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Quality evaluation of Flos Carthami

红花药材的质量评价



全 文 :红花药材的质量评价
王若菁,杨 滨,付梅红
(中国中医科学院 中药研究所,北京 100700)
[摘要] 目的:对红花中色素类成分、腺苷及黄酮类化合物等成分进行分析,建立红花药材质量评价方法。方
法:采用高效液相色谱电化学检测技术,对和指纹图谱红花中羟基红花黄色素A的含量进行研究:AgilentZORBAX
SbC18色谱柱(46mm×250mm,5μm),以磷酸盐缓冲液乙腈为流动相进行梯度洗脱,流速10mL·min
-1,柱温
35℃,参比电极ISAAC(insituAg/AgCl),工作电极为玻碳电极;辅助电极为铂电极;检测电位+800mV。采用高效
液相色谱紫外检测技术,分析红花中腺苷的含量:DiamonsilC18色谱柱(46mm×250mm,5μm),流动相水乙腈
(95∶5),流速10mL·min-1,柱温40℃,检测波长260nm;采用紫外分光光度法,测定红花红色素的吸光度。结
果:以21个共有峰为指标,建立了红花高效液相色谱指纹图谱,鉴定出7个色谱峰。32个红花样品中羟基红花黄
色素A的质量分数为035%~358%;腺苷的质量分数为003‰~049‰。结论:该方法可用于红花质量评价。
[关键词] 红花;高效液相色谱电化学检测;高效液相色谱紫外检测;含量测定;指纹图谱
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)22264205
[收稿日期] 20080509
[基金项目] 科研院所社会公益研究专项(200DIB2J062);国
际科技合作项目(2006DFB31720)
[通讯作者] 杨滨,Tel:(010)640144112848
  中药红花FlosCarthami为菊科一年生草本植物
红花CarthamustinctoriusL.的干燥花,别名草红花。
我国主产区在新疆,其次为四川、云南、河南、河北、山
东、浙江、江苏等省[1]。红花中主要含有色素、黄酮
类化合物、酚酸、脂肪酸、挥发油、多炔等成分[2],药
理报道[34]红花中色素类、黄酮类和腺苷为红花扩张
血管、增加冠脉流量、抑制血小板聚集、改善心脑血
液循环的主要有效成分。目前有关红花质量的研究
多见于红花中单一成分,如羟基红花黄色素A[5]、6
羟基山柰酚3O葡萄糖苷[6]等的含量测定,以及红
花指纹图谱的研究,如周晓英等以山柰酚为基准物,
建立了红花指纹图谱[7];赵明波等以羟基红花黄色
素A为基准物,对不同产地的红花药材进行指纹图
谱分析[8]。但在指纹图谱研究中,尚未有对色谱峰
进行指认的研究。本研究从全国主产区收集了32
批红花,从色素、腺苷的含量和黄酮类化合物的指纹
图谱研究3个方面对红花药材的质量进行评价。
1 材料
1.1 试药与试剂
本实验所用的红花药材经本所生药室何希荣主
管药师鉴定为菊科植物红花C.tinctorius的干燥花。
乙腈(HPLC级),甲醇、乙醇、磷酸、氯化钠、磷酸氢
二钠(AR),重蒸馏水(本所自制)。羟基红花黄色
素 A对照品(批号 111637200503)、腺苷对照品
(110879200202)含量测定用,购于中国药品生物制
品检定所;芦丁、槲皮素、山柰酚(日本和光纯药工业
株式会社);槲皮素3O葡萄糖苷(日本关东化学株
式会社)、6羟基山柰酚3O葡萄糖苷、山柰酚3O
芸香糖苷(本所王智民、张启伟研究员惠赠)。
1.2 仪器
WatersAliance高效液相色谱仪(包括 2695
SeparationModule四元泵、在线真空脱气机、自动进
样器、柱温箱、Waters2996二极管阵列检测器
(UV)、Waters2465安培检测器(ECD)、Empower色
谱工作站,美国 Waters公司)、Agilent1100HPLC-
QtrapTM四极杆线性离子阱串联质谱仪(AB公司);
紫外可见分光光度计(T6新世纪,北京谱析通用仪
器有限责任公司)。
2 方法
2.1 指纹图谱研究
2.1.1 色谱条件 AgilentZORBAXSbC18色谱柱
(46mm×250mm,5μm),流动相A磷酸盐缓冲液
(含有01mol·L-1的磷酸氢二钠、002mol·L-1
的氯化钠,磷酸调 pH168)B乙腈;梯度洗脱:0~
