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Simultaneous determination of three sesquiterpene lactones in Radix Linderae by HPLC

HPLC法同时测定乌药中3种倍半萜内酯的含量



全 文 :HPLC法同时测定乌药中3种倍半萜内酯的含量
郑运亮,栾连军,甘礼社,周长新,吴永江
(浙江大学 药学院 现代中药研究所,浙江 杭州 310058)
[摘要] 目的:建立同时测定乌药中3种倍半萜内酯含量的 HPLC法。方法:DiamonsilTM(钻石)C18色谱柱(46mm×
250mm,5μm);流动相乙腈01%磷酸水溶液(45∶55),流速为1mL·min-1,检测波长220nm。结果:羟基香樟内酯在0001
8~00360g·L-1,新乌药内酯在00162~03232g·L-1,乌药醚内酯在00105~02099g·L-1与峰面积呈良好的线性
关系,R2分别为09998,09999,09999,平均加样回收率分别为1000%,988%,989%,RSD分别为33%,19%,16%。
结论:本方法快速简便、灵敏、可靠,为乌药的质量评价提供了科学依据。
[关键词] 乌药;倍半萜内酯;含量测定;高效液相色谱法
[收稿日期] 20090403
[通信作者] 吴永江,Tel/Fax:(0571)88208455,Email:yjwu@
zju.edu.cn
  乌药始载于唐代陈藏器的《本草拾遗》,为樟科
山胡椒属植物乌药 Linderaaggregata(Sims)Kos
term.的膨大块根,味辛性温,具有顺气止痛、温肾散
寒的功效。主要用于气逆喘急,胸腹胀痛,遗尿尿
频,膀胱虚冷,痛经,疝气等[1]。乌药主要分布于浙
江、湖南、安徽、广东、广西等地[2],化学成分主要包
括呋喃倍半萜及其内酯、异喹啉生物碱、挥发油等,
其中呋喃倍半萜及其内酯类成分仅在少数植物科、
属中有分布,有一定的专属性,为乌药的特征性成
分[34],现代药理研究表明此类成分具有预防试验性
肝损伤[4]、抗肿瘤[5]及抑制脯氨酰基酞链内切酶[6]
等作用。迄今为止,对乌药中呋喃倍半萜及其内酯
的定性、定量研究仅局限于乌药醚内酯及乌药内酯
两种成分[78],2005年版《中国药典》中仅用乌药醚
内酯的含量衡量乌药的质量。由于中药有效成分的
复杂多样性,现有乌药质量评价方法尚不够全面。
本研究首次采用反相高效液相色谱法对乌药中
   
的3种倍半萜内酯类成分进行了定量分析,为进一
步提高乌药质量评价标准提供了一种灵敏、可靠、方
便的分析方法。
1 仪器与试药
Waters2695高效液相色谱仪,2996型二极
管阵列检测器;METTLERXS105型分析天平;对
照品羟基香樟内酯、新乌药内酯、乌药醚内酯由
本实验室自制,经 NMR,MS,IR分析,并参考相
关文献[911]数据确定结构,经 HPLC面积归一化
法分析,其纯度均≥98%,结构如图 1所示;试验
用的10批乌药饮片购自各地药店,产地分别为
安徽、江西、四川、陕西、浙江,均由徐娟华副教授
鉴定为樟科山胡椒属乌药 Laggregata的块根,
分别取上述样品粉碎,过40目筛,备用;乙腈(色
谱纯,德国 Merck公司),甲醇(分析纯,杭州大方
化学试剂厂),磷酸(分析纯,中国杭州化学试剂
有限公司),MiliQ超纯水。
图1 3种倍半萜内酯的结构
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验 DiamonsilTM(钻
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石)C18色谱柱(46mm×250mm,5μm);流动相
乙腈01%磷酸水溶液(45∶55);流速 1mL·
min-1,检测波长220nm,柱温25℃,进样量为 15
μL。在此色谱条件下,3个峰的理论塔板数均不小
于7200,分离度均大于20。对照品和样品 HPLC
图见图2。
1.羟基香樟内酯;2.新乌药内酯;3.乌药醚内酯。
图2 对照品(A)及供试品(B)HPLC图
2.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品羟基香
樟内酯 2400mg,新乌药内酯 1616mg,乌药醚内
酯 1399mg,分别置10mL量瓶中,用甲醇溶解并
定容至刻度,摇匀,配制成各对照品储备液(羟基香
樟内酯2400g·L-1,新乌药内酯1616g·L-1,乌
药醚内酯1399g·L-1),使用时稀释成工作对照品
溶液。
