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≈ts 王浴生 o邓文龙 o薛春生 q中药药理与应用 ≈ q u版 q北
京 }人民卫生出版社 o t||{}|swq
≈tt 王 斌 o陈敏珠 o徐叔云 q白芍总甙对大鼠腹腔巨噬细胞产
生肿瘤坏死因子的调节机制 ≈ q中国药理学通报 ot||zotv
kvl}uxxq
≈tu 李 俊 o梁君山 o周爱武 q白芍总甙对
淋巴细胞增殖和白
介素 t生成的调节作用 ≈ q中国药理学与毒理学杂志 o
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u1 Ινστιτυτε οφ Ιντεγρατεδ ΤραδιτιοναλΧηινεσε ανδ ΩεστΜεδιχινε, Ξιανγψα Ηοσπιταλ, ΧεντραλΣουτη Υνιϖερσιτψ, Χηανγσηα wtsss{, Χηινα;
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≈责任编辑 古云侠
≈收稿日期 ussx2tt2sw
≈通讯作者 3 陶文沂 oר¯}ksxztl{{vusz|yo∞2°¤¬¯}±¬¨¬¬¤²«∏¤usss tuyq¦²°
胃康复组方对小鼠 ≥t{s实体瘤的抑制
及其凋亡诱导作用
聂小华 t o史宝军 u o陶文沂 v3
kt1浙江工业大学 生物与环境工程学院 o浙江 杭州 vvsstw~
u1广东溢多利生物科技股份有限公司 o广东 珠海 xt|sys~
v1江南大学 生物工程学院 o江苏 无锡 utwsvyl
≈摘要 目的 }研究胃康复组方对小鼠 ≥t{s实体瘤的抑制 o探讨其诱导细胞凋亡作用 ∀方法 }造模 ≥t{s荷瘤
小鼠 o随机分为 x组 o胃康复组方按 xuxovxsotzx °ª# ®ªpt # §pt剂量灌胃给药 o造模对照组采用生理盐水灌胃给
#zxwt#
第 vt卷第 tz期
ussy年 |月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφΧηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vto¶¶∏¨ tz
≥ ³¨·¨°¥¨ µoussy
药 o阳性药物组腹腔注射 ux °ª# ®ªpt # §pt环磷酰胺 o连续处理 ts §~考察胃康复组方的抑瘤作用 o并采用流式细
胞仪和 ⁄琼脂糖电泳检测细胞凋亡 !细胞周期分布和凋亡相关基因蛋白表达 ∀结果 }胃康复组方显著抑制小鼠
≥t{s实体瘤的生长 o可诱导肿瘤细胞凋亡 o阻滞细胞周期在 s 2t期 o其凋亡率呈现量效依赖关系 ~可使 ≥t{s细胞
中 ³xvo¥¤¬基因表达上调 o¥¦¯2u基因表达下调 ∀结论 }胃康复组方具有明显的抗肿瘤作用 o通过促进 ³xvo¥¤¬基因
表达和抑制 ¥¦¯2u基因表达 o诱导肿瘤细胞凋亡 ∀
≈关键词 胃康复组方 ~≥t{s实体瘤 ~抑制作用 ~细胞凋亡
≈中图分类号 u{x1x ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukussyltz2twxz2sw
胃康复是无锡市第三人民医院尹光耀教授的临
床验方 k专利申请号为 sstszu{s1vlo多年实践证
明 o该验方在治疗胃炎胃癌前期病变方面具有明显
的疗效 ≈to u ∀在原方的基础上 o本研究室选用温莪
术 !黄芪 !甘草 !茯苓等中药 o按照科学方法提取有效
成分精心制备出胃康复组方 o其主要成分由多糖 !皂
苷 !黄酮 !挥发油等组成 ∀本研究探讨了胃康复组方
的体内抗肿瘤作用 o及其对肿瘤细胞凋亡的诱导作
