ｍｏｌ·Ｌ－１甘露醇，００７ｍｏｌ·Ｌ－１蔗糖，０５ｍｍｏｌ·
Ｌ－１ＥＧＴＡ，０１％牛血清白蛋白，２ｍｍｏｌ· Ｌ－１
Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ）中匀浆，６００×ｇ离心５ｍｉｎ后取上清，
再经１０３００×ｇ离心１０ｍｉｎ，沉淀物重悬于５ｍＬ清
洗缓冲液中，加到２０ｍＬ含３０％ Ｐｅｒｃｏｌ的纯化液中
（２２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１甘露醇，１ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＥＧＴＡ，２５
ｍｍｏｌ· Ｌ－１ Ｈｅｐｅｓ，０１％ 牛血清白蛋白），于
９５０００×ｇ离心 ３０ｍｉｎ，收集密度在 １０５２～１０７５
ｇ·ｍＬ－１的细胞悬液，加入 ４０ｍＬ清洗缓冲液，于
６３００×ｇ离心 １０ｍｉｎ以去除 Ｐｅｒｃｏｌ。并用 １５０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＫＣｌ和清洗缓冲液分别洗涤２次，加入１
ｍＬ裂解液（３０ｍｍｏｌ·Ｌ－１Ｔｒｉｓ，８ｍｏｌ·Ｌ－１尿素，
４％ＣＨＡＰＳ，ｐＨ８５），４℃孵育２ｈ。置冰上超声，超
声后用１２０００×ｇ离心３０ｍｉｎ，取上清用２Ｄｃｌｅａｎ
ｕｐｋｉｔ去杂质，并用２Ｄ定量试剂盒测定蛋白质浓
度，分装成１０μｇ·Ｌ－１，置－８０℃保存［６］。
２．３　荧光标记蛋白质　将 ＣｙＤｙｅ（Ｃｙ２，Ｃｙ３，Ｃｙ５）
从－２０℃取出，室温放置１０ｍｉｎ，加入２５μＬ二甲
基甲酰胺（ＤＭＦ），涡旋混匀，１２０００×ｇ离心３０ｓ，
取出２μＬ配成２００ｐｍｏｌ·Ｌ－１的工作液，每个样品
各取５０μｇ蛋白质，调节 ｐＨ至８５，分别加入４００
ｐｍｏｌ·Ｌ－１的染料，振荡混匀，冰上避光孵育３０ｍｉｎ，
加入１μＬ１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１赖氨酸中止反应，剧烈振
荡，冰上避光放置１０ｍｉｎ，加入２倍体积缓冲液（８
ｍｏｌ·Ｌ－１尿素，１３０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＤＴＴ，２％ＣＨＡＰＳ，
２％ ｐＨ３～１０的２％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ），冰浴１０ｍｉｎ。
２．４　双向电泳　正常组、模型组和治疗组各４个样
品分别用荧光染料Ｃｙ３，Ｃｙ５标记，上述１２个样品等
量混合用Ｃｙ２标记作为内标，将Ｃｙ２，Ｃｙ３，Ｃｙ５的３个
样品混合，用水化液（８ｍｏｌ·Ｌ－１尿素，２％ＣＨＡＰＳ，１３
ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＤＴＴ，０５％ ＩＰＧｂｕｆｅｒ，０００２％溴酚蓝）定
容到４５０μＬ，制成第一向等电聚焦体系，采用胶内泡
涨的方法上样。１２个样品被加到６条ｐＨ３～１０的非
线性胶条中。等电聚焦的参数：３０Ｖ，１２ｈ；５００Ｖ，１
ｈ；１０００Ｖ，１ｈ；８０００Ｖ，８ｈ。等电聚集后，胶条于平
衡液１（１％ＤＴＴ，５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＴｒｉｓＨＣｌ，６ｍｏｌ·Ｌ－１
尿素，３０％甘油，２％ＳＤＳ，０００２％溴酚蓝）、平衡液２
（４％碘乙酰氨，５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＴｒｉｓＨＣｌ，６ｍｏｌ·Ｌ－１尿
素，３０％甘油，２％ＳＤＳ，０００２％溴酚蓝）中各平衡１５
ｍｉｎ，然后转移到第二向已制好的１２５％ＳＤＳ胶上，用
０５％琼脂糖封顶，进行第二向电泳，电泳参数设定
为：３０Ｗ，４５ｍｉｎ；９０Ｗ，６ｈ。直到溴酚蓝染料迁移至
胶的底部边缘，结束电泳［７］。
２．５　图像扫描分析　荧光标记蛋白经凝胶电泳后
用ＭｉｌｉＱ纯水冲洗数次，在 Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００荧光扫描
仪不同激发光下扫描成像，所用的滤光片和ＰＴＭ电
压如下：Ｃｙ２：Ｂｌｕｅ２（４８８）／６００；Ｃｙ３：Ｇｒｅｅｎ（５３０）／
６８０；Ｃｙ５：Ｒｅｄ（６３３）／５９０。所得的蛋白质组图谱用
ＤｅＣｙｄｅｒＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ Ｖ６５图像分析软件进行点
识别、背景消除、点匹配及差异蛋白质分析。
２．６　胶内酶解及质谱分析　制作一块的制备胶，银
