全 文 ：槌果藤对进行性系统性硬化症患者成
纤维细胞增殖和Ⅰ型胶原产生的影响
曹越兰，李 欣，郑 敏
（浙江大学 医学院 附属第二医院，浙江 杭州 ３１０００９）
［摘要］ 目的：探讨槌果藤乙醇提取物对进行性系统性硬化症（ＰＳＳ）患者及正常人成纤维细胞增殖、Ⅰ型胶
原产生的影响。方法：ＭＴＴ比色法观察槌果藤提取物对成纤维细胞增殖活性的影响及其抗氧化作用，流式细胞仪
检测提取物对细胞凋亡的影响，ＲＴＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测提取物对ＰＳＳ患者Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ表达及蛋白合成的
影响。结果：槌果藤提取物可抑制ＰＳＳ患者成纤维细胞的增殖、Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ表达及蛋白合成，呈剂量和时间依
赖性，但无细胞毒性或诱导凋亡作用。该提取物对正常人成纤维细胞的增殖及胶原合成无影响，对过氧化氢造成
的成纤维细胞损伤有一定保护作用。结论：槌果藤乙醇提取物可抑制 ＰＳＳ患者成纤维细胞增殖及Ⅰ型胶原的合
成，并有抗氧化作用。
［关键词］ 进行性系统性硬化症；槌果藤
［中图分类号］Ｒ２８５５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）０５０５６００４
［收稿日期］ ２００７１０１０
［基金项目］ 浙江省科技厅基金项目（２００４Ｃ３００５７）；浙江省中
医药管理局基金项目（Ｂ２００５Ｃ１８３）
［通讯作者］ 曹越兰，Ｔｅｌ：（０５７１）８７７８３７４３，Ｅｍａｉｌ：ＣＹＬ１２３３２１
＠ｓｏｈｕｃｏｍ
槌果藤 ＣａｐｐａｒｉｓｓｐｉｎｏｓａＬ为白花菜科山柑仔
属植物，又称刺山柑，具祛风除湿、止瘀消肿、止痛活
血等功效，主要成分有挥发油类、吲哚类、类黄酮类
等［１］。药理学研究表明，槌果藤具有抗菌［２］、抗
炎［３］、抗氧化［４，５］、保肝［６］、降血脂血糖［７，８］等作用。
其鲜果外敷常用于风湿性关节炎、痛风的治疗。
１９９７年李凡等首次报道用槌果藤鲜果泥膏外敷治
疗局限性硬皮病，疗效显著［９］，但未见有关药理学
及作用机制方面的研究报道。进行性系统性硬化症
（ＰＳＳ）的主要特征是成纤维细胞合成细胞外基质
（ＥＣＭ）异常增多，导致真皮及内脏器官纤维化和硬
化、功能障碍，其中Ⅰ型胶原是真皮纤维化时 ＥＣＭ
的主要成分。本研究通过体外实验观察槌果藤乙醇
提取物对正常人及ＰＳＳ患者成纤维细胞增殖、Ⅰ型
胶原产生的影响，为该药的临床应用提供参考。
１ 材料和方法
１１ 主要试剂 高糖 ＤＭＥＭ培养基、０２５％胰酶
（Ｇｉｂｃｏ公司），胎牛血清（杭州四季青生物制品公
司），四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）（Ｓｉｇｍａ公司）Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司），逆转录试剂盒及 Ｔａｑ酶（ｐｒｏｍｅｇａ公
司），α２（Ⅰ）胶原、βａｃｔｉｎ引物（上海生工生物工程
技术服务有限公司），羊抗人Ⅰ型胶原多克隆抗体
（Ｓａｎｔｃｒｕｚ公司），辣根过氧化物酶标记兔抗羊 ＩｇＧ
二抗（Ｊａｃｋｓｏｎ公司），ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公司），化
学发光自显影液（ＥＣＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｎ公司），ＢＣＡ蛋白
