全 文 ：大黄总蒽醌含药血清对 ＬｏＶｏ的 ＡＱＰ４
表达的调节效应
刘青１，李锋１，李军昌１，姚菊峰１，王新２，王长海１，王文１
（１第四军医大学 西京医院中医科，全军中医内科中心，陕西 西安 ７１００３２；
２第四军医大学 西京医院 消化内科，陕西 西安 ７１００３２）
［摘要］ 目的：探讨大黄总蒽醌含药血清对体外培养ＬｏＶｏ细胞的水通道蛋白基因（ＡＱＰ４）表达的调节效应。方法：１６只
ＳＤ大鼠随机分为正常组，大黄总蒽醌低、中、高剂量组（１４，２５，４５ｇ·ｋｇ－１·ｄ－１，灌胃），７ｄ后麻醉处死取血制备含药血
清。体外培养ＬｏＶｏ细胞并给予不同剂量大黄总蒽醌含药血清培养液２４ｈ，采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ及半定量ＲＴＰＣＲ检测ＡＱＰ４蛋
白及ｍＲＮＡ的表达。结果：结果显示，４５ｇ·ｋｇ－１·ｄ－１大黄总蒽醌含药血清培养液可抑制ＬｏＶｏ细胞的ＡＱＰ４蛋白及ｍＲＮＡ
的表达（Ｐ＜００１）。结论：大黄总蒽醌含药血清可抑制 ＬｏＶｏ细胞 ＡＱＰ４基因转录与翻译，提示大黄的泻下作用可能与调节
ＡＱＰ４表达有关。
［关键词］ 大黄总蒽醌含药血清；ＬｏＶｏ细胞系；水通道蛋白４；泻下作用
［收稿日期］ ２００９０５１６
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（３０５７２３８５）
［通信作者］ 李锋，Ｔｅｌ：（０２９）８４７７５３５２，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｆｅｎｇ＠ｆｍｍｕ．
ｅｄｕ．ｃｎ
水通道蛋白（ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ，ＡＱＰｓ）是细胞膜水分
子转运蛋白，在肠道上皮细胞表达多种亚型。肠道
水液代谢与 ＡＱＰｓ密切相关［１］。前期工作已证实，
大黄的泻下作用与 ＡＱＰｓ密切相关；大黄总蒽醌能
抑制大鼠远端结肠 ＡＱＰ２的转录与翻译，增加粪便
的含水量；大黄酸、大黄素可抑制 ＬｏＶｏ细胞 ＡＱＰ２，
４基因转录与翻译［２５］。本研究选用大鼠灌服大黄
总蒽醌取含药血清作为 ＡＱＰ４的诱导剂，研究其对
ＬｏＶｏ细胞ＡＱＰ４表达的影响。
１ 材料
ＬｏＶｏ细胞株（第四军医大学实验动物中
心）；ＡＱＰ４兔抗多克隆抗体（ｓｃ２０８１２）、Ａｃｔｉｎ兔
抗多克隆抗体（ｓｅ１６１６）（美国 ＳＡＮＴＡＣＲＵＺ公
司）；ＴＲＩＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔ（１５５９６０２６）（美国 ＩＮ
ＶＩＴＲＯＧＥＮ公司）；ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡ
ＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｋ１６１２）（美国 Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司）；Ｇｏ
Ｔａｑ ＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ两步法 ＲＴＰＣＲ试剂盒
（Ｍ７１２２）（美 国 ＰＲＯＭＥＧＡ 公 司）；８Ｂｒｏｍｏ
ｃＡＭＰ（２０３８００）（德国 Ｍｅｒｃｋ公司）；辣根酶标记
山羊抗兔 ｌｇＧ（ＺＢ２３０１）、ＦＩＴＣ标记的山羊抗兔
ＩｇＧ抗体（ＺＦ０３１１）（北京中山金桥生物技术有
限公司）。
２ 方法
２１ 大黄总蒽醌 生药大黄购自青海果洛，经西北
大学生命科学院房敏峰副教授鉴定为野生唐古特大
黄，加工提取，测定大黄总蒽醌含量为２３２％，符合
２００５年版《中国药典》规定（≥１５％）。
２２ 含药血清的制备 健康 ＳＤ大鼠１６只，雄性，
体重（１８０±２５）ｇ，由第四军医大学实验动物中心提
供，合格证号 ＳＣＸＫ（军）２００２００５。大鼠随机分为
正常组，大黄总蒽醌低、中、高剂量组，每组４只。给
予正常饮食，参照文献低、中、高剂量分别为 １４，
２５，４５ｇ·ｋｇ－１·ｄ－１。依据大鼠体重计算大黄总
蒽醌剂量，以三蒸水稀释药物，每天１次灌胃 ，连续
给药７ｄ；正常组给予同体积三蒸水。末次给药后１
ｈ，乙醚麻醉，无菌条件下经腹主动脉采血。冷置 １
ｈ后离心（２５００ｒ·ｍｉｎ－１，２５ｍｉｎ），分离血清，５６
℃灭活，３０ｍｉｎ，－７０℃ 冰箱保存备用。
２３ ＬｏＶｏ细胞培养 ＬｏＶｏ细胞系来源于人结肠
腺癌，培养呈上皮样生长，于１００ｍＬ· Ｌ－１小牛血
清的ＲＰＭＩ１６４０培养液中，于 ３７℃、饱和湿度、５０
ｍＬ· Ｌ－１ＣＯ２条件下培养，按１∶３分瓶传代。
２４ 分组 ＬｏＶｏ体外培养至对数生长期，给予大
黄总蒽醌含药血清干预，分为对照组（１００ｍＬ· Ｌ－１
小牛血清的 ＲＰＭＩ１６４０培养液）、三蒸水大鼠血清
组（１００ｍＬ· Ｌ－１三蒸水大鼠血清的 ＲＰＭＩ１６４０培
