全 文 ：葶苈子的 4EFG指纹图谱分析
黄佩蓓!! 崔亚茹+! 李思光+! 曹岚)
-江西中医学院 基础医学院! 江西 南昌 ))$$$&%
+-南昌大学 生命科学与食品工程学院! 江西 南昌 ))$$)%
)-江西中医学院 药学院! 江西 南昌 ))$$$&#
$摘要%!目的&研究葶苈子的I;4指纹图谱$初步探讨 4EFG分子标记技术在葶苈子鉴别上的应用( 方法&采用 4EFG
分子标记技术$对中药葶苈子及其常见混淆品荠菜和印度菜进行基因组I;4多态性分析( 结果与结论&选用 # 对P.<>:=
@$+:引物进行扩增$共检测到清晰条带 )&# 条( 其中多态性条带 )$) 条$特异性条带 %* 条$多态率达 *#f(g( 每对引物
组合中样品均扩增出自己的特征带$引物利用率为 $$g( 丰富的特异性条带组合可作为样品鉴定的依据( 此外$利用 _G5
L49法构建样品间聚类图谱$聚类结果显示南%北葶苈子首先聚为葶苈子类$然后再和荠菜聚在一起$在遗传上两者有着较近
的亲缘关系$印度菜单独聚为一类(
$关键词%!葶苈子) 4EFG) I;4指纹图谱
$稿件编号%!+$$$*$$&
$基金项目%!江西省教育厅项目!+$$$*$+&+
$通信作者%!!黄佩蓓$副教授$硕士生导师$主要研究方向为药学
生物化学$NQV#!$%*%((&($H50BRV#???AQR3@/0-./0
!!葶苈子为十字花科植物独行菜 F+E;A;)*&E+&0
()*ZRVU-和播娘蒿 3+$.)%&;-;& $Q7GCB2@V-的干燥成熟种子$前者习称.北葶苈子/$
后者习称.南葶苈子/( 葶苈子有泻肺平喘%利水消
肿之功效$临床主要用于冶疗痰饮喘咳%水肿胀满%
小便不利等症( 因葶苈子与同科属植物种子形态细
小$不易区分$经常误收误用导致葶苈子品种的混
乱$同时也影响了临床用药的安全性*+ ( 尽管形态
性状的观察与红外光谱技术*++已用于葶苈子鉴定$
但由于限制因素较多!如检测效率水平低$组织特
异性强等都尚不能作为理想的鉴定工具( 因此$
建立准确%简单%高效的检测方法鉴别葶苈子及其混
淆品是必要的(
目前$4EFG分子标记技术已用于人参*)+ %白
术*&+等中药种质资源的多态性分析和鉴定$但尚未见
采用4EFG技术对葶苈子进行分析研究的报道( 基
于此$本实验采用4EFG技术分析葶苈子及其常见混
淆品荠菜和印度菜的 I;4指纹图谱$初步探讨
4EFG分子标记技术在中药葶苈子鉴别上的应用(
!材料与方法
]!材料!本实验采用的播娘蒿 3/$采自安徽风阳$硅胶干燥保存)独行菜 F/&E+&()*
份$采自北京郊区$硅胶干燥保存)荠菜>&E$+(& ,)%0
$&0E&$<%;$!F- 9QUR.和印度菜 3<%;EE& ;-A;.&
!F- JRQC2各 份$采自江西中医学院阳明校区内$
样品先置于冰盒内$之后放 d%$ h冰箱内保存备
用( 所有材料均由江西中医学院中药鉴定教研室赖
学文教授鉴定$取样部位为 & 份样品各 株的新鲜
嫩叶片(
]!基因组I;4提取!称取播娘蒿%独行菜%荠菜
和印度菜新鲜嫩叶片样品各 $f$ D$经液氮深冻
处理后在液氮中迅速研磨成粉末状$转入 f 0F离
心管( 参照9WCB6与 N?/0AS/2 的 基因组I;4(
]&!4EFG技术!采用鼎国北京生物有限公司
4EFG分析试剂盒$用限制性内切酶 P.<>:和 @$+:
进行基因组双酶切$然后将酶切片段与相应的人工
接头连接( P.<>:上游接头为#p5L<4LNL4LN<<4N5)p( 在预扩增G<>中P.<>:和@$+:预扩增引
物序列分别为# p5L4L4NL4LN<对选择引物组合进行扩增$选择引物是在预扩增引
物 )p末端添加 ) 个选择性碱基( 实验操作方法按试
剂盒说明书进行$得到的选择扩增产物经 #g变性
-#-
第 ) 卷第 * 期
+$$ 年 月
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9B6$ +$$
聚丙烯酰胺凝胶电泳$仪器为 4M:)%% 自动测序仪(
& 份样品的4EFG分析实验重复 ) 次(
]Y!数据处理!利用 LH;H8<4;)f 软件和
MR2@?QCQ软件将扫描得到 I;4指纹图谱转换为原
始数据矩阵$按扩增条带的有无进行标记$有带的记
为 $无带的记为 $( 用;N8K8A.5+fE软件求相似
系数矩阵并采用_GL94法构建样品聚类图谱(
!结果分析
]!基因组I;4提取!利用 基因组 I;4$跑 $f#g琼脂糖凝胶电泳( 基因组
I;4条带明亮整齐$纯度较高$为下游的选择扩增
的成功奠定了基础(
]!4EFG的选择性扩增 本研究随机选择了 #
对引物组合对样品进行选择性扩增$扩增产物共检
测到清晰可见带 )&# 条!图 $平均每对引物组
合扩增条带 (& 条( 其中多态性条带 )$) 条$占总
扩增带数 *#f(g$平均每对引物扩增多态性条带 (
条( # 对引物组合中 号引物组合扩增位点数最
多$共扩增位点 # 个!表 ( 其中多态性位点 &
!!