定量试剂盒（Ｓｉｇｍａ公司）。
１２ 供试品的制备 称取３７０ｇ槌果藤干果切成
小片，加９５％乙醇于７０℃水浴中加热回流１ｈ，倾
出煎煮液备用，重复２次，将２次煎煮液合并，于旋
转蒸发仪上进行真空浓缩至固态，得提取物３７９５
ｇ，用二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）溶解成１ｍｇ·ｍＬ－１，０２２
μｍ滤器过滤灭菌，－２０℃保存备用。
１３ 原代成纤维细胞培养 ３株 ＰＳＳ患者成纤维
细胞分别取自３例病程短于２年的ＰＳＳ患者新发皮
损的活动性边缘，３株正常对照的成纤维细胞取自３
位年龄、性别、取材部位与ＰＳＳ患者匹配的正常人皮
肤。原代培养采用组织块贴壁法［１０］。用含１０％胎
牛血清的ＤＭＥＭ培养液在３７℃，５％ ＣＯ２孵育箱内
培养，待９０％融合后用０２５％胰酶进行传代，３～６
代细胞用于实验。细胞在药物处理前均予无血清培
养基同步化处理２４ｈ。
１４ 槌果藤提取物对成纤维细胞增殖活性影响
待培养瓶中细胞接近９０％融合时，用０２５％胰酶消
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化，收集细胞悬液，调至细胞为１×１０４个／ｍＬ，接种
于９６孔板内，０１ｍＬ／孔，同步化处理后，更换含槌
果藤提取物的培养基，根据预试验结果，终浓度设为
０，１０，５０，１００μｇ·ｍＬ－１，每个浓度设６个复孔，培养
７２ｈ后，每孔加入１０μＬ５ｍｇ·ｍＬ－１ＭＴＴ，继续孵
育４ｈ，弃培养基，每孔加１００μＬＤＭＳＯ待紫色结晶
充分溶解，混匀后于酶标仪 ５７０ｎｍ处测得吸光度
（Ａ），抑制率（％）＝（Ａ对照 －Ａ用药）／Ａ对照 ×１００％，实
验重复３遍。
１５ 流式细胞仪检测槌果藤提取物对 ＰＳＳ成纤维
细胞凋亡的影响 取融合度约８０％的 ＰＳＳ患者成
纤维细胞，用含槌果藤提取物０，１００μｇ·ｍＬ－１的培
养基培养２４ｈ后，胰酶消化，用ＰＢＳ洗２次，每次离
心５００ｒ·ｍｉｎ－１，５ｍｉｎ。加入１００μＬＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｅｒ
和ＦＩＴＣ标记的２０μｇ·ｍＬ－１ＡｎｎｅｘｉｎＶ１０μＬ，室温
避光３０ｍｉｎ，加入５０μｇ·ｍＬ－１ＰＩ５μＬ，避光反应５
ｍｉｎ，加入 ４００μＬＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｅｒ，上流式细胞仪检
测。同时以不加 ＡｎｎｅｘｉｎＶＦＩＴＣ及 ＰＩ的一管为阴
性对照。
１６ 槌果藤提取物对成纤维细胞Ⅰ型胶原 ｍＲＮＡ
表达的影响 ＰＳＳ患者及正常人成纤维细胞均以１
×１０５个／ｍＬ×１０ｍＬ接种于１０ｃｍ培养皿中，待细
胞融合时，用含槌果藤提取物１００μｇ·ｍＬ－１的培养
基培养６，１２，２４，４８ｈ，每个时间点设含０１％ ＤＭ
ＳＯ的培养基孵育的细胞为空白对照。用 Ｔｒｉｚｏｌ、氯
仿、异丙醇抽提细胞总ＲＮＡ，取２μｇＲＮＡ作为模板
按试剂盒说明进行逆转录得 ＤＮＡ模板，ＰＣＲ扩增，
ＰＣＲ反应体系５０μＬ，Ⅰ型胶原产物序列设计参照
文献［１１］，上游引物 ５′ＴＣＣＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＣＧＧ
ＴＡＡ３′，下游引物５′ＧＡＣＣＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡ
３′。扩增参数：９５℃变性４５ｓ，５６℃退火４５ｓ，７２℃