2.3 供试品溶液的制备 取10g乌药粉末,精密
称定,置250mL具塞锥形瓶中,加入100mL甲醇,
室温下浸泡1h,超声40min,抽滤,残渣再次加入
100mL甲醇,超声40min,抽滤,合并抽滤液,减压
蒸干,加入20mL水超声使其成混悬液,用等体积的
乙醚萃取4次,合并乙醚萃取液,减压蒸干,残渣用
适量甲醇溶解后置25mL量瓶中,并用甲醇稀释至
刻度,摇匀备用。
2.4 标准曲线与线性范围 精密量取羟基香樟
内酯储备液 015mL,新乌药内酯储备液 200
mL,乌药醚内酯储备液 150mL,置 10mL量瓶
中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,配成混标储备液。
分别精密量取混标溶液 010,020,025,080,
120,200mL,置于 2mL量瓶中,用甲醇稀释至
刻度,摇匀,得 6个不同浓度的混合对照品溶液,
按21项下色谱条件,依次分析,每个浓度平行测
定3次,测得各峰面积。以峰面积积分值为纵坐
标(Y),对照品浓度(mg·L-1)为横坐标(X),绘
制标准曲线,各对照品的线性回归方程见表1。通
过计算法确定检测限(S/N=3)和定量限(S/N=
10),结果见表1。
表1 各被测成分回归方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限
化合物 回归方程 R2 线性范围/g·L-1 检测限/mg·L-1 定量限/mg·L-1
羟基香樟内酯 Y=41083X-22768 09998 00018~00360 0338 1125
新乌药内酯  Y=16014X-46121 09999 00162~03232 1010 3367
乌药醚内酯  Y=23571X-51322 09999 00105~02099 0926 3086
2.5 精密度试验 精密吸取24项中的混标储备
液120mL,置于2mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,
摇匀,按21项色谱条件测定,连续进样6次,记录
各对照品峰面积,6次峰面积积分值的RSD分别为:
羟基香樟内酯14%,新乌药内酯068%,乌药醚内
酯061%。
2.6 稳定性试验 取批号为070716乌药粉末10
g,按23项方法制备供试品溶液,分别在 0,4,8,
12,24,48h进样,按21项色谱条件测定,3种倍半
萜内酯在48h内峰面积积分值的RSD分别为:羟基
香樟内酯 085%、新乌药内酯 36%、乌药醚内酯
14%。表明供试品溶液在48h内稳定。
2.7 重复性试验 取同一批号(070716)的乌药粉
末,平行称取6份,按23项操作制备供试液,精密
吸取供试液15μL进样,测定峰面积,计算含量,测
得各成分的平均含量为:羟基香樟内酯003%,新
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乌药内酯027%,乌药醚内酯017%。RSD依次为
15%,22%,083%,表明重复性良好。
2.8 加样回收率试验 平行称取6份已知含量的
乌药粉末(批号为070716),每份0500g,每份中分
别加入一定量各对照品储备液,使加入量为羟基香
樟内酯0144mg、新乌药内酯1293mg、乌药醚内
酯0839mg,照23项方法制备供试品溶液,按21
项色谱条件测定,计算回收率,结果见表2,表明所
用方法有良好的回收率。
表2 各被测成分的加样回收率(n=6)
成分
样品中量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
平均回收
率/%
RSD
/%
羟基香樟内酯 0149 0144 0293 1000 33
新乌药内酯  1340 1293 2618 988 19
乌药醚内酯  0852 0839 1682 989 16
2.9 样品测定 对收集到的10批乌药饮片按供试
品制备项方法制备供试品溶液,在上述色谱条件下
测定,结果见表3。
表3 不同产地、批号的乌药饮片中3种倍半萜
内酯的质量分数(n=3) mg·g-1
产地 批号 羟基香樟内酯 新乌药内酯 乌药醚内酯
安徽 080921 0161 2315 2373
四川 070701 0322 3157 2291
江西 0811235 0311 8253 2701
山西 080310 0283 3529 1525
陕西 080921 0265 4490 1690
浙江 081019 0250 4624 1731
浙江 080227 0219 2390 1247
浙江 070315 0299 3193 1778