10min(5%~11%B),10~16min(11% ~14%B),
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16~23min(14% ~14%B),23~30min(14% ~
20%B),30~70min(20% ~35%B)。流速1mL·
min-1;柱温 35℃;参比电极 ISAAC(insituAg/
AgCl),工作电极 玻碳电极;辅助电极 铂电极;检测
电位+800mV。
2.1.2 供试品溶液的制备 取样品粉末100g,精
密称定,置50mL三角瓶中,精密加入60%乙醇10
mL,称重,50℃超声1h,冷却,补足失重。滤过,取
续滤液过02μm滤膜,即得。
2.1.3 对照品溶液的制备 分别取羟基红花黄色
素A、6羟基山柰酚3O葡萄糖苷、芦丁、槲皮素3
O葡萄糖苷、山柰酚3O芸香糖苷、槲皮素、山柰酚
对照品5mg,甲醇定容至10mL,即得对照品溶液。
2.1.4 色谱峰的归属及参照物的选择 分别取各
个对照品溶液和红花供试品溶液,按上述色谱条件
进行分析,得到各对照品和红花的 HPLC指纹图谱
(图1)。根据各个色谱峰保留时间和紫外吸收光谱
特征确定红花药材色谱图中色谱峰的归属。由于红
花图谱中1号羟基红花黄色素 A色谱峰峰面积较
大、出峰时间适中,被选作参照峰。
A.对照品;B.红花HPLCUV图(360nm);C.红花HPLCECD图
1.羟基红花黄色素A;2.6羟基山柰酚3O葡萄糖苷;3.芦丁;
4.槲皮素3O葡萄糖苷;5.山柰酚3O芸香糖苷;
6.槲皮素;7.山柰酚
图1 对照品及红花HPLC图
2.1.5 精密度试验 供试品溶液在上述色谱条件
下连续进样5次,各主要峰相对保留时间的 RSD均
小于03%,相对峰面积的RSD均小于58%。
2.1.6 重复性试验 取同一批红花粉末,按供试品
溶液的制备方法操作,平行制备5份样品,在上述色
谱条件下分别进样。各主要色谱峰相对保留时间的
RSD均小于 10%,相对峰面积的 RSD均小于
14%。
2.1.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液在
0,4,8,12,24h进样分析。24h内供试品各主要色
谱峰相对保留时间的RSD值均小于030%,相对峰
面积的 RSD值均小于 56%。说明供试品溶液在
24h内稳定。
2.1.8 样品测定 分别精密称取表1中的32批样
品,按2.1.2项下供试品制备方法制备并测定,记录
色谱图(图2)。
1~21.共有峰;4.羟基红花黄色素A;8.6羟基山柰酚3O
葡萄糖苷;10.芦丁;11.槲皮素3O葡萄糖苷;
14.山柰酚3O芸香糖苷
图2 32批红花样品HPLCECD指纹图
2.2 羟基红花黄色素A的含量测定
2.2.1 色谱条件 同2.1.1。
2.2.2 供试品溶液的制备 同2.1.2。
2.2.3 线性关系考察 精密称取羟基红花黄色素
A对照品220mg,甲醇溶解,定容至25mL量瓶中,
即得对照品溶液。精密吸取对照品溶液10,50,
70,100,150μL,以峰面积对进样量进行回归,得
到线性回归方程 Y=4E+06X+86406,r=
09994,在0088~132μg有良好线性关系,其最
小检测限(S/N=3)088ng,定量限(S/N=3)为
440ng。
2.2.4 精密度试验 取同一供试品溶液连续进样
5次,每次1μL,羟基红花黄色素 A峰面积的 RSD
35%。结果表明仪器精密度良好。
2.2.5 稳定性试验 分别在0,4,8,12,24h精密
吸取同一供试品溶液进样1μL,注入高效液相色谱
仪测定,结果表明羟基红花黄色素 A峰面积的 RSD
35%。说明样品在室温条件下24h稳定。
2.2.6 重复性试验 取同一红花药材样品五份,按
供试品溶液制备项下制备样品,精密吸取供试品溶
液1μL,注入高效液相色谱仪测定,羟基红花黄色
素A质量分数平均值为124%,RSD25%。
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2.2.7 回收率试验 精密吸取0337g·L-1的羟
基红花黄色素A对照品溶液20mL×6,吹干;再精
密称定已知羟基红花黄色素 A含量的红花样品
050g×6份,按供试品溶液制备项下制备,在上述
色谱条件下测定,羟基红花黄色素 A平均回收率为
999%,RSD23%,结果见表1。
表1 羟基红花黄色素A加样回收率
No.