染后切下感兴趣的蛋白质点，置于离心管中，用双蒸
水冲洗后加入 ５０μＬ脱色液 ［５０ｍｍｏｌ· Ｌ－１
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Ｎａ２Ｓ２Ｏ３，１５ｍｍｏｌ·Ｌ
－１Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６］脱色１０ｍｉｎ，双
蒸水冲洗，去除溶液，再用 ２００μＬ２００ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ＮＨ４ＨＣＯ３冲洗，剧烈振荡 １０ｍｉｎ，去除液体后 １００
μＬ乙腈脱水８ｍｉｎ，迅速干燥，估计干胶体积，加入
３倍体积的１２５μｇ·Ｌ－１胰蛋白酶（用２５ｍｍｏｌ·
Ｌ－１ＮＨ４ＨＣＯ３配制），３７℃酶解过夜，酶解后用 １５
μＬ萃取液（Ｈ２ＯＴＦＡ乙腈４５∶５∶５０）萃取２次，合并
萃取液，冷冻干燥后加入１２μＬ的含０１％ＴＦＡ的
洗脱液重新溶解多肽片段，取 ０３μＬ样品点于靶
上，加入等量的饱和基质溶液，进行 ＭＡＬＤＩＴＯＦ
ＴＯＦＭＳ检测，得到肽质量指纹图谱，通过 Ｍａｓｃｏｔ数
据搜索，结合２Ｄ图谱上初步的蛋白质的分子质量、
等电点信息鉴定蛋白质［８］。
３　结果与分析
３．１　大鼠肝线粒体蛋白质组图谱　双向电泳结束
后，每块ＳＤＳＰＡＧＥ胶用４８８，５３０，６３３ｎｍ３种波长
的激发光进行扫描，获得内标图谱，正常组和肾阳虚
模型组大鼠肝线粒体蛋白质组图谱（图１）。
Ａ．内标图谱；Ｂ．正常组；Ｃ．模型组。
图１　各组大鼠肝线粒体蛋白质组图谱
３．２　差异蛋白质分析　所有６块胶扫描所得的蛋
白质组图谱用分析软件 ＤｅＣｙｄｅｒ６５进行分析，Ｇｅｌ
２中被检测到的蛋白质点最多，有１０１８个；所有胶
中平均检测到有９９７个点，其中所有图谱共有的点
有６８７个，蛋白质在图谱中的分布见图２。图谱中１
号蛋白质点的三维图像见图３，如果不同胶中蛋白
质表达量变化的趋势相一致，则该蛋白质表达差异
应该是由实验处理所引起，而不是样品材料和操作
过程所带来的误差。选择在肾阳虚状态下蛋白质表
达的量差异超过１２倍（增加或者降低）的蛋白质
作为差异蛋白。在本实验中，共找到２２个差异蛋
白，其中有１５个蛋白质点在肾阳虚动物中表达量增
高，而有７个蛋白质点表达量降低（表１），这些蛋白
质在图谱中的分布见图２。
Ａ．正常组；Ｂ．肾阳虚模型组；Ｃ．温补肾阳药组。
图２　各组大鼠肝线粒体蛋白质组差异分析
３．３　质谱分析　 对２２个差异蛋白质进行质谱鉴
定显示，热休克蛋白６０、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧
化物、氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ，ＡＴＰ合成酶、乳铁传递
蛋白、ＡＴＰ酶质子通道蛋白、电子传递黄素蛋白和类
钙离子激活中性蛋白酶１２在肾阳虚状态下表达量
增加，但二氢硫辛酰胺支链酰基转移酶、脂酰辅酶Ａ
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图３　１号蛋白质点的三维图
表１　差异蛋白质的质谱鉴定结果
Ｎｏ 蛋白质 相对分子质量 等电点
表达量比值
（模型／正常）
表达量比值
（治疗／模型）
１ 氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ １６４４７５５ ６３３ １６０ －１３５
２ ｓｉｍｉｌａｒｔｏＦＭＲ２ｐｒｏｔｅｉｎ １０５８８６０ ９２１ １３６ １０２
３ 乳铁传递蛋白 ７７８５７０ ８８３ １３２ １２６
４ 热休克蛋白６０ ６０９６７０ ５９１ １９８ －１２６
５ 过氧化氢酶 ５９７１９５ ７０７ １４５ １６０
６ 末命名蛋白质 ５７８８９７ ５３５ －１２６ １３６
７ 甲基丙二酸半醛脱氢酶 ５７７７０６ ８４７ １８０ －１２０
８ 二氢硫辛酰胺支链酰基转移酶 ５３４２５０ ８７１ －１３６ １２８
９ 类钙离子激活中性蛋白酶 １２５０３６５４ ７５６ １５６ －１４５
１０ 鸟氨酸转氨酶 ４８３０２０ ６５３ －１４２ １２３
１１ 脂酰辅酶Ａ脱氢酶 ４４７３７０ ８４７ －１６０ １１３
１２ ＧＴＰ结合调节蛋白 ４２１２６３ ５５６ －１５２ １２４
１３ ｓｉｍｉｌａｒｔｏｓｔｏｍａｔｉｎｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ ２３８３９０２ ８７４ １２７ １１３
１４ ３羟基丁酸脱氢酶 ３８３２２３ ８９３ －１２６ １１１