延伸 ４５ｓ，３０个循环。βａｃｔｉｎ上游引物 ５′ＣＴＡ
ＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡ３′，下游引物 ５′ＡＴＧＧＡＴ
ＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＣ３′。扩增参数：９５℃变性２０ｓ，
５６℃退火２０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，２５个循环。１８％
琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统分析灰度值，以
Ⅰ型胶原与 βａｃｔｉｎ灰度值的比值表示Ⅰ型胶原的
相对表达量。实验重复３遍。
１７ 槌果藤提取物对成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白合
成的影响 将细胞按１×１０５个／ｍＬ×１０ｍＬ接种于
１０ｃｍ培养皿中，用含槌果藤提取物 ０，１０，５０，１００
μｇ·ｍＬ－１的培养基培养７２ｈ，收集、裂解细胞，提取
细胞蛋白，ＢＣＡ蛋白定量。每样本取２０μｇ蛋白，行
８％ＳＤＳＰＡＧＥ胶电泳，恒流 ２５０ｍＡ转 ＰＶＤＦ膜 ２
ｈ，５％脱脂奶粉封闭２ｈ，加１∶８００羊抗人Ⅰ型胶原
抗体４℃过夜，ＴＢＳＴ洗涤３次，ＨＲＰ标记兔抗羊二
抗 １∶１０００室温孵育２ｈ，ＴＢＳＴ洗涤３次，加 ＥＣＬ５
ｍｉｎ，曝光，洗片。同时测定 βａｃｔｉｎ，结果以胶原与
βａｃｔｉｎ灰度值的比值表示。实验重复３遍。
１８ 槌果藤提取物的抗氧化作用研究 将５×１０４
个／ｍＬ的正常人成纤维细胞接种于９６孔板内，０１
ｍＬ／孔，用槌果藤提取物浓度分别为 ０，１０，５０，１００
μｇ·ｍＬ－１的培养基培养７２ｈ后，每孔加入６ｍｍｏｌ
·Ｌ－１过氧化氢，孵育１ｈ，用上述 ＭＴＴ比色法测得
吸光度Ａ。每个浓度设６个复孔。实验重复３遍。
１９ 统计学分析 使用 ＳＰＳＳ１３０统计学软件包
进行数据处理及分析，结果以 珋ｘ±ｓ表示，采用
ＯｎｅｗａｙＡＮＯＶＡ检验组间差异，Ｐ＜００５有统计学
意义。
２ 结果
２１ 槌果藤提取物对成纤维细胞增殖活性的影响
用ＭＴＴ比色法测定细胞增殖活性，结果发现，槌
果藤提取物作用７２ｈ对体外培养的正常人成纤维
细胞的增殖无影响，浓度１０μｇ·ｍＬ－１起可显著抑
制ＰＳＳ患者成纤维细胞的增殖，以１００μｇ·ｍＬ－１的
抑制作用最明显。１０，５０，１００μｇ·ｍＬ－１的抑制率
分别为１５３％，２６１％，３３０％（Ｐ＜００１）。在倒置
显微镜下观察加药后的成纤维细胞胞体饱满，呈梭
形，见多个细长突起，平行极性排列，呈漩涡状走向，
与未加药的细胞形态无明显差异（图１）。
图１ 槌果藤提取物对ＰＳＳ患者细胞形态的影响
Ａ未加药；Ｂ１００μｇ·ｍＬ－１槌果藤提取物
２２ 流式细胞仪细胞凋亡检测 ＡｎｎｅｘｉｎＶＦＩＴＣ／
ＰＩ染色经流式细胞仪检测发现，槌果藤提取物１００
μｇ·ｍＬ－１作用２４ｈ后细胞凋亡率为１３１％，未加
药处理细胞凋亡率为２２９％，两者无显著性差异。
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２３ 槌果藤提取物对成纤维细胞Ⅰ型胶原 ｍＲＮＡ
表达的影响 观察槌果藤提取物１００μｇ·ｍＬ－１在
不同时间点对成纤维细胞Ⅰ型胶原 ｍＲＮＡ的抑制
作用，发现该提取物对正常人成纤维细胞的Ⅰ型胶
原ｍＲＮＡ表达无影响，加药１２ｈ起可抑制ＰＳＳ患者
成纤维细胞的Ⅰ型胶原 ｍＲＮＡ表达，并呈时间依赖