浙江 071020 0307 3125 2337
浙江 070716 0299 2680 1704
3 讨论
3.1 检测波长的选择 新乌药内酯与乌药醚内酯
的最大吸收波长均在208nm,羟基香樟内酯的最大
吸收波长在220nm,由于在208nm处样品中杂质
峰多,干扰分析,而在220nm三者均有较强吸收,且
没有其他杂质干扰,故选择220nm作为检测波长。
3.2 流动相的选择 分别考察了不同比例的甲醇
水、乙腈水系统,发现用甲醇水系统时在 220nm
下有杂质峰与羟基香樟内酯峰不能达到基线分离,
用乙腈水(45∶55)时新乌药内酯与乌药醚内酯分离
效果较好且保留时间适中,但是羟基香樟内酯峰拖
尾,易与杂质峰交叉重叠。经过筛选发现水相加入
01%磷酸后羟基香樟内酯峰的拖尾现象消失,峰形
稳定并且能与其他杂质达到基线分离,新乌药内酯
与乌药醚内酯分离效果不受影响,所以最终确定乙
腈水(含01%磷酸)(45∶55)作为流动相。
3.3 供试品制备方法的选择 为了提高分析对
象的提取率,减少杂质的干扰,本研究以甲醇为提
取溶剂,分别比较了索氏提取、加热回流提取及超
声提取,结果表明,加热回流与超声的提取率相
当,均优于索氏提取。考虑到内酯结构受热的不
稳定性,因此选择超声提取法。分别考察了提取
时间、提取次数及浸泡时间对提取率的影响,结果
表明液料比 100∶1,甲醇室温浸泡 1h,超声 40
min,提取2次能够完全提取出分析对象,但杂质
较多。分别以醋酸乙酯、二氯甲烷、乙醚为萃取剂
对提取物进行净化处理,发现用乙醚萃取 4次的
净化效果最好且能将分析对象萃取完全,从而最
终确定供试品的处理方法。
[参考文献]
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Simultaneousdeterminationofthreesesquiterpenelactonesin
RadixLinderaebyHPLC
ZHENGYunliang,LUANLianjun,GANLishe,ZHOUChangxin,WUYongjiang
(InstituteofModernChineseMedicine,ColegeofPharmaceuticalSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)
[Abstract] Objective:TodevelopanHPLCmethodforsimultaneousdeterminationofthreemajorsesquiterpenelactonesin
RadixLinderae.Method:ThechromatographicseparationwasachievedonaDiamonsilTM C18column(46mm×250mm,5μm)
usingisocraticelutionofacetonitrilewater(containing01% H3PO4)(45∶55)ataflowrateof10mL·min
-1.Detectionwascar
riedoutusingaphotodiodearaydetectorat220nm.Result:Thecalibrationcurveswerelinearintherangeof0001800360g·
L-1forhydroxylinderstrenolide(R2=09998),0016203232g·L-1forneolinderalactone(R2=09999),0010502099g
·L-1forlinderane(R2=09999),respectively.Theaveragerecoverieswere1000% forhydroxylinderstrenolide,988% forne
olinderalactoneand989% forlinderanewithRSDnotmorethan33%.Conclusion:Theestablishedmethodwasprovedtobesim
ple,sensitiveandcredible,andcanbeappliedtoqualitycontrolofRadixLinderae.
[Keywords] RadixLinderae;sesquiterpenelactones;determination;highperformanceliquidchromatography
[责任编辑 王亚君]
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