１５ 末命名蛋白质 ３７２１６９ ５４８ １６２ １２０
１６ 电子传递黄素蛋白 ３４９２９５ ８６２ １３５ １２４
１７ 酯酶同工酶ＥＳ １２８１５４８ ９１１ １３３ －１１６
１８ ＡＴＰ合成酶亚基质子通道蛋白 ２５６３９４ ７０３ １５８ １３６
１９ 谷胱甘肽过氧化物酶 ２２２５２３ ７７０ １５０ １６０
２０ ＡＴＰ合成酶亚基 １８７６９６ ５７８ １４５ １２１
２１ ｓｉｍｉｌａｒｔｏＲＩＫＥＮｃＤＮＡ４９３０５８９Ｍ２４ １７８６６７ ８４７ １６８ －１２５
２２ ｓｉｍｉｌａｒｔｏＰＫＣＩ１ｒｅｌａｔｅｄＨＩＴｐｒｏｔｅｉｎ １７３７８３ ９４６ －１２９ －１０３
脱氢酶、鸟氨酸转氨酶和ＧＴＰ结合调节蛋白在肾阳
虚状态下表达量降低。经温补肾阳药治疗后，热休
克蛋白６０、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物、ＡＴＰ合
成酶、乳铁传递蛋白、ＡＴＰ酶质子通道蛋白、电子传
递黄素蛋白二氢硫辛酰胺支链酰基转移酶、脂酰辅
酶Ａ脱氢酶和 ＧＴＰ结合调节蛋白表达量均增加。
但氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ和类钙离子激活中性蛋白酶
１２表达量减少（表１）。
４　讨论
本研究采用手术切除大鼠甲状腺，喂养７ｄ后
大鼠出现少食少饮、体重减轻、反应迟钝、活动减少、
拱背耸毛、大便稀溏等，其症状和体征符合肾阳虚
证。
笔者提取正常大鼠、肾阳虚模型及温补肾阳药
治疗后大鼠肝线粒体蛋白质进行差异蛋白质组分
析，共找到２２个差异蛋白质，并对这２２个蛋白质进
行质谱鉴定，１６个蛋白质功能与功能已确定，其中
氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ、过氧化氢酶、类钙离子激活中
性蛋白酶１２、酯酶同工酶ＥＳ１、甲基丙二酸半醛脱氢
酶、热休克蛋白６０、乳铁传递蛋白、ＡＴＰ酶质子通道
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蛋白、电子传递黄素蛋白、ＡＴＰ合成酶、谷胱甘肽过
氧化物酶表达量增加，而二氢硫辛酰胺支链酰基转
移酶、脂酰辅酶Ａ脱氢酶、鸟氨酸转氨酶、ＧＴＰ结合
调节蛋白、３羟基丁酸脱氢酶表达量降低。另外 ６
个为未知蛋白，动物切除甲状腺后，甲状腺皮质激素
分泌受抑，导致机体各种代谢功能紊乱，机体在应对
不利反应时，热休克蛋白６０表达明显增加，保护细
胞免受损伤，维护其正常生理功能。
肾阳虚动物糖代谢和脂肪代谢障碍表现为二氢
硫辛酰胺支链酰基转移酶和脂酰辅酶 Ａ脱氢酶表
达量降低，导致肾阳虚动物三羟酸循环和脂肪酸 β
氧化障碍。
肾阳虚动物由于糖代谢和脂代谢发生障碍，促
使蛋白质代谢增强，表现为甲基丙二酰半醛脱氢酶
和氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ合成增加，甲基丙二酸半醛
脱氢酶是缬氨酸代谢过程中的关键酶，氨甲酰磷酸
合成酶Ⅰ是尿素合成的限速酶，是尿素合成的关键
酶，尿素合成主要功能是将氨基酸分解产生的氨合
成无毒的尿素，防止出现氨中毒。因此甲基丙二酰
半醛脱氢酶和氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ合成增加，可以
说明氨基酸分解代谢加速，因此肾阳虚动物蛋白质
分解代谢增强。
肾阳虚动物由于物质代谢紊乱，蛋白质氧化分
解速度增加，可产生一定量的自由基和过氧化物。
因此机体抗氧化防御体系被激活，过氧化氢酶及谷
胱甘肽过氧化物酶表达增加，在一定程度上避免线
粒体因脂质过氧化作用而受到损伤。肾阳虚动物糖
和脂肪代谢障碍引起的能量代谢不足一方面可以通
过增加蛋白质代谢得以部分补偿。另一方面肾阳虚
动物乳铁传递蛋白、ＡＴＰ酶质子通道蛋白、电子传递
黄素蛋白、ＡＴＰ合成酶表达均增加，加快呼吸链电子
传递和ＡＴＰ的生物合成，也从另一个方面缓解了能
量代谢的不足。
经温补肾阳药治疗后，肾阳虚动物物质与能量
代谢均得到了改善，主要表现在如下几个方面：①温
补肾阳药治疗后，动物肝线粒体中二氢硫辛酰胺支
链酰基转移酶表达上升，有助于代谢物加快分解，有
助于糖酵解产物丙酮酸走向柠檬酸循环彻底氧化分
解，为机体生命活动提供能量。②肾阳虚动物经温
补肾阳药治疗后甲基丙二酰半醛脱氢酶和氨甲酰磷
酸合成酶Ⅰ表达下降，因而蛋白质质代谢可能有所
减缓。③温补肾阳药治疗后，肾阳虚大鼠 Ａ乳铁传
递蛋白、ＡＴＰ酶质子通道蛋白、电子传递黄素蛋白、
ＡＴＰ合成酶表达均增加，氧化磷酸化速度加快，ＡＴＰ
合成速度加快，以满足机体能量的需求。④经温补
肾阳药治疗后肾阳虚动物细胞防御损伤能力加强
