全 文 ：农业生物技术科学
ChineseAgriculturalScienceBuletinVol.24No.62008June
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第一作者简介：王磊，男，1982年出生，在读硕士，主要从事分子生物技术研究工作。通信地址：071001河北农业大学园艺学院。E-mail：5300wan-
glei@163.com。
通讯作者：张学英，女，1972年出生，博士，副教授，主要从事果树育种研究工作。通信地址：071001河北农业大学园艺学院。E-mail：zhxy97421@yahoo.
com.cn。
收稿日期：2008-03-19，修回日期：2008-04-21。
适合山杏AFLP分析的DNA提取方法研究
王 磊 1,张学英 1,葛会波 2
（1河北农业大学园艺学院，保定071000；2河北省林业局，石家庄050081）
摘 要:以山杏幼叶为材料,比较了4种DNA提取方法。结果表明,处理为100mmol/LTris2HCl(pH8.0)、
20mmol/LEDTA(pH8.0)、1.4mmol/LNaCl、2%CTA、10mmol/LNa2S2O5、2%β-巯基乙醇、1%PVP-40、
1%Vc的 CTAB4方法提取的基因组总 DNA质量较高,DNA溶液无色透明,紫外分光光度计测得
OD260/OD280为1.8~2.0,无降解现象,RNA去除干净,经AFLP分析条带清晰,多态性好,说明此法提取的
DNA能够适应AFLP分析的要求。
关键词:AFLP;山杏;DNA提取
中图分类号:S662.2 文献标识码:A
DNAExtractionMethodforAFLPAnalysisinArmeniacasibiric
WangLei1,ZhangXueying1,GeHuibo2
(1AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071000;2ForestryBureauofHebeiProvince,Shijiazhuang050081)
Abstract:ThegenomicDNAsamplesoftenderleavesofArmeniacasibiricisolatedbyfourdiferentmeth-
ods.Theresultsshowed:DNAoftenderleavesbyCTAB4whichwasmadeupof100mmol/LTris2HCl(pH8.0)
+20mmol/LEDTA(pH8.0)+1.4mmol/LNaCl+2%CTA+10mmol/LNa2S2O5+2%β-Mercaptoethanal+1%
PVP-40+1%Vcwaspure,integral,thevalueofOD260/OD280was1.80to2.0,degradationwasnearlyfree,
theRNAwaseliminatedcompletely.AFLPanalysisindicatedtheprimerproducedclearpolymorphicpat-
terns.ThereforethismethodcouldbeusedforextractingidealDNAsamplesandsuitableforAFLP.
Keywords:AFLP,Armeniacasibiric,DNAextracting
应用于果树种质资源和育种研究的分子标记技术
主要包括RFLP、RAPD、SSR、ISSR、AFLP，其中AFLP
技术近年来发展很快。由于该技术具有快速、稳定，且
具有多态性检出率高，灵敏度高，重复性好等优点，被
认为是较为理想和有效的分子标记方法 [1]。山杏（Ar-
meniacasibiric(L.)Lam.）是中国北方干旱山地丘陵区
特有的经济林树种，具有蓄水、保持水土、医疗保健、食
用等多种用途。近年来对山杏的研究越来越受到人们
的重视，但仍停留在栽培造林[2~4]、选种[5,6]、生理习性研
究 [7]等方面，在分子水平上的分析较少，关于利用
AFLP技术对山杏资源的研究还未见报道。为此，笔者
