全 文 ：Ａｓ２Ｏ３对大鼠生精细胞凋亡及其 Ｂｃｌ２／Ｂａｘ
表达的变化
陈 伟，舒小林，陆 祥，李季蓉
（遵义医学院 组织学与胚胎学教研室，贵州 遵义 ５６３００３）
［摘要］ 目的；观察不同剂量的染砷（Ａｓ２Ｏ３）大鼠生精细胞凋亡及其Ｂｃｌ２／Ｂａｘ表达的变化。方法：４０只健康
雄性ＳＤ大鼠随机分成４组，分别为０３７５，０７５，１５ｍｇ·ｋｇ－１３个染毒组和正常正常组，灌胃法连续给药１６周后
处死，对各组大鼠进行睾丸脏器系数、精子头计数，并计算每日精子生成量（ＤＳＰ）。采用ＴＵＮＥＬ法检测大鼠生精细
胞凋亡，免疫组化法检测大鼠生精细胞Ｂｃｌ２／Ｂａｘ的表达。结果：①与正常组相比，中剂量组（０７５ｍｇ·ｋｇ－１）和高
剂量组（１５ｍｇ·ｋｇ－１）睾丸精子头计数和 ＤＳＰ均显著降低（Ｐ＜００１），生精细胞凋亡指数（ＡＩ）显著升高（Ｐ＜
００１），生精细胞Ｂｃｌ２阳性产物表达明显降低（Ｐ＜００１），Ｂａｘ表达明显升高（Ｐ＜００１）；②ＤＳＰ与生精细胞 ＡＩ呈
负相关（ｒ＝－０５６３，Ｐ＜００１）；③生精细胞凋亡与Ｂｃｌ２表达呈负相关（ｒ＝－０８２５，Ｐ＜００１），与Ｂａｘ表达呈正相
关（ｒ＝０７１０，Ｐ＜００１）。结论：一定剂量的Ａｓ２Ｏ３可通过抑制生精细胞Ｂｃｌ２和促进Ｂａｘ的表达，诱导生精细胞凋
亡增加而导致精子生成量的减少，产生雄性生殖毒性。
［关键词］ 大鼠；三氧化二砷；生精细胞；Ｂｃｌ２；Ｂａｘ
［中图分类号］Ｒ２８５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）２３２８２３０５
［收稿日期］ ２００８０６０４
［基金项目］ 贵州省科技厅国际合作重点项目（黔科合 Ｊ字
［２００６］２０７８）
［通讯作者］ 陈伟，Ｔｅｌ：（０８５２）８６０９４９０，Ｅｍａｉｌ：ｊｃｂｚｕｐｅｉ＠
１６３．ｃｏｍ
近年来Ａｓ２Ｏ３等砷剂已作为治疗白血病主要的
有效药物广泛应用［１］，在其他恶性肿瘤治疗方面也
有越来越多的研究和应用。但有关药物砷在临床应
用中所产生毒副作用的研究，特别是生殖毒性的研
究少见报道。本实验通过观察不同剂量砷对大鼠睾
丸脏器系数、精子头数、每日精子生成量、生精细胞
凋亡及Ｂｃｌ２／Ｂａｘ表达的影响，探讨砷的生殖毒性
及其分子机制。
１ 材料
１．１ 动物 健康雄性 ＳＤ大鼠清洁级，体重（１５０±
１０）ｇ，由重庆第三军医大学实验动物中心提供，许
可证号 ＳＣＸＫ（渝）２００２０００３。
１．２ 药物 三氧化二砷（Ａｓ２Ｏ３），纯度＞９９０％（美国
Ｓｉｇｍａ公司）由遵义医学院附属医院皮肤与性病科惠
赠。精确称取１ｇＡｓ２Ｏ３置于烧杯中，加入２００ｍＬ双
蒸水，加热至沸腾（其间间断加入双蒸水），待其充分
溶解后，冷却并定容至２００ｍＬ，混匀，即得５ｍｇ·Ｌ－１
Ａｓ２Ｏ３原液，于４℃冰箱保存备用。实验时，按照实验
要求，用双蒸水稀释成不同浓度的Ａｓ２Ｏ３水溶液。
１．３ 试剂 原位细胞凋亡检测（ＴＵＮＥＬ）试剂盒，
（德国 Ｒｏｃｈｅ公司）；Ｂｃｌ２／Ｂａｘ兔抗人、大鼠多克隆
抗体（Ｓａｎｔｃｒｕｚ公司）；羊抗兔免疫组化试剂盒（北
京中杉公司）。
２ 方法
２．１ 分组及染毒 ４０只大鼠随机分为４组，即正
常组、Ａｓ２Ｏ３０３７５，０７５，１５ｍｇ·ｋｇ
－１３个染毒组，
每组１０只，依据１／１０ＬＤ５０为高剂量，并按２倍递减
设置中、低剂量连续灌胃１６周，每日１次，按体重
灌胃００１ｍＬ·ｇ－１给予，正常组相同方法给予等量
双蒸水。
２．２ 睾丸组织病理学检查 颈椎脱臼法处死大鼠，
分离睾丸在生理盐水中漂洗，滤纸吸干，立即称重，
计算睾丸脏器系数。睾丸组织常规固定、包埋、切
片、ＨＥ染色后于光镜下观察生精上皮细胞的层次
和形态结构。
