全 文 :HPLC法同时测定乌药中3种倍半萜内酯的含量
郑运亮,栾连军,甘礼社,周长新,吴永江
(浙江大学 药学院 现代中药研究所,浙江 杭州 310058)
[摘要] 目的:建立同时测定乌药中3种倍半萜内酯含量的 HPLC法。方法:DiamonsilTM(钻石)C18色谱柱(46mm×
250mm,5μm);流动相乙腈01%磷酸水溶液(45∶55),流速为1mL·min-1,检测波长220nm。结果:羟基香樟内酯在0001
8~00360g·L-1,新乌药内酯在00162~03232g·L-1,乌药醚内酯在00105~02099g·L-1与峰面积呈良好的线性
关系,R2分别为09998,09999,09999,平均加样回收率分别为1000%,988%,989%,RSD分别为33%,19%,16%。
结论:本方法快速简便、灵敏、可靠,为乌药的质量评价提供了科学依据。
[关键词] 乌药;倍半萜内酯;含量测定;高效液相色谱法
[收稿日期] 20090403
[通信作者] 吴永江,Tel/Fax:(0571)88208455,Email:yjwu@
zju.edu.cn
乌药始载于唐代陈藏器的《本草拾遗》,为樟科
山胡椒属植物乌药 Linderaaggregata(Sims)Kos
term.的膨大块根,味辛性温,具有顺气止痛、温肾散
寒的功效。主要用于气逆喘急,胸腹胀痛,遗尿尿
频,膀胱虚冷,痛经,疝气等[1]。乌药主要分布于浙
江、湖南、安徽、广东、广西等地[2],化学成分主要包
括呋喃倍半萜及其内酯、异喹啉生物碱、挥发油等,
其中呋喃倍半萜及其内酯类成分仅在少数植物科、
属中有分布,有一定的专属性,为乌药的特征性成
分[34],现代药理研究表明此类成分具有预防试验性
肝损伤[4]、抗肿瘤[5]及抑制脯氨酰基酞链内切酶[6]
等作用。迄今为止,对乌药中呋喃倍半萜及其内酯
的定性、定量研究仅局限于乌药醚内酯及乌药内酯
两种成分[78],2005年版《中国药典》中仅用乌药醚
内酯的含量衡量乌药的质量。由于中药有效成分的
复杂多样性,现有乌药质量评价方法尚不够全面。
本研究首次采用反相高效液相色谱法对乌药中
的3种倍半萜内酯类成分进行了定量分析,为进一
步提高乌药质量评价标准提供了一种灵敏、可靠、方
便的分析方法。
1 仪器与试药
Waters2695高效液相色谱仪,2996型二极
管阵列检测器;METTLERXS105型分析天平;对
照品羟基香樟内酯、新乌药内酯、乌药醚内酯由
本实验室自制,经 NMR,MS,IR分析,并参考相
关文献[911]数据确定结构,经 HPLC面积归一化
法分析,其纯度均≥98%,结构如图 1所示;试验
用的10批乌药饮片购自各地药店,产地分别为
安徽、江西、四川、陕西、浙江,均由徐娟华副教授
鉴定为樟科山胡椒属乌药 Laggregata的块根,
分别取上述样品粉碎,过40目筛,备用;乙腈(色
谱纯,德国 Merck公司),甲醇(分析纯,杭州大方
化学试剂厂),磷酸(分析纯,中国杭州化学试剂
有限公司),MiliQ超纯水。
图1 3种倍半萜内酯的结构
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验 DiamonsilTM(钻
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石)C18色谱柱(46mm×250mm,5μm);流动相
乙腈01%磷酸水溶液(45∶55);流速 1mL·
min-1,检测波长220nm,柱温25℃,进样量为 15
μL。在此色谱条件下,3个峰的理论塔板数均不小
于7200,分离度均大于20。对照品和样品 HPLC
图见图2。
1.羟基香樟内酯;2.新乌药内酯;3.乌药醚内酯。
图2 对照品(A)及供试品(B)HPLC图
2.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品羟基香
樟内酯 2400mg,新乌药内酯 1616mg,乌药醚内
酯 1399mg,分别置10mL量瓶中,用甲醇溶解并
定容至刻度,摇匀,配制成各对照品储备液(羟基香
樟内酯2400g·L-1,新乌药内酯1616g·L-1,乌
药醚内酯1399g·L-1),使用时稀释成工作对照品
溶液。
2.3 供试品溶液的制备 取10g乌药粉末,精密
称定,置250mL具塞锥形瓶中,加入100mL甲醇,
室温下浸泡1h,超声40min,抽滤,残渣再次加入
100mL甲醇,超声40min,抽滤,合并抽滤液,减压