对山杏叶片基因组总DNA的提取方法进行了研究，
获得了较适合山杏AFLP分析用的DNA提取方法，为
今后利用AFLP技术对山杏资源进行研究奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
试验材料取自于河北张家口及承德地区，于2007
年4月下旬采集新鲜、幼嫩的叶片，装入塑料袋放入冰
壶中。带回实验室后，置于-70℃冰箱内备用。
1.2试验方法
1.2.1DNA提取液的处理 试验对山杏幼叶基因组
DNA提取缓冲液的配制设计了 4个处理，分别为
CTAB1：100mmol/LTris2HCl(pH8.0)、20mmol/LEDTA
(pH8.0)、1.4mmol/LNaCl、2%CTA；CTAB2：CTAB1+
10mmol/L Na2S2O5；CTAB3：CTAB1 +10mmol/L
Na2S2O5+2% β-巯 基 乙 醇 ；CTAB4：CTAB1+
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农业生物技术科学
中国农学通报 第24卷 第6期 2008年 6月
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表1不同处理方法提取DNA的纯度
处理
CH01 CH02
OD260
0.1743
0.2096
0.1962
0.2162
OD280
0.0913
0.0976
0.1030
0.1143
OD260/OD280
1.9101
2.1471
1.9054
1.8905
OD260
0.1664
0.2110
0.1987
0.2189
OD280
0.0861
0.0998
0.1017
0.1173
OD260/OD280
1.9323
2.1136
1.9554
1.8663
CTAB1
CTAB2
CTAB3
CTAB4
10mmol/LNa2S2O5+2%β-巯基乙醇+1%PVP-40+
1%Vc
1.2.2DNA的提取方法
（1）取1g左右幼嫩叶片，放入预先冷冻的研钵中，
加入液氮，研磨成细粉状，再迅速将粉末转移至10ml
离心管中。
（2）加入4ml已预热至65℃的CTAB提取液，在
磁力搅拌器上充分混匀后置于 65℃水浴锅中水浴
20~30min，并不时混匀3～4次。
（3）取出离心管后冷却至室温，加入等体积氯仿/
异戊醇 (24:1，v/v)混合液，轻轻摇动混匀，配平，经
8000r/min，16℃离心15min，再将上清液用剪尖枪头吸
出转至另一个10ml离心管中。
（4）用等体积的氯仿/异戊醇(24:1，v/v)再抽提一
次，8000r/min，4℃离心15min，吸出上清夜，加入冰冻
无水乙醇，轻轻混匀，可见丝状或絮状沉淀，即为DNA
粗提物。在冰浴中冷却粗提物并颠倒数次至上下液面
一致可增加DNA产量。
（5）挑出成团的 DNA，放入 1.5ml离心管中，用
70%乙醇浸泡2~3h，中间更换2~3次。风干，让乙醇尽
可能挥发完全，加TE至600μl到DNA完全溶解。
（6）向 DNA溶解液中加入 10mg/mlRNase液
6μl，37℃消化 30min；加等体积的苯酚 /氯仿(1:1，
v/v)，充分颠倒混匀；10000r/min，4℃，离心10min。
（7）取上清液至另一1.5ml离心管中，加等体积的
氯仿/异戊醇(24:1，v/v)，充分混匀，10000r/min，4℃离
心10min；取出上清液，加入冰冷无水乙醇轻轻混匀，
可见成团的 DNA出现，挑出纯化后的 DNA，用 70%
乙醇洗3次。
（8）DNA风干后加适量的TE(pH8.0)溶解，并放入
-20℃冰箱中待用。
1.2.3琼脂糖凝胶电泳检测 取2μl提取的DNA原液
加3μl溴酚兰，在1%的琼脂糖凝胶(含 0.5μg/ml溴
化乙锭)，0.5倍TBE电泳缓冲液，80V的电压下进行
电泳。待溴酚兰迁移至胶的2/3时停止电泳，取出凝
胶，在紫外透射分析仪上观察电泳条带，观察DNA是
否降解、是否含有杂质以及RNA是否去除干净。
1.2.4紫外分光光度法检测 取DNA原液3μl稀释至
300μl用DU800Spectrophotometer型紫外分光光度