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养液）、１４，２５，４５ｇ·ｋｇ－１·ｄ－１大黄总蒽醌含药
血清组培养２４ｈ后，消化收集细胞进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
检测及ＲＴＰＣＲ检测。
２５ ＡＱＰ４蛋白的 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测 用全蛋白提
取试剂盒提取细胞总蛋白，充分震荡裂解；冰上放置
１ｈ；４℃离心，１２０００×ｇ，２０ｍｉｎ；收集上清液。利
用ＢＣＡ法进行总蛋白定量。取蛋白样品各３０μｇ，
采用ＳＤＳＰＡＧＥ凝胶不连续缓冲系统进行电泳，转
膜。转膜后丽春红染色（２～３）ｍｉｎ观察转膜效果。
将转好的膜放入含有５ｍＬ·Ｌ－１聚氧乙烯脱水山梨
醇单油酸酯的 ＰＢＳＴ中，洗膜５ｍｉｎ；然后封入含有
５０ｇ·Ｌ－１脱脂奶的塑料袋中，室温缓慢摇动 ６０
ｍｉｎ；用５０ｇ·Ｌ－１脱脂奶的 ＰＢＳＴ溶液稀释一抗，其
中ＡＱＰ４１∶５００，Ａｃｔｉｎ１∶２０００；将膜封入塑料袋中，
加入的一抗稀释液，４℃过夜；ＰＢＳＴ洗膜５ｍｉｎ×３
次；加入 ＰＢＳＴ稀释好的辣根酶标记山羊抗兔 ｌｇＧ
（１∶２０００），３７℃缓慢摇动 ６０ｍｉｎ；化学发光法成
像。利用ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓ软件进行电泳条带的平均
灰度值测定，以ＡＱＰ４／Ａｃｔｉｎ的吸光度比值作为该蛋
白表达的相对水平。
２６ ＡＱＰ４ｍＲＮＡ的 ＲＴＰＣＲ检测 用 ＴＲＩＺＯＬ法
提取细胞总ＲＮＡ，测定ＲＮＡ浓度及吸光度（Ａ）２６０／
２８０，以Ａ２６０／Ａ２８０在１８～２０为合格；－８０℃低温
保存。ＡＱＰ４基因序列由美国 Ｎｃｂｉ网站查询获得，
其引物通过美国 Ｐｒｉｍｅｒ５０软件完成设计，由上海
生工合成。其中 ＡＱＰ４上游引物：５′ＧＴＧＡＴＴＣ
ＣＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＡＴＧ３′； 下 游 引 物： ５′ＴＴＧ
ＧＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣ３′；扩增长度：４１３ｂｐ；内参
引物 采 用 βａｃｔｉｎ，其 中 上 游 引 物：５′ＣＧＧ
ＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣ３′；下游引物：５′ＧＧＡＧＣＧＡ
ＣＡＧＧＴＧＧＡＡＧＧＴ３′，扩增长度：４４３ｂｐ。反转录及
ＰＣＲ扩增均按说明书进行，退火温度 ５５℃，４０个循
环。取９μＬ产物，加 ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｅｒ１μＬ，在加入溴
化乙淀的１％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为９０Ｖ恒
压，约４０ｍｉｎ。电泳结束后，自动电泳凝胶成像分析
仪扫描成像。利用 ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓ软件进行电泳条
带的平均灰度值测定，取目的条带与其对应的内参
βａｃｔｉｎ条带的平均灰度值比值作为基因表达的相对
水平。
２７ 统计方法 用 ＳＰＳＳ１１５统计软件进行单因
素方差分析和 ＬＳＤｔ检验，显著性检验水平以 Ｐ＜
００５表示。
３ 结果
３１ ＡＱＰ４蛋白结果 与对照组相比，三蒸水大鼠
血清组，１４，２５ｇ·ｋｇ－１·ｄ－１大黄总蒽醌含药血
清组的 ＡＱＰ４表达无显著性差异。４５ｇ·ｋｇ－１·
ｄ－１大黄总蒽醌含药血清组 ＬｏＶｏ的 ＡＱＰ４表达降
低，差异具有统计学意义（Ｐ＜００１）（图１）。
１对照组；２三蒸水组；３大黄总蒽醌含药血清１４ｇ·ｋｇ－１·
ｄ－１组；４大黄总蒽醌含药血清２５ｇ·ｋｇ－１·ｄ－１组；５大黄总
蒽醌含药血清４５ｇ·ｋｇ－１·ｄ－１组。
图１ 不同剂量大黄总蒽醌含药血清对ＬｏＶｏ
的ＡＱＰ４表达的调节
３２ ＡＱＰ４ｍＲＮＡ结果 与对照组相比，三蒸水大
鼠血清组，大黄总蒽醌含药血清１４，２５ｇ·ｋｇ－１·
ｄ－１组ＬｏＶｏ的ＡＱＰ４ｍＲＮＡ表达无显著性差异。大
黄总蒽醌含药血清 ４５ｇ·ｋｇ－１·ｄ－１组 ＬｏＶｏ的
ＡＱＰ４ｍＲＮＡ表达降低，差异具有统计学意义（Ｐ＜
００１）（图２）。
１对照组；２三蒸水组；３大黄总蒽醌含药血清１４ｇ·ｋｇ－１·
ｄ－１组；４大黄总蒽醌含药血清２５ｇ·ｋｇ－１·ｄ－１组；５大黄总
蒽醌含药血清４５ｇ·ｋｇ－１·ｄ－１组。
图２ 不同剂量大黄总蒽醌含药血清对ＬｏＶｏ的
ＡＱＰ４表达的调节
４ 讨论
ＡＱＰｓ是一系列具有同源性的内在膜蛋白家族，
至今，已从哺乳动物组织中分离
)
至少１３种亚型。