了，主要表现为热休克蛋白６０、过氧化氢酶和谷胱
甘肽过氧化物酶表达量继续增加，可以维持细胞膜
的稳定性，避免线粒体因脂质过氧化作用而受到损
伤。
此外，在本实验中还检测到肾阳虚动物类钙激
活中性蛋白酶表达上升，ＧＴＰ结合的蛋白质表达量
下调。ＧＴＰ结合的蛋白质参与细胞的多种生命活
动，如细胞通讯、核糖体与内质网的结合、小泡运输、
蛋白质合成等［９］。因此，肾阳虚动物钙激活蛋白酶
１２表达增加，ＧＴＰ结合蛋白表达量下降，可能引起
动物信号转导异常，经温补肾阳药治疗后，这２个酶
表达均有改善，说明温补肾阳药可能通过改善和维
护细胞正常的信息转导从而起到治疗作用。
除此之外，本实验中还发现６个未知蛋白，其中
４个蛋白质序列分别与 ＲＩＫＥＮｃＤＮＡ４９３０５８９Ｍ２４，
ＦＭＲ２ｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＫＣＩ１ｒｅｌａｔｅｄＨＩＴｐｒｏｔｅｉｎ，ｓｔｏｍａｔｉｎ
ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ２高度同源，这几个蛋白质功能还需进
一步确定。
综上所述，在甲状腺切除后，动物能量机体产生
应激反应，引起热休克蛋白表达增加，从而起到保护
细胞免受损伤，促使细胞恢复正常的结构和机能。
肾阳虚动物糖类和脂类物质分解代谢受阻，从而导
致肾阳虚动物临床虚寒症状，机体可以通过加强蛋
白质分解代谢和提高氧化磷酸化能力来缓解能量代
谢的不足。由于蛋白质代谢加快，氨的生成增加，促
进鸟氨酸循环。经温补肾阳药治疗后，糖类、脂类和
蛋白质代谢紊乱状态得到调节，另外，本实验还提示
温补肾阳药还可能通过改善和维护细胞正常的信息
转导而起到治疗作用。
［参考文献］
［１］　沈自尹．肾阳虚证的定位研究［Ｊ］．中国中西医结合杂志，
１９９７，１７（１）：５０．
［２］　赵伟康，周志东，金国琴．老年期肾阴阳虚损大鼠的线粒体能
量代谢及其调控机制的研究［Ｊ］．中国中医基础医学杂志，
２００１，７（３）：３１．
［３］　陆　明，严石林，丁维俊，等．家族性肾阳虚寒证与糖、蛋白、脂
质代谢相关性探讨［Ｊ］．现代中西医结合杂志，２００５，１４（６）：
７０１．
［４］　卢德赵，沃兴德，施孟如，等．激素型肾阳虚动物肝线粒体蛋白
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第３４卷第１０期
２００９年５月
　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　１０
　 Ｍａｙ，２００９
质组与能量代谢相关性研究［Ｊ］．中国生物化学与分子生物学
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ｓｏ，ｂａｗａｎｏｌａｎｄｍｅｔｈａｎｏｌ，ａｎｄｉｔｓｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｙａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓｉｎ
ｈｕｍａｎｐｌａｃｅｎｔａｌｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ［Ｊ］．ＴｏｘｉｃｏｌＩｎＶｉｔｒｏ，２００２，６：
６４９．
［７］　ＫａｒｐＮＡ，ＫｒｅｉｌＤＰ，ＬｉｌｅｙＫＳ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｃｈａｎｇｅｉｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｉｔｈＤｅＣｙｄｅｒＴＭ ｄｕｒｉｎｇａｐａｉｒｗｉｓｅ
ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｕｓｉｎｇｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｄｉｆｅｒｅｎｃｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００４，４：１４２１．
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ａｎａｌｙｓｉｓｏｆＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓｒｅｃｏｖｅｒｉｎｇｆｒｏｍγｉｒａｄｉａｔｉｏｎ
［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００５，５：１３８．