用 o为其在临床的推广应用提供实验依据 ∀
1 材料
111 药物
胃康复组方 o本研究室制备 ~注射用环磷酰胺
k≤¼lo江苏恒瑞医药股份有限公司生产 ∀
112 试剂和仪器
碘化丙啶 k°l!溴化乙锭 k∞
l!蛋白酶 !核糖
核酸酶 k ¤¶¨lo≥¬ª°¤公司产品 ~ƒ×≤ 2羊抗鼠 ª
单克隆抗体 o
²¶·¨µ公司产品 ~鼠抗人 ³xvo
¤¬o
¦¯2
u单克隆抗体 o≥¤±·¤ ≤µ∏½¨ 公司产品 ~流式细胞仪 o
美国
¦¨·²± §¬¦®¬±¶²±公司 ~电泳仪 o
¬²2µ¤§公司 ∀
113 细胞株和动物
小鼠实体瘤 ≥t{s细胞 o购于上海市细胞研究
所 o采用常规方法小鼠体内腹腔传代 ~昆明种小鼠 o
体重 kus ? ulªo雌雄兼用 o购于江苏省无锡山禾制
药公司 ∀
2 方法
211 对小鼠 ≥t{s实体瘤的抑制试验
无菌抽取小鼠腹腔内连续传代的 ≥t{s细胞 o用
生理盐水调整细胞含量至 t ≅ tsz # °pt o小鼠右腋
下皮下接种 o接种体积 s1u °∀动物随机分组 o每
组 ts只 ~接种次日胃康复分高 !中 !低 v个剂量
kxuxovxsotzx °ª# ®ªpt # §pt l灌胃给药 ~模型对照
组用生理盐水灌胃 o阳性药物组采用环磷酰胺 k≤¼l
腹腔注射给药 oux °ª# ®ªpt # §pt ∀连续给药 ts §o
停药后次日称重 o引颈处死小鼠 o取其肿瘤组织 o称
重 o计算抑瘤率 ∀
抑瘤率 kh l kt p给药组平均瘤重 r
模型对照组平均瘤重 l ≅ tssh
212 肿瘤细胞悬浮液的制备
取新鲜肿瘤组织适量 o置于 s1st °²¯# pt °
≥
溶液中 o用机械方法将其分散成细胞 o过 uss目滤网
得到单细胞悬液 o离心 kt sss µ# °¬±pt otx °¬±l洗
涤后 o调整细胞数为 t ≅ tsy # °pt ∀
213 流式细胞仪分析凋亡率及细胞周期
取 t °肿瘤细胞悬浮液离心 o加入预冷的 zsh
乙醇 o于 w ε 固定 uw «o离心 kt sss µ# °¬±pt otx °¬±l
洗涤后 o细胞加 t °°染液 ks1st °²¯# pt o³ z1u
°
≥配制 o含 tss Λª# °pt °otss Λª# °pt
¤¶¨lo充分分散 ow ε 下暗染 vs °¬±ouss目滤网过
滤 o上流式细胞仪检测 ≈v ∀
214 ⁄凝胶电泳
取 v °肿瘤细胞悬浮液离心 o加入 s1x °细
胞裂解液 kts °°²¯ # pt ×µ¬¶2≤ o¯ ³ {1s~txs
°°²¯ # pt ¤≤ ~¯ts °°²¯ # pt ∞⁄×~s1wh ≥⁄≥~
tss Λª# °pt蛋白酶 lo于 xs ε 下处理 v «~等体
积苯酚 !氯仿 r异戊醇 kuwΒtl依次提取后 o加入 u倍
体积预冷的无水乙醇及 tsh 体积 v1s °°²¯ # pt
¤¦k³ x1ulo p us ε 过夜 ~离心 kts sss µ#
°¬±pt ovs °¬±lo所得 ⁄用 zxh乙醇洗涤后 o室温
干燥 o适量 ×∞缓冲溶液溶解 o加入 ¤¶¨溶液 k终
含量 us Λª# °pt lovz ε 下处理 t «∀取制备的
⁄样品 o在 t1xh琼脂糖凝胶上电泳约 u «o电泳
缓冲液为 ×
∞≈wox ∀
215 检测凋亡调控相关基因的蛋白表达
取 t °肿瘤细胞悬浮液离心 o加入预冷的
zsh乙醇 o于 w ε 固定 uw «o离心洗涤后 o细胞分别
加 tss Λ³xvo¥¤¬o¥¦¯2u一抗工作液 ovz ε 下处理
vs °¬±o°
≥洗 u次以除去多余的一抗工作液 o加
tss Λ荧光标记的二抗 ƒ×≤ 2ª k使用前 tΒus稀
释 lovz ε 下处理 vs °¬±o°
≥洗 u次以除去多余的