样品中量
/μg
测得值
/μg
回收率
/%
平均值
/%
RSD/%
1 0658 1306 961    
2 0651 1314 984    
3 0652 1327 1001
999 23
4 0632 1321 1022    
5 0633 1312 1007    
6 0626 1313 1019    
  注:加入量为0674μg
2.2.8 样品测定 分别精密称取表1中的32批样
品,按2.1.2项下供试品制备方法制备并在上述色
谱条件下测定,羟基红花黄色素A的含量。
2.3 腺苷的含量测定
2.3.1 色谱条件 采用 HPLCUV检测,Diamonsil
C18色谱柱(46mm×250mm,5μm),流动相水乙
腈(95∶5),流速10mL·min-1,柱温40℃,检测波
长260nm。腺苷和红花样品的色谱图见图3。
1.腺苷
图3 腺苷对照品(A)和红花样品(B)的色谱图
2.3.2 供试品溶液的制备 取样品粉末100g,精
密称定,置 50mL三角瓶中,精密加入稀乙醇 10
mL,称重,室温超声30min,冷却,补足失重。滤过,
取续滤液过02μm滤膜,即得供试品溶液。
2.3.3 线性关系考察 精密称取腺苷对照品537
mg,用甲醇溶解,定容至100mL量瓶中,进样体积
分别为05,10,50,70,100μL,以峰面积对进
样量进行回归,得到线性回归方程:Y=3E+06X+
41377,r=09991,0027~0537μg有良好线性
关系,其最小检测限(S/N=3)为1343ng,定量限
(S/N=10)为10740ng。
2.3.4 精密度试验 取同一供试品溶液连续进样
5次,每次5μL,腺苷峰面积的RSD28%。结果表
明仪器精密度良好。
2.3.5 稳定性试验 分别在0,4,8,12,24h精密
吸取同一供试品溶液5μL,注入高效液相色谱仪测
定,结果表明,腺苷峰面积的 RSD23%。说明样品
在室温条件下24h稳定。
2.3.6 重复性试验 取同一红花药材样品5份,按
供试品溶液制备项下制备样品,精密吸取供试品溶
液5μL,注入高效液相色谱仪测定,得到腺苷含量
的平均值为027‰,RSD19%。
2.3.7 回收率试验 精密吸取00537mg·mL-1
的腺苷对照品溶液2mL×6,吹干;再精密称定已知
腺苷含量的红花样品050g×6份,按供试品溶液
制备项下制备,在上述色谱条件下测定,腺苷平均回
收率为1006%,RSD23%,见表2。
表2 腺苷加样回收率
样品中量
/μg
测得值
/μg
回收率
/%
平均值
/%
RSD/%
0066 0121 1024    
0068 0123 1024    
0062 0116 1006
1006 23
0060 0113 987    
0056 0111 1024    
0059 0111 968    
  注:加入量为00537μg
2.3.8 样品测定 分别精密称取表3中的32批样
品,按2.3.2项下制备方法制备供试品溶液,并按
2.3.1色谱条件测定,腺苷的含量见表3。
2.4 红色素的吸光度的测定
取各产地红花样品粉末约025g,精密称定,置
锥形瓶中,加80%丙酮溶液50mL,连接冷凝器,置
50℃水浴上温浸90min,放冷,用3号玻璃垂熔漏
斗滤过,收集滤液于100mL量瓶中,用80%丙酮溶
液25mL分次洗涤,洗液并入量瓶中,加80%丙酮
溶液至刻度,摇匀,照分光光度法,在518nm的波长
处测定吸光度。结果见表3。
3 结果与讨论
从图2中看出红花中化合物按水溶性色素类,
黄酮苷类,脂溶性色素类和黄酮苷元依次洗脱。以
药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价
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   表3 红花样品羟基红花黄色素、腺苷质量分数及红色系吸光度(n=2)
No 购买地/采收地 采/收集日期 产地 羟基红花黄色素A/% 腺苷/‰ 红色素A
1 新疆乌鲁木齐 2006-05 新疆 181 021 0367
2 河南驻马店 2006-01 新疆 202 026 0423
3 河北保定 2006-01 新疆 149 016 0390
4 河北安国 2006-01 新疆 230 033 0460
5 四川盐源 2006-01 四川 035 014 0487
6 江苏南京 2006-01 新疆 127 016 0308
7 山东冠县 2006-01 新疆 258 024 0447
8 云南昆明 2006-01 云南 262 028 0289
9 广西柳州 2006-01 河南 127 018 0547