［９］　ＮａｋａｚａｔｏｎＭ．Ｇｕａｎｙｌｉｎｆａｍｉｌｙｎｅｗｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｐｅｐｔｉｄｅｓｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ
ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅａｎｄｗａｔｅｒｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ［Ｊ］．ＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒａｌ，２００１，３６
（２）：２１９．
Ｅｆｅｃｔｓｏｆｗａｒｍａｎｄｔｏｎｉｆｙｋｉｄｎｅｙｙａｎｇｈｅｒｂｓｏｎｌｉｖｅｒｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ
ｐｒｏｔｅｏｍｅｏｆｋｉｄｎｅｙｙａｎｇｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｒａｔｓ
ＬＵＤｅｚｈａｏ，ＷＯＸｉｎｇｄｅ，ＷＯＬｉｋｅ，ＬＩＹｉ，ＴＡＮＧＬｉｈｕａ，ＹＡＮＧＺｈｅｎ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＺｈｅｊｉａｎｇＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００５３，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｗａｒｍａｎｄｔｏｎｉｆｙｋｉｄｎｅｙｙａｎｇｈｅｒｂｓｏｎｔｈｅｌｉｖｅｒｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｐｒｏｔｅｏｍｅｏｆｔｈｅｔｈｙ
ｒｏｉｄｅｃｔｏｍｉｚｅｄｋｉｄｎｅｙｙａｎｇｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｒａｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｗｅｌｖｅｒａｔｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ，ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐａｎｄｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐ；ｅａｃｈ
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ａｐｐｅａｒｅｄｔｈｅｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆｋｉｄｎｅｙｙａｎｇｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｆｒｏｍｔｈｅｅｉｇｈｔｈｄａｙ，ｔｈｅｒａｔｓｏｆｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐｗｅｒｅｆｅｄｗａｒｍａｎｄｔｏｎｉｆｙｋｉｄｎｅｙｙａｎｇ
ｈｅｒｂｓ６．７ｇ·ｋｇ－１ｏｎｃｅｄａｉｌｙ，ａｎｄｔｈｅｒａｔｓｏｆｏｔｈｅｒｔｗｏｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｆｅｄｔｈｅｅｑｕａｌｎｏｒｍａｌ．Ａｌｒａｔｓｏｆｔｈｒｅｅｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｋｉｌｅｄｂｙｄｅｃｏｌ
ｌａｔｉｏｎａｆｔｅｒｓｉｘｄａｙｓｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａｎｄｌｉｖｅｒｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄ．Ｅａｃｈｌｉｖｅｒｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｐｒｏｔｅｉｎｓａｍｐｌｅｗａｓｌａｂｅｌｅｄ
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ａｆｔｅｒｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．ＡｌｉｍａｇｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙＤｅＣｙｄｅｒ６．５ｓｏｆｔｗａｒｅ，ａｎｄｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｕｍ．