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第 vt卷第 tz期
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφΧηινεσε Ματερια Μεδιχα
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≥ ³¨·¨°¥¨ µoussy
二抗 o加 t °°
≥分散 o上流式细胞仪检测 ∀
216 数据处理
采用 ≥°≥≥软件处理数据 ∀所有数据均以 cξ ? σ
表示 o各组间比较采用 τ检验 ∀
3 结果
311 对小鼠 ≥t{s实体瘤生长的抑制作用 实验结
果表明 o胃康复组方在对宿主生存数和动物增重均无
明显影响的情况下 o对小鼠 ≥t{s实体瘤的生长有明
显的抑制作用 o其抑瘤率分别为 vs1wvh owy1zuh o
xw1vxh o抑制作用与剂量存在正相关 k表 tl~并且试
验中发现胃康复组方给药后小鼠的进食 !精神状态和
皮毛光亮均好于模型对照组 ∀虽然环磷酰胺的抑瘤
率可达 yv1swh o但由于其毒副作用大 o明显影响了动
物体重 o而且致使小鼠少毛 !无精神等 ∀
表 t 胃康复组方对小鼠 ≥t{s实体瘤生长
的抑制作用 kcξ ? σ, ν tsl
组别
剂量
r°ª# ®ªpt
平均体重
rª
平均瘤重
rª
抑瘤率
rh
模型对照 p uyqs ? tq{ sq|u ? sqvx
胃康复 tzx uxq| ? uq| sqyw ? sqvwtl vsqwv
vxs uyqy ? uqx sqw| ? squuul wyqzu
xux uxqu ? tqw sqwu ? sqwsul xwqvx
≤¼ ux t|q{ ? uqttl sqvw ? squyul yvqsw
注 }与模型对照组相比 t) Π s. sx, u) Π sqstk表 u同 l
312 对小鼠 ≥t{s实体瘤细胞的凋亡率及细胞周期
的影响
由流式细胞仪分析结果可知 o模型对照组和胃
康复组均出现了典型的 ⁄亚二倍体峰 o其中对照
组凋亡率仅为 u1|h o可能是自发性细胞凋亡 ~而胃
康复组凋亡率分别为 tu1vh ot{1|h ous1xh o且存
在量效依赖关系 k表 ul∀比较细胞周期分布 o随着
胃康复组方剂量的增加 o≥t{s实体瘤细胞的 s 2t
期细胞比例明显增加 o而 ≥期 !u 2 期细胞比例则
相应有所下降 o表明胃康复组方为 s 2t期特异性 o
通过将细胞周期阻滞在 s 2t期而影响细胞的生
长 o进而诱导细胞发生凋亡 ∀
表 u 胃康复组方对 ≥t{s实体瘤细胞的凋亡率
及细胞周期的影响 kcξ ? σ, ν xl h
组别
剂量
r°ª# ®ªpt
凋亡率 s 2t ≥ u 2
模型对照 p uq| ? sqxy xtqw ? xqts vsq| ? wqu| t{qw ? vqsw
胃康复 tzx tuqv ? sq|ttl xxqz ? xqwz uzqu ? vqux tzqs ? uqy{
vxs t{q| ? tqzzul x|q{ ? zqst uwqy ? vqty txq| ? uqzs
xux usqx ? tq{xul yuqv ? yqx{tluvqx ? uq{v txqt ? uqux
313 ⁄琼脂糖凝胶电泳
细胞发生凋亡时 o较显著的生化标志是 ⁄被
核酸内切酶在核小体单位之间降解 o断裂为 t{s ∗
uss ¥³的片段 o在琼脂糖电泳上呈现出梯状 ⁄区
带图谱 k⁄ ¤¯§§¨ µl≈y ∀由图 t可知 o胃康复组方
连续给药 ts §后 o不同剂量处理的 ≥t{s实体瘤细
胞均出现了明显的 ⁄ ¤¯§§¨ µo并随着剂量增加而