已确定结肠表达ＡＱＰ１，２，３，４，５，７，８，９，１０，１２［６１３］。
ＡＱＰ４表达于结肠上皮细胞的基底外侧膜［１４１５］。
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ＷａｎｇＫＳ［１６］等通过ＡＱＰ４基因敲除小鼠研究发现，
ＡＱＰ４在结肠水转运中起着重要作用。ＡＱＰ４基因
的缺失导致近端结肠水渗透性降低，在末端结肠没
有降低；ＡＱＰ４基因敲除小鼠的粪便含水量较野生
型小鼠降低，同时其盲肠内容物的含水量却没有显
著性差异。这些结果都表明，ＡＱＰ４在水从结肠上
皮细胞到结肠内的转运过程中起着重要作用。
本研究为了能更好的研究大黄泻下的药理作
用，引进血清药理学从细胞分子水平研究大黄的泻
下作用。将中药粗制剂给动物口服，取其血清进行
体外实验。与对照组比较，三蒸水大鼠血清对照组
ＬｏＶｏ的 ＡＱＰ４蛋白和 ｍＲＮＡ表达无显著性差异。
可见大鼠血清对 ＬｏＶｏ细胞的 ＡＱＰ４表达无显著性
影响，血清的改变未引起 ＡＱＰ４表达的变化。４５ｇ
·ｋｇ－１·ｄ－１大黄总蒽醌含药血清组 ＬｏＶｏ的 ＡＱＰ４
蛋白和ｍＲＮＡ表达下降（Ｐ＜００１）。可见，大黄总
蒽醌含药血清能下调 ＬｏＶｏ的 ＡＱＰ４蛋白及 ｍＲＮＡ
表达，结合体内实验，这可能与大黄的“泻下”作用
有关。大黄发挥泻下作用机制之一就是改变结肠内
外水的分布，大肠内水分增加、蠕动亢进而致泻。因
此推断，结肠 ＡＱＰ４存在的调节可能是影响结肠肠
腔内外水分子转动的重要机制，其表达减少，可使肠
内容物水份增加而致泻。因为 ＡＱＰ４基因表达复杂
的调控机制，其涉及诸多顺式作用元件和反式作用
因子的相互作用，大黄如何调控 ＡＱＰ４基因表达的
机制尚不清楚，推测可能与细胞信号转导有关。
本实验低剂量的确定是通过体内实验摸索而
出，已为有效剂量，能使大鼠泻下。体外实验则在高
剂量时才能降低ＡＱＰ４的表达。分析其原因可能除
了血清药理学本身不足外，一方面还可能与口服给
药有关，药物的吸收速度和生物利用度受多方面因
素的影响，大鼠口服大黄总蒽醌可能有部分直接经
胃肠吸收而致泻，另一方面也提示大黄不吸收的部
分，可能起到了部分泻下作用。
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Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｅｆｅｃｔｓｏｆａｑｕａｐｏｒｉｎ４ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＬｏＶｏｃｅｌｓｂｙｓｅｒｕｍ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｏｔａｌａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｉｎｒｈｅｕｍ
ＬＩＵＱｉｎｇ１，ＬＩＦｅｎｇ１，ＬＩＪｕｎｃｈａｎｇ１，ＹＡＯＪｕｆｅｎｇ１，ＷＡＮＧＸｉｎ２，ＷＡＮＧＣｈａｎｇｈａｉ１，ＷＡＮＧＷｅｎ１
（１ＦｏｕｒｔｈＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰＬＡＣｅｎｔｒｅｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＸｉｊｉｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｘｉ′ａｎ７１００３２，Ｃｈｉｎａ；
２ＦｏｕｒｔｈＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ＸｉｊｉｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｘｉ′ａｎ７１００３２，Ｃｈｉｎａ；）
［Ａｂｓｔａｃｔｅ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｅｆｅｃｔｓｏｆｓｅｒｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｏｔａｌａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｉｎｒｈｅｕｍｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆＡＱＰ４ｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄＬｏＶｏｃｅｌｓｉｎｖｉｔｒｏＭｅｔｈｏｄ：ＳｉｘｔｅｅｎＳＤｒａｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ４ｇｒｏｕｐｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ０，１４，