蒸干,加入20mL水超声使其成混悬液,用等体积的
乙醚萃取4次,合并乙醚萃取液,减压蒸干,残渣用
适量甲醇溶解后置25mL量瓶中,并用甲醇稀释至
刻度,摇匀备用。
2.4 标准曲线与线性范围 精密量取羟基香樟
内酯储备液 015mL,新乌药内酯储备液 200
mL,乌药醚内酯储备液 150mL,置 10mL量瓶
中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,配成混标储备液。
分别精密量取混标溶液 010,020,025,080,
120,200mL,置于 2mL量瓶中,用甲醇稀释至
刻度,摇匀,得 6个不同浓度的混合对照品溶液,
按21项下色谱条件,依次分析,每个浓度平行测
定3次,测得各峰面积。以峰面积积分值为纵坐
标(Y),对照品浓度(mg·L-1)为横坐标(X),绘
制标准曲线,各对照品的线性回归方程见表1。通
过计算法确定检测限(S/N=3)和定量限(S/N=
10),结果见表1。
表1 各被测成分回归方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限
化合物 回归方程 R2 线性范围/g·L-1 检测限/mg·L-1 定量限/mg·L-1
羟基香樟内酯 Y=41083X-22768 09998 00018~00360 0338 1125
新乌药内酯 Y=16014X-46121 09999 00162~03232 1010 3367
乌药醚内酯 Y=23571X-51322 09999 00105~02099 0926 3086
2.5 精密度试验 精密吸取24项中的混标储备
液120mL,置于2mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,
摇匀,按21项色谱条件测定,连续进样6次,记录
各对照品峰面积,6次峰面积积分值的RSD分别为:
羟基香樟内酯14%,新乌药内酯068%,乌药醚内
酯061%。
2.6 稳定性试验 取批号为070716乌药粉末10
g,按23项方法制备供试品溶液,分别在 0,4,8,
12,24,48h进样,按21项色谱条件测定,3种倍半
萜内酯在48h内峰面积积分值的RSD分别为:羟基
香樟内酯 085%、新乌药内酯 36%、乌药醚内酯
14%。表明供试品溶液在48h内稳定。
2.7 重复性试验 取同一批号(070716)的乌药粉
末,平行称取6份,按23项操作制备供试液,精密
吸取供试液15μL进样,测定峰面积,计算含量,测
得各成分的平均含量为:羟基香樟内酯003%,新
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乌药内酯027%,乌药醚内酯017%。RSD依次为
15%,22%,083%,表明重复性良好。
2.8 加样回收率试验 平行称取6份已知含量的
乌药粉末(批号为070716),每份0500g,每份中分
别加入一定量各对照品储备液,使加入量为羟基香
樟内酯0144mg、新乌药内酯1293mg、乌药醚内
酯0839mg,照23项方法制备供试品溶液,按21
项色谱条件测定,计算回收率,结果见表2,表明所
用方法有良好的回收率。
表2 各被测成分的加样回收率(n=6)
成分
样品中量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
平均回收
率/%
RSD
/%
羟基香樟内酯 0149 0144 0293 1000 33
新乌药内酯 1340 1293 2618 988 19
乌药醚内酯 0852 0839 1682 989 16
2.9 样品测定 对收集到的10批乌药饮片按供试
品制备项方法制备供试品溶液,在上述色谱条件下
测定,结果见表3。
表3 不同产地、批号的乌药饮片中3种倍半萜
内酯的质量分数(n=3) mg·g-1
产地 批号 羟基香樟内酯 新乌药内酯 乌药醚内酯
安徽 080921 0161 2315 2373
四川 070701 0322 3157 2291
江西 0811235 0311 8253 2701
山西 080310 0283 3529 1525
陕西 080921 0265 4490 1690
浙江 081019 0250 4624 1731
浙江 080227 0219 2390 1247
浙江 070315 0299 3193 1778
浙江 071020 0307 3125 2337
浙江 070716 0299 2680 1704
3 讨论