强度增大 o进一步证实了胃康复组方诱导了 ≥t{s实
体瘤细胞的凋亡 ∀
图 t ≥t{s实体瘤细胞的 ⁄琼脂糖电泳图
314 对凋亡相关基因蛋白表达的影响
经 tzxovxsoxux °ª# ®ªpt # §pt剂量的胃康复
处理 ts §后 o≥t{s实体瘤细胞中的 ³xvo¥¤¬基因表
达水平明显提高 o分别从模型对照组的 w{1|h o
wu1{h 增加到 xw1xh oyv1zh oyz1sh 和 w{1th o
xv1xh oxx1|h ~而 ¥¦¯2u基因表达水平降低 o从模型
对照组的 xs1yh 降至 wy1wh o ws1{h o v|1uh ∀
≥t{s实体瘤细胞中 ¥¤¬与 ¥¦¯2u比值的升高 o有利
于肿瘤细胞凋亡的发生 ∀
4 讨论
胃康复组方由多种中药有效成分组成 o其中
植物多糖占有很大的比例 ∀试验结果显示 o该组
方对 ≥t{s实体瘤生长具有明显的抑制作用 o可诱
导肿瘤细胞凋亡 o其凋亡率呈现量效关系 ~胃康复
组方能显著阻滞细胞周期于 s 2t期 o阻止细胞
从 s 2t期进入 ≥期的进程 o从而干扰肿瘤细胞蛋
白质代谢和 ⁄复制 o诱导肿瘤细胞凋亡 o抑制
肿瘤的生长 ∀
细胞凋亡过程中 o多种凋亡相关基因参与了凋
亡的调控 o如 ³xvo¥¦¯2uo¦2°¼¦和 ƒ¤¶等基因家族
等 ≈z ∀ ³xv通过影响 ⁄复制和修复来阻滞细胞
周期 o进而诱发细胞凋亡 ~¥¦¯2u是目前较为公认的
抗凋亡基因 o其高表达可以引发肿瘤和明显延长细
胞的生长期 o而 ¥¤¬可与 ¥¦¯2u形成二聚体 o解除
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第 vt卷第 tz期
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφΧηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vto¶¶∏¨ tz
≥ ³¨·¨°¥¨ µoussy
¥¦¯2u蛋白对细胞凋亡的抑制 o从而促进细胞凋亡 o
¥¤¬r¥¦¯2u比例的增加可导致肿瘤中增殖活性较高
的细胞首先出现凋亡 ≈{ ∀试验结果表明 o胃康复组
方可使 ≥t{s细胞中 ³xvo¥¤¬基因表达上调 o¥¦¯2u
基因表达下调 o从而改变 ¥¤¬与 ¥¦¯2u比值 ∀
通过本实验作者得出如下结论 }胃康复组方能
通过促进 ³xvo¥¤¬基因表达和抑制 ¥¦¯2u基因表达 o
调控细胞周期 o诱导 ≥t{s细胞凋亡而发挥抗肿瘤作
用 ~关于胃康复组方对其他细胞株的体内抗肿瘤试
验有待于进一步研究 ∀
≈参考文献
≈t 尹光耀 o张武宁 o李国成 o等 1胃康复治疗脾虚证胃癌前病变
的疗效及其作用机理的研究 ≈ 1 中国中西医结合杂志 o
ussso uskvl} tzy1
≈u 尹光耀 o许福昌 o张武宁 o等 1胃康复治疗脾虚证胃癌前病变
对胃黏膜组织细胞病理学的影响 ≈ 1中国中西医结合外科
杂志 o usssoykwl} uwt1
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≈x 刘洪尊 o李电东 o甄永苏 o等 1力达霉素增强顺铂诱导人肝癌
∞2zwsu细胞凋亡作用及机制研究 ≈ 1药学学报 o ussvo v{
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Ινηιβιτορψ εφφεχτ οφΩ εικανγφυ ρεχιπε ον γροωτη οφ µ ουσε Σt{s
τυµ ορ ανδ ιτσαποπτοτιχ ινδυχτιον