２５，４５ｇ·ｋｇ－１·ｄ－１ｏｆｔｏｔａｌａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｉｎｒｈｅｕｍｂｙｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎＡｆｔｅｒ７ｄａｙｓｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｈｅｒａｔｓｗｅｒｅａｎｅｓｔｈｅ
ｔｉｚｅｄａｎｄｃｅｌｉｏｔｏｍｉｚｅｄｔｏｐｒｅｐａｒｅｔｈｅｓｅｒｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｏｔａｌａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｉｎｒｈｅｕｍＬｏＶｏｃｅｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｖｉｔｒｏｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｏｔａｌａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｉｎｒｈｅｕｍｆｏｒ２４ｈＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｍＲＮＡｏｆＡＱＰ４ＩＮＬｏＶｏｃｅｌｓｗｅｒｅ
ｄｅｃｉｄｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎｄｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｖｅＲＴＰＣＲＲｅｓｕｌｔ：ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎｄｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｖｅＲＴＰＣＲｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｓｅｒｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｏｔａｌ
ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｉｎｒｈｅｕｍｐｒｅｐａｒｅｄｆｒｏｍｒａｔｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ４５ｇ·ｋｇ－１·ｄ－１ｏｆｔｏｔａｌａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｉｎｒｈｅｕｍｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｏｆＡＱＰ４ｉｎＬｏＶｏｃｅｌｓ（Ｐ＜００１）Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｓｅｒｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｏｔａｌａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｉｎｒｈｅｕｍｃａｎｉｎｈｉｂ
ｉｔｂｏｔｈｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｏｆＡＱＰ４ｇｅｎｅ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｒｈｕｂａｒｂｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＱＰ４
ｃａｎｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｃａｔｈａｒｔｉｃｅｆｅｃｔｏｆｒｈｕｂａｒｂ
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｓｅｒｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｏｔａｌａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｉｎｒｈｅｕｍ；ＬｏＶｏｃｅｌｓ；ａｑｕａｐｏｒｉｎ４／ＡＱＰ４；ｃａｔｈａｒｔｉｃｅｆｅｃｔ
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第３４卷第２４期
２００９年１２月
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ ２４
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２００９