计测定 260nm和 280nm的吸光值，根据 OD260与
OD280的比值判断DNA大致纯度，仪器显示的浓度与
稀释倍数的乘积，计算出DNA的实际浓度。
1.2.5AFLP分析 模板DNA的限制性酶切和接头连
接，按照Lifetechnologies公司的 AFLP核心试剂盒
(Cat.No.:10482-016)产品说明书进行；预扩增反应、选
择性扩增、PAGE电泳及银染检测参考何淑娟[8]提供的
方法来操作。
2结果与分析
2.1紫外分光光度法
作为高质量的 DNA的 OD260/OD280值应在
1.8~1.9，从表1中可看出，CTAB4法的OD260/OD280值
均在1.8~1.9之间，且提取的 DNA均为白色絮状沉
淀，溶液清亮，无粘稠感，说明DNA溶液中基本无蛋
白质、RNA、多糖和酚类等杂质的污染，纯度较好，而
其它3种处理的OD260/OD280值不符合高质量DNA
的要求。
2.2叶片DNA的电泳检测
将CH01、CH02两个山杏类型的叶片 DNA经琼
脂糖凝胶电泳检测，结果见图1，从图中可看出，用前3
个处理得到的电泳有明显的拖尾，说明DNA完整性
差且点样孔发亮，证明提取的DNA不纯，而用CTAB4
法提取的2份山杏品种DNA主带清晰，无降解现象，
RNA去除干净。这与紫外分光光度计的定量分析结果
相一致。
采用上述筛选出的提取方法CTAB4，对22份山
杏种质材料进行DNA提取，所提取的DNA均为透明
丝状，经紫外分光光度计检测，结果 OD260/OD280值均
在1.8~2.0之间，且浓度较高，经琼脂糖凝胶电泳检测，
主带清晰，无降解现象，RNA去除干净。
2.3AFLP分析
为了验证 CTAB4法提取 DNA样品进行 AFLP
反应的适用性，将上述所提取的 DNA在引物组合
（E-ACA/M-CCA）下进行AFLP反应。所获得的AFLP
电泳图谱，条带清晰，分布均匀，多态性好。由此可知，
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农业生物技术科学
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改良的 CTAB法提取的山杏叶片基因组 DNA质量
好，纯度高，完全适于AFLP分析。
3讨论
对于AFLP而言，模板DNA的制备是非常重要的
一个基础环节，它的好坏直接关系着试验的成败。
DNA中含多糖、多酚、色素等会严重影响DNA聚合酶
的活性，导致DNA的不可溶解，不利于下一步的PCR
操作，有时甚至会抑制PCR扩增反应的进行[9]。CTAB
法操作虽较复杂，但提取的DNA产量高，多糖和蛋白
含量低，适用于含多糖较多的植物DNA的提取[10]。王
卓伟等[11]在研究桑叶总DNA提取过程中发现，PVP能
有效去除多糖，并认为PVP作为澄清剂，具有吸附作
用，能吸附多糖将其除去。β-疏基乙醇和Na2S2O5，作
为还原剂和抗氧化剂，防止材料中的酚类氧化，以及除
去色素，以保证酶切扩增的顺利进行[12]。山杏叶片中富
含酚、多糖、蛋白、色素等物质，本试验采用改良的
CTAB法对山杏基因组DNA进行提取，在基本提取液
中加入一系列防酚抗氧化物质（PVP40、β-巯基乙醇、
抗坏血酸、Na2S2O5等）以避免溶液变褐而具有氧化作
用。另外，在试验中要注意一些具体操作细节的影响，
如粗提DNA过程中，加入无水乙醇析出DNA时，若
混合液未能混合均匀，会影响DNA的产量且DNA成
团性不好。目前笔者利用CTAB4法提取的DNA用于
研究山杏遗传性状的AFLP分析，效果较好。
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图3部分供试材料的基因组DNA的提取效果
注：1-8号分别代表山杏的不同类型
图14种处理所提CH01基因组DNA的电泳效果
(1：CTAB1,2：CTAB2,3：CTAB3,4：CTAB4)
图24种处理所提CH02基因组DNA的电泳效果
(1：CTAB1,2：CTAB2,3：CTAB3,4：CTAB4)
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