２．３ 每日精子生成量（ｄａｉｌｙｓｐｅｒｍｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ＤＳＰ）
大鼠睾丸精子头计数及 ＤＳＰ计算，参考 Ｂｌａｚａｋ
等［２］方法进行。
２．４ ＴＵＮＥＬ法检测生精细胞凋亡 取睾丸组织石
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蜡切片按试剂盒说明书操作步骤进行。光镜下凋亡
细胞核特异性染色呈棕黄褐色，胞浆为浅棕色，经苏
木素复染后非凋亡细胞为浅紫蓝色。以不含ＴｄＴ的
标记液代替ＴＵＮＥＬ反应混合物作为阴性对照；以标
本预先用ＤＮａｓｅＩ（１０ｍｇ·Ｌ－１）室温处理１０ｍｉｎ作
为阳性对照。存在凋亡生精细胞的生精小管为阳性
生精小管，２００倍镜下随机选择１０个阳性生精小管，
计数凋亡生精细胞数和总生精细胞数，计算出凋亡细
胞百分率即生精细胞凋亡指数（ａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｅｘ，ＡＩ）。
２．５ Ｂｃｌ２，Ｂａｘ表达的检测 免疫组化法检测生精
细胞 Ｂｃｌ２，Ｂａｘ的表达，操作步骤按试剂说明书进
行。以ＰＢＳ代替一抗作为阴性对照，用确诊乳腺癌
切片作为阳性对照。Ｂｃｌ２，Ｂａｘ阳性产物表达于生
精细胞的细胞质，胞质内含棕黄色颗粒。采用 ＢＩ
２０００免疫组化图像分析系统进行Ｂｃｌ２，Ｂａｘ表达半
定量分析，即每张切片于４００倍镜下随机选择１０个
生精小管测阳性产物平均灰度。
２．６ 统计学处理 数据以 珋ｘ±ｓ表示，采用 ＳＰＳＳ
１３０统计软件行单因素方差分析（ｏｎｅｗａｙＡＮＯ
ＶＡ），描述两变量之间的关系采用直线相关分析。
３ 结果
３．１ 睾丸组织病理学观察 正常组睾丸组织生精小
管密集，基膜完整，生精上皮细胞层次清楚，各级生精
细胞正常，管腔中有密集的精子；间质无充血、水肿。
较正常组比，低剂量组无明显变化；中剂量组睾丸生
精上皮细胞结构较疏松，管腔中精子数量减少，小管
间隙增宽，细胞体积缩小；而高剂量组部分生精小管
部分出现基膜溶解，生精上皮细胞层次紊乱，细胞间
隙增大、体积缩小；管腔中有脱落的精子和细胞，成熟
精子数量明显减少，间质出现水肿、渗出。
３．２ 各剂量组睾丸脏器系数、睾丸精子头数及ＤＳＰ
的变化 睾丸脏器系数、精子头计数及 ＤＳＰ低剂量
组与正常组比无显著性差异，中、高剂量组有显著性
差异（Ｐ＜００１）。见表１。
表１ 染砷大鼠睾丸脏器系数、精子头计数及ＤＳＰ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１０）
组别 剂量／ｍｇ·ｋｇ－１ 睾丸脏器系数／％ 精子数／×１０６个／ｇ ＤＳＰ／×１０６个／ｇ／ｄ
正常 － １１４９６±００８８０ ８１４６６±１８３５１ １３３５５±３００８
Ａｓ２Ｏ３ ０３７５ １０５１１±００８６２ ７３３０２±１７６７６ １２０１７±２８９８
０７５ ０９８８３±０１５２２２） ６４３６８±１３６３７１） １０５５２±２２３６１）
１５ ０８６７９±０１４７３２） ５４５００±６０６５２） ８９３４±０９９４２）
注：与对照组比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１（表２，３同）
３．３ 生精细胞凋亡检测 光镜下可见凋亡生精细
胞核固缩，且特异性染成棕黄色或棕褐色。正常组
和低剂量组以精原细胞为主；中、高剂量组以精原细
胞和精母细胞为主（图１）；低剂量组生精细胞ＡＩ稍
高于正常组，但无显著性差异；中、高剂量组生精细
胞 ＡＩ明显升高，与正常组比较具有显著性差异