性，加药 １２，２４，４８ｈ的抑制率分别为 ２７５％，
３７１％，４８２％（Ｐ＜００１）（图２）。
图２ 槌果藤提取物对正常人及ＰＳＳ患者
Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ的影响
２４ 槌果藤提取物对成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白含
量的影响 槌果藤提取物作用７２ｈ对正常成纤维
细胞Ⅰ型胶原蛋白合成无抑制作用，从 １０μｇ·
ｍＬ－１起可显著抑制 ＰＳＳ患者成纤维细胞的Ⅰ型胶
原蛋白合成，并呈浓度依赖性，加药１０，５０，１００μｇ
·ｍＬ－１的抑制率分别为 １７５％，３８２％，４６３％
（Ｐ＜００１）（图３）。
图３ 槌果藤提取物对成纤维细胞胶原蛋白含量的影响
２５ 槌果藤提取物的抗氧化作用 ６ｍｍｏｌ·Ｌ－１过
氧化氢作用于正常人成纤维细胞１ｈ后细胞大部分
变圆、漂起死亡，而用槌果藤提取物预处理７２ｈ后
可显著减少过氧化氢对成纤维细胞的损伤，１０μｇ·
ｍＬ－１起即有保护作用，以１００μｇ·ｍＬ－１的保护作用
最明显，与未加药相比，加药１０，５０，１００μｇ·ｍＬ－１
细胞增殖活性分别增加 ２０％，３８８％，４４７％（图
４）。
３ 讨论
ＰＳＳ患者组织器官大量的胶原堆积主要与患者
成纤维细胞胶原基因的高表达、合成过多以及细胞
外降解减少有关。将患者成纤维细胞体外培养至第
图４ 槌果藤提取物的抗氧化作用
１５代，其胶原合成量仍高于正常人，因而探讨药物
对ＰＳＳ患者成纤维细胞胶原合成的影响，是研究治
疗ＰＳＳ药理机制的关键之一。本实验选用槌果藤乙
醇提取物进行研究，观察该提取物对正常人及 ＰＳＳ
患者成纤维细胞增殖、Ⅰ型胶原产生的影响，结果发
现槌果藤提取物能直接抑制ＰＳＳ患者成纤维细胞的
增殖，但对正常人成纤维细胞的生长活性无影响，细
胞形态学观察、台盼蓝染色发现用该提取物处理后
的正常人及ＰＳＳ患者的成纤维细胞与未处理的细胞
形态无差异，死亡细胞无明显增多，流式细胞仪检测
该提取物处理后的凋亡细胞无明显增多，提示槌果
藤提取物对ＰＳＳ患者成纤维细胞的增殖抑制作用并
不是通过诱导凋亡或细胞毒作用实现的。
ＲＴＰＣＲ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明槌果藤提取物
能显著抑制Ⅰ型胶原 ｍＲＮＡ的表达及蛋白合成，即
从基因转录及翻译水平抑制胶原产生，从而发挥其
抗纤维化作用，并呈一定的时效、量效关系，最高
抑制质量浓度为１００μｇ·ｍＬ－１，１００μｇ·ｍＬ－１以上
达到平台期。ＰＳＳ患者成纤维细胞产生过氧化氢，
氧自由基及细胞内活性氧（ＲＯＳ）水平明显增高，
ＲＯＳ的增高与ＰＳＳ患者成纤维细胞增殖、胶原基因
高表达有密切关系［１２］。过高的 ＲＯＳ导致 ＰＳＳ患者
成纤维细胞ＤＮＡ损伤、衰老加速、应激时易凋亡，同
时刺激胶原基因的转录。过氧化氢可显著增加正常
人成纤维细胞的Ⅰ型胶原 ｍＲＮＡ表达，抗氧化剂可
抑制胶原的合成［１３］。文献报道槌果藤甲醇提取物
（ＬＥＣＳ）有明显的抗氧化作用［４，５］，ＰａｎｉｃｏＡＭ在关
节炎体外模型中发现 ＬＥＣＳ对 ＩＬ１刺激的 ＲＯＳ产
生有直接抑制作用［３］。
本研究发现槌果藤提取物可明显抑制过氧化氢
对成纤维细胞的损伤，因此推测槌果藤提取物的抗
氧化作用是其抑制ＰＳＳ患者成纤维细胞增殖、Ⅰ型
胶原合成的机制之一，是否尚有其他机制如抑制与
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