Ｒｅｓｕｌｔ：ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＳＰ６０，ｃａｔａｌａｓｅ，ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅⅠ，ＡＴＰｓｙｎｔｈａｓｅ，ｌａｃｔｏｔｒａｎｓ
ｆｅｒｉｎ，Ｈ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇｔｗｏｓｅｃｔｏｒＡＴＰａｓｅ，ａｌｐｈａＥＴＦａｎｄｃａｌｐａｉｎ１２ｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅｔｈｙｒｏｉｄｅｃｔｏｍｉｚｅｄｋｉｄｎｅｙｙａｎｇｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ
ｒａｔｓ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｏｘｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＡｃｙｌＣｏＡｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ｏｒｎｉｔｈｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ａｎｄＧＴＰｂｉｎｄｉｎｇ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ａｆｔｅｒｔｈｅｋｉｄｎｅｙｙａｎｇｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｒａｔｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｗａｒｍａｎｄｔｏｎｉｆｙｋｉｄｎｅｙｙａｎｇｈｅｒｂｓ，ｔｈｅｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＳＰ６０，ｃａｔａｌａｓｅ，ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ｏｘｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＡｃｙｌＣｏＡｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＡＴＰｓｙｎｔｈａｓｅ，ｌａｃｔｏ
ｔｒａｎｓｆｅｒｉｎ，Ｈ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇｔｗｏｓｅｃｔｏｒＡＴＰａｓｅ，ａｌｐｈａＥＴＦａｎｄＧＴＰｂｉｎｄｉｎｇｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅⅠａｎｄｃａｌｐａｉｎ１２ｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｗａｒｍａｎｄｔｏｎｉｆｙｋｉｄｎｅｙｙａｎｇｈｅｒｂｓｐｅｒｆｏｒｍｉｔｓ
ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｅｆｅｃｔｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｃｅａｎｄｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅｓｉｇｎａｌｃｏｎ
ｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｃｅｌｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　ｐｒｏｔｅｏｍｅ；ｋｉｄｎｅｙｙａｎｇｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ；ｗａｒｍａｎｄｔｏｎｉｆｙｋｉｄｎｅｙｙａｎｇｈｅｒｂｓ；ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ
［责任编辑　古云侠］
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