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(t1Χολλεγε οφ Βιολογιχαλανδ Ενϖιρονµ ενταλΕνγινεερινγ , Ζηεϕιανγ Υνιϖερσιτψ οφ Τεχηνολογψ, Ηανγζηου vtsstw, Χηινα;
u1 Γυανγδονγ ςΤΡ ΒΙΟ2ΤΕΧΗ Χο1 , Λτδ, Ζηυηαι xt|sys, Χηινα;
v1Σχηοολοφ Βιοτεχηνολογψ, Σουτηερν Ψανγτζε Υνιϖερσιτψ, Ωυξι utwsvy, Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ ¶·∏§¼ ·«¨ ªµ²º·«¬±«¬¥¬·¬²± ²©• ¬¨®¤±ª©∏µ¨¦¬³¨ ²± ≥t{s ·∏°²µ¤±§¬·¶¤³²³·²·¬¦¬±§∏¦·¬²±1 Μετη2
οδ : ≥t{s2¥¨ ¤µ¬±ª°¬¦¨ º µ¨¨ ²µ¤¯ ¼¯ ¤§°¬±¬¶·µ¤·¨§º¬·«§¬©©¨µ¨±·§²¶¤ª¨ ¶²©• ¬¨®¤±ª©∏µ¨¦¬³¨ o ¤±§·«¨ ªµ²º·«¬±«¬¥¬·¬²± º¤¶ √¨¤¯∏¤·¨§~
¤³²³·²·¬¦¦¨¯¯¶¬±§∏¦¨§º µ¨¨ §¨ ·¨¦·¨§¥¼ ©¯²º ¦¼·²° ·¨µ¼ ¤±§⁄ ¤ª¤µ²¶¨ ª¨ ¯¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶1 Ρ εσυλτ: • ¬¨®¤±ª©∏µ¨¦¬³¨ ¶«²º §¨¶¬ª±¬©¬2
¦¤±·¬±«¬¥¬·¬²± ²± ·«¨ ªµ²º·«²©≥t{s ·∏°²µ¬± ¤§²¶¨2§¨ ³¨ ±§¨ ±·°¤±± µ¨o ¦²°³¤µ¨§º¬·«·«¨ ¦²±·µ²¯ ªµ²∏³1 ƒµ²° ¤³²³·²·¬¦¤±¤¯¼¶¨¶o
• ¬¨®¤±ª©∏µ¨¦¬³¨ ¬±§∏¦¨§¤§²¶¨2§¨ ³¨ ±§¨ ±·¤³²³·²¶¬¶²©≥t{s ·∏°²µ¦¨¯¯¶¤±§¤µµ¨¶·¨§·«¨ ¦¨ ¯¯ ¦¼¦¯¨§¬¶·µ¬¥∏·¬²± ¤·s 2t ³«¤¶¨1 ·
·«¨ ¶¤°¨·¬° o¨ ·«¨ ∏³2µ¨ª∏¯¤·¬²± ²©³xv ¤±§¥¤¬¤±§§²º±2µ¨ª∏¯¤·¬²± ²©¥¦¯2u º µ¨¨ ²¥¶¨µ√ §¨¬± ≥t{s ·∏°²µ¦¨¯¯¶²©·«¨ ·µ¨¤·¨§ªµ²∏³¶1
Χονχλυσιον: ∏µ©¬±§¬±ª¶§¨ °²±¶·µ¤·¨·«¤·• ¬¨®¤±ª©∏ µ¨¦¬³¨ ¦¤± ¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼ ¬±«¬¥¬··«¨ ªµ²º·« ²©≥t{s ·∏°²µ¤±§¬±§∏¦¨ ¤³²³·²¶¬¶
·«µ²∏ª« ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¤¯·¨µ¤·¬²± ²©³xvo ¥¤¬¤±§¥¦¯2u1
[ Κεψ ωορδσ] • ¬¨®¤±ª©∏µ¨¦¬³¨ ~ ≥t{s ·∏°²µ~ ¬±«¬¥¬·²µ¼ ©¨©¨¦·~ ¤³²³·²¶¬¶
≈责任编辑 古云侠
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第 vt卷第 tz期
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Χηινα ϑουρναλοφΧηινεσε Ματερια Μεδιχα
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