10 陕西宝鸡 2006-01 不详1) 244 036 0404
11 河南西峡 2006-05 河南西峡 081 011 0424
12 江西进贤 2007-02 新疆 223 026 0276
13 安徽南京 2007-02 新疆 198 029 0326
14 江西南昌 2007-02 新疆 301 039 0371
15 湖南益阳 2007-02 不详1) 195 028 0339
16 山东郓城 2007-02 不详1) 248 032 0339
17 河南息县 2007-02 河北安国 219 032 0265
18 北京 2007-02 河南 358 049 0395
19 福建黄塘 2007-02 四川 099 020 0276
20 河南延津 2006-07 河南延津 350 - 0298
21 河南新乡 2007-04 河南新乡 068 003 0468
22 河南新乡 2007-04 新疆 124 040 0311
23 河南开封 2007-04 河南开封 121 030 0337
24 河南杞县 2007-04 河南杞县 081 021 0339
25 北京 2007-05 河南 154 042 0353
26 北京 2007-05 河南 141 042 0360
27 云南大理 2007-05 云南大理 141 019 0385
28 云南昆明 2007-05 云南 179 021 0305
29 四川农业科学院 2007-07 四川简阳 161 021 0634
30 四川农业科学院 2007-07 四川简阳 185 012 0426
31 云南大理 2007-07 云南大理 152 018 0202
32 云南大理 2007-07 云南大理 140 025 0221
系统(A版)”对上述32批红花样品指纹图谱进行
分析,根据匹配结果确定了 21个共有峰,峰 4,8,
10,11和14分别为羟基红花黄色素 A、6羟基山柰
酚3O葡萄糖苷、芦丁、槲皮素3O葡萄糖苷和山
柰酚3O芸香糖苷的色谱峰,其中羟基红花黄色素
A的峰面积最大。峰15经高效液相色谱质谱分离
测定得到分子离子峰 593[M-H]-,碎片峰 m/z
285,284,257,167,163,147,145,根据文献初步判定
为红花黄色素A。各色谱图中共有峰总面积占所有
色谱峰峰面积 84%以上。各共有峰保留时间的
RSD在001% ~074%。除了第5批(四川产,相
似系数为0478)和第 11批(河南产,相似系数为
0863)样品外,其余30批样品色谱图与对照指纹图
谱相似度均大于0914。另外,云南产红花槲皮素
3O葡萄糖苷和山柰酚3O芸香糖苷的峰面积比其
他产地样品大。在部分样品中可检出槲皮素(tR
47378)和山柰酚(tR58696)。
32批红花样品羟基红花黄色素 A的质量分数
为035% ~358%;腺苷的质量分数为 003‰ ~
049‰;红色素的吸光度在 0202~0634,与文献
报道[810]的大致相同。样品中所测成分的质量分数
与产地有一定的关系:河南、四川产的红花(18号除
外)羟基红花黄色素 A的质量分数均低于185%;
云南、四川产的红花腺苷质量分数较低,均不高于
028‰,而河南、新疆产的红花腺苷含量则有高有
低,无规律性;云南产的红花红色素吸光度较低。
本试验中作者采用了2种检测器,紫外检测器
主要用于指纹图谱中色谱峰的鉴别和腺苷的含量测
定;由于电化学检测器的灵敏度要优于紫外检测器,
如羟基红花黄色素 A电化学检测的最小检测限为
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088ng,紫外检测为824ng;含量较低的黄酮化合
物在电化学检测器下能被检出,故采用高效液相色
谱电化学检测技术建立了指纹图谱和羟基红花黄
色素A含量同时测定的方法。
以羟基红花黄色素 A为对照品,在 0~
+1050mV检测电位下测定其电流值,描绘电流电
位曲线图。结果表明,羟基红花黄色素 A在 +600
mV处开始氧化,在 +1000mV时氧化电流达最高
值,因检测电位的升高使得噪音值加大,且基线不
稳,故选择+800mV作为检测电位。
对料液比、提取溶剂、提取方法、提取温度和提
取时间等因素进行了考察,虽然25%甲醇和水对羟
基红花黄色素 A的提取率均高于 60%乙醇,鉴于
60%乙醇提取信息量较大,故选用60%乙醇作为提
取溶剂。根据文献报道[8]选择了磷酸乙腈为流动
相,比较了10余个梯度条件及不同酸碱度的影响,
根据结果确定了液相色谱条件。
[致谢] 本所林淑芳、邵爱娟、陈敏、何希荣、杨洪军、
王祝举等帮助收集样品。
[参考文献]
[1]  赵 钢,王安虎.红花的资源及药用价值[J].中国野生植物
资源,2004,23(3):24.