个$多态率为 *(f+%g( 扩增位点数量最少的是 )
号引物组合$扩增位点 #$ 个$多态性位点 * 个$多
态率为 *(f))g( 以上数据表明$不同引物组合虽
然扩增产物的多态位点数差别较大$但整体上表现
出很高的多态率$说明 4EFG技术适用于葶苈子及
其混淆品的药材鉴定研究(
j&f号引物) j(f+号引物)* j+f)号引物)) j#-&号引物)
% j+$-号引物)+ j+&f#号引物)+ j+(f%号引物)每组引物依次
对南葶苈子%北葶苈子%荠菜%印度菜扩增(
图 !%对选择扩增引物扩增出的4EFG指纹图谱
表 !#对4EFG引物扩增的结果
引物组合序号 选择碱基!P.<>:=@$+: 扩增条带 多态性条带 多态率=g
44<5<44 # & *(f+%
+ 44<5<4< (* (% *%f%
) 44<5& 44<5 44L5<44 %) %) $$
# 44L5<4L #( #% *(f)
% 44L5( 4<45<44 *& (% *+f
* 4$ 4<<5<44 $ $+ *%f&
4<<5<4< % %& *(f#%
+ 4<<5<4L *) *$ *#f%%
) 4<<5& 4<<5 4# 4]&!扩增产物特异性分析
实验选用的 # 对引物组合共扩增出特异性条带
%*条!表 +$平均每对引物组合扩增特异性条带 &%
条( $号引物组合扩增特异条带 #&条$是所有引物中
扩增特异性条带最多的( 由表 + 还可以看出$每对引
物组合中样品均有自己大量的特征带( 印度菜最
多$达 +))条$荠菜有 +* 条$北葶苈子有 #+ 条$南葶
苈子拥有特征带最少$仅为 & 条( 利用每对引物组
合产生的4EFG指纹图谱就可将葶苈子明确地区分开
来$引物有效率为 $$g( 例如$利用 H54-%-
第 ) 卷第 * 期
+$$ 年 月
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9B6$ +$$
引物组合构建的指纹图谱前 $ 个位点就可将各样品
全部区分( 南葶苈子指纹图谱为*$$+$荠菜为
*$$+( 在这 $个位点中$有 & 个位点表现出
差异性$故可将两者完全区分( 丰富的特异性条带组
合为样品鉴别提供了分子生物学依据$同时也说明了
4EFG技术适于葶苈子的分析鉴定(
表 +!各样品的特异条带数
引物序号 南葶苈子 北葶苈子 荠菜 印度菜 总数
* & * $ +
+ & # ( +( #
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]Y!聚类分析
用;N8K8软件计算样品间的遗传相似系数$再利
用_GL49法得到样品聚类图谱!图 +( 结果显示$南
葶苈子与北葶苈子的相似系数值最高$为 $f)*# *( 说
明两者在遗传上虽然亲缘关系最近$但仍存在着明显
的遗传变异$这一结论与传统的系统学分类相吻合(
遗传相似系数最低的是荠菜和印度菜$为 $f)+# $是
各样品间亲缘关系最远的(
由聚类图可以看出聚类结果可分为两大类$葶苈
子和荠菜聚为一类$印度菜独立为一类( 表明葶苈
子和荠菜有着较近的遗传关系$而与印度菜遗传关
系较远( 这一现象可能是由于在早期的选择进化中$
环境等外界条件的改变使印度菜首先出现新的变异
之后$而后葶苈子和荠菜才开始向不同方向分化的
结果(
图 +!据遗传相似系数用_GL49法得到样品的聚类图
&!讨论
本研究利用4EFG技术研究了葶苈子及其混淆品
的I;4指纹图谱$综上实验结果$可以看出实验扩增
得到了大量的多态性条带和特异性条带$且每对引物
组合扩增的特异性带均可将各样品准确区分开来$引
物利用率为 $$g( 实验重复 )次可得到相同的结果(
实验数据表明4EFG技术应用于葶苈子中药材的鉴定
是可靠的$具有可行性( 根据数据分析得到的样品间
遗传相似系数可以看出$南葶苈子和北葶苈子间的亲
缘关系是最近的$但仍存在着明显的遗传变异( 相关
研究也已证实南北葶苈子的化学成分差异较大( 例
如$槲皮素5)5!5)535吡喃葡萄糖基5%5!5)5龙胆双糖
苷为南葶苈子比较稳定的特征性成分$而该成分并不
存在于北葶苈子中*#+ (
$参考文献%
*+!楼之芩$秦波-常用中药材品种的整理和质量的研究*9+-北京#北
京医科大学中国协和医科大学联合出版社$**##&#-
*++!马梅芳$吕伟$高宇源-现代分析手段在葶苈子鉴别中的应用*X+-
江西中医学院学报$+$$$%!#$-
*)+!罗志勇$周钢$周肆清$等-4EFG法构建人参%西洋参基因组I;4
指纹图谱*X+-药学学报$ +$$$$)!(##+#-
*&+!王志安$徐行 $沈晓霞$等-白术种质4EFG指纹图谱分析体系的建
立和应用*X+-中药材$+$$($)!&#&()-
*+!9WCB69L$N?/0AS/2 ZE->BARU RS/VB@R/2 /T?RD? 0/VQ.WVBC,QRD?@
AVB2@I;4*X+-;W.VQBC4.RUS>QS$ *($$ (#&)++-
*#+!王爱芹$王秀坤$赵海誉$等$南葶苈子化学成分与质量研究*X+-中
国药物与临床$ +$$$!#-
$责任编辑!吕冬梅%
-(-
第 ) 卷第 * 期
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