3.1 检测波长的选择 新乌药内酯与乌药醚内酯
的最大吸收波长均在208nm,羟基香樟内酯的最大
吸收波长在220nm,由于在208nm处样品中杂质
峰多,干扰分析,而在220nm三者均有较强吸收,且
没有其他杂质干扰,故选择220nm作为检测波长。
3.2 流动相的选择 分别考察了不同比例的甲醇
水、乙腈水系统,发现用甲醇水系统时在 220nm
下有杂质峰与羟基香樟内酯峰不能达到基线分离,
用乙腈水(45∶55)时新乌药内酯与乌药醚内酯分离
效果较好且保留时间适中,但是羟基香樟内酯峰拖
尾,易与杂质峰交叉重叠。经过筛选发现水相加入
01%磷酸后羟基香樟内酯峰的拖尾现象消失,峰形
稳定并且能与其他杂质达到基线分离,新乌药内酯
与乌药醚内酯分离效果不受影响,所以最终确定乙
腈水(含01%磷酸)(45∶55)作为流动相。
3.3 供试品制备方法的选择 为了提高分析对
象的提取率,减少杂质的干扰,本研究以甲醇为提
取溶剂,分别比较了索氏提取、加热回流提取及超
声提取,结果表明,加热回流与超声的提取率相
当,均优于索氏提取。考虑到内酯结构受热的不
稳定性,因此选择超声提取法。分别考察了提取
时间、提取次数及浸泡时间对提取率的影响,结果
表明液料比 100∶1,甲醇室温浸泡 1h,超声 40
min,提取2次能够完全提取出分析对象,但杂质
较多。分别以醋酸乙酯、二氯甲烷、乙醚为萃取剂
对提取物进行净化处理,发现用乙醚萃取 4次的
净化效果最好且能将分析对象萃取完全,从而最
终确定供试品的处理方法。
[参考文献]
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Simultaneousdeterminationofthreesesquiterpenelactonesin
RadixLinderaebyHPLC
ZHENGYunliang,LUANLianjun,GANLishe,ZHOUChangxin,WUYongjiang
(InstituteofModernChineseMedicine,ColegeofPharmaceuticalSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)
[Abstract] Objective:TodevelopanHPLCmethodforsimultaneousdeterminationofthreemajorsesquiterpenelactonesin
RadixLinderae.Method:ThechromatographicseparationwasachievedonaDiamonsilTM C18column(46mm×250mm,5μm)
usingisocraticelutionofacetonitrilewater(containing01% H3PO4)(45∶55)ataflowrateof10mL·min
-1.Detectionwascar
riedoutusingaphotodiodearaydetectorat220nm.Result:Thecalibrationcurveswerelinearintherangeof0001800360g·
L-1forhydroxylinderstrenolide(R2=09998),0016203232g·L-1forneolinderalactone(R2=09999),0010502099g
·L-1forlinderane(R2=09999),respectively.Theaveragerecoverieswere1000% forhydroxylinderstrenolide,988% forne
olinderalactoneand989% forlinderanewithRSDnotmorethan33%.Conclusion:Theestablishedmethodwasprovedtobesim
ple,sensitiveandcredible,andcanbeappliedtoqualitycontrolofRadixLinderae.
[Keywords] RadixLinderae;sesquiterpenelactones;determination;highperformanceliquidchromatography
[责任编辑 王亚君]
《中国药用植物种子原色图鉴》书讯
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