[2]  肖培根.新编中药志第2卷[M].北京:化学工业出版社,
2002:689.
[3]  戎惠珍.红花的化学成分及药理研究概况[J].江西中医学院
学报,1997,9(4):45.
[4]  吴 伟,金 鸣,杨树东,等.红花总黄素抑制血小板激活因
子所致毛细血管通透性增加的研究[J].心肺血管病杂志,
1999,18(4):281.
[5]  刘月庆,王 睿,毕开顺.HPLC法测定红花中红花黄色素 A
的含量[J].药物分析杂志,2004,24(4):356.
[6]  陈新发,张林海.RPHPLC法测定红花中6羟基山柰酚3O
葡萄糖苷含量[J].中华现代临床医学杂志,2003,1(8):73.
[7]  周晓英,张立新,张 良,等.红花的HPLC指纹图谱分析方法
研究[J].中成药,2002,24(5):325.
[8]  赵明波,邓秀兰,王亚玲,等.红花 RPHPLC指纹图谱的建立
及其质量研究[J].药学学报,2004,39(3):212.
[9]  孙 沂,郭 涛,隋 因,等.高效毛细管电泳法同时测定红花
中腺苷、芦丁和槲皮素的含量[J].药学学报,2003,38(4):283.
[10] 中国药典.一部[S].2005:103.
QualityevaluationofFlosCarthami
WANGRuojing,YANGBin,FUMeihong
(InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)
[Abstract] Objective:TodevelopmethodsforqualitativeandquantitativeanalysesofFlosCartnamifromthreeaspects,pig
ments,flavonoidsandadenosine.Method:AmethodusingHPLCcoupledwithelectrochemicaldetectorwasdevelopedtodetermine
thecontentofhydroxysafloryelowAandfingerprintofFlosCarthami.ThechromatographicseparationwasperformedonaZorbaxSB
C18column(46mm×250mm,5μm)bygradientelutionwithphosphatebuferandacetonitrileataflowrateof10mL·min
-1,
thecolumntemperaturewas35℃,thereferenceelectrodewasISAAC(insitusilver/silverchloride),theworkingelectrodewas
glassycarbon,thecounterelectrodewasPt,andtheappliedpotentialwas+800mV.Concentrationofadenosinewasdeterminedby
HPLCUVonanDiamonsilC18column(46mm×250mm,5μm)withwateracetonitrile(95∶5)asmobilephase,theflowratewas
10mL·min-1,thecolumntemperaturewas40℃ andthedetectionwavelengthwas260nm.Thecontentofcartharminwasdetected
usingaspectrophotometricmethod.Result:Twentyonecommonchromatographicpeakswereselectedascharacteristicpeaksinthe
chromatogramofsamplesolutionofFlosCartnami.SevenpeakswereidentifiedashydroxysafloryelowA,6hydroxykaempferol3O
glucoside,rutin,quercetin3Oglucoside,kaempferol3Orutinoside,quercetin,kaempferol.ThecontentsofhydroxysafloryelowA
andadenosinewerefrom035% to358% andfrom003‰ to049‰,respectively.Conclusion:Themethodscanbeusedtoevalu
atethequalityofFlosCarthami.
[Keywords] FlosCarthami;HPLCelectrochemicaldetection;HPLCUV;determination;fingerprint
[责任编辑 王亚君]
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第33卷第22期
2008年11月
         
    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 22
 November,2008