（Ｐ＜００１）。ＤＳＰ与生精细胞 ＡＩ呈负相关（ｒ＝
－０５６３，Ｐ＜００１）。见表２。
Ａ正常组；ＢＡｓ２Ｏ３０３７５ｍｇ·ｋｇ－１组；ＣＡｓ２Ｏ３０７５ｍｇ·ｋｇ－１组；ＤＡｓ２Ｏ３１５ｍｇ·ｋｇ－１组（图２，３同）
图１ 各组大鼠生精细胞凋亡的变化（ＴＵＮＥＬ，×２００）
表２ 染砷大鼠生精细胞凋亡指数（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１０）％
组别 剂量／ｍｇ·ｋｇ－１ 凋亡指数
正常 － ０５７８±００５７
Ａｓ２Ｏ３ ０３７５ ０６１３±００３２
０７５ ０８３５±００４６２）
１５ １２３８±００６６２）
３．４ 生精细胞 Ｂｃｌ２表达检测 不同剂量组大鼠
睾丸生精细胞内均可检测到 Ｂｃｌ２／Ｂａｘ表达，主要
表达于精原细胞和精母细胞（图２，３）；低剂量组大
鼠生精细胞Ｂｃｌ２／Ｂａｘ表达与对照组比较无显著性
差异；中、高剂量组大鼠生精细胞 Ｂｃｌ２表达明显降
低（Ｐ＜００１），Ｂａｘ表达明显升高（Ｐ＜００１）。生精
细胞凋亡指数与Ｂｃｌ２表达呈负相关（ｒ＝－０８２５，
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图２ 各组大鼠生精细胞Ｂｃｌ２表达（ＩＨＣ，×４００）
图３ 各组大鼠生精细胞Ｂａｘ表达（ＩＨＣ，×４００）
Ｐ＜００１），与 Ｂａｘ表达呈正相关（ｒ＝０７１０，Ｐ＜
００１）。见表３。
表３ 染砷大鼠生精细胞Ｂｃｌ２／Ｂａｘ表达（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１０）
组别
剂量
／ｍｇ·ｋｇ－１
Ｂｃｌ２ Ｂａｘ
对照 － １８３５４４０±１０３９８６ １５０８０５０±８９１１６
Ａｓ２Ｏ３ ０３７５ １７９０５６０±７６６１３ １５６８６１０±８４４１０
０７５ １６１９９８０±８１１７４２） １７６６０９０±６９６６１２）
１５ １５５２８３８±８９３３０２） １７９９５３８±６５４７１２）
４ 讨论
人和动物正常生理性精子发生过程中，各阶段
都存在自发性生精细胞凋亡，并以此维持正常的精
子生成数量。不同动物在环境理化因素如镉、氟、
锰、己烯雌酚等影响下，都会发生生精细胞凋亡增
加，精子生成量减少［３５］。
研究显示，睾丸生精细胞凋亡又受多基因控制，
其中Ｂｃｌ２／Ｂａｘ基因是与之密切相关的原癌基因，
以线粒体途径调控雄性生殖细胞凋亡［６］。孙应彪
等［７］采用免疫组化 ＳＡＢＣ法检测了 ＮｉＳＯ４染毒大鼠
生精细胞中 Ｂｃｌ２，Ｂａｘ表达水平，发现随染毒剂量
的增加，大鼠生精细胞 Ｂｃｌ２蛋白表达减少，而 Ｂａｘ
蛋白表达增多。李广为等［８］实验显示铅可直接或
间接导致大鼠睾丸生精细胞凋亡，并与 Ｂｃｌ２基因
低表达和Ｂａｘ基因高表达相关。
根据本实验结果各组大鼠生精细胞凋亡主要表
达于精原细胞和精母细胞；通过ＤＳＰ与生精细胞ＡＩ
值的相关性分析显示二者之间呈显著负相关，生精
细胞凋亡与 Ｂｃｌ２表达呈负相关，与 Ｂａｘ表达呈正
相关。因此提示，Ａｓ２Ｏ３可通过抑制大鼠生精细胞
Ｂｃｌ２和促进Ｂａｘ的表达，诱导生精细胞凋亡增加，
减少大鼠精子的生成，而发挥其雄性生殖毒性。
由于牛黄解毒片、六神丸、安宫牛黄丸、化风丹、
小儿惊风散、小儿清热片等含砷中药平时易于购买
并具有良好的清热解毒功效，且一般认为中成药毒
副作用小，患者往往自行加大服药剂量和疗程。长
期超量服用含砷中药可能会造成砷在体内的蓄积，
对人体产生毒性作用。朱启上、王燕兰等［９１０］分别
在临床发现，患者长期或超量服用牛黄解毒片会引
起慢性砷中毒。本实验结果观察到，Ａｓ２Ｏ３中、高剂
量组大鼠生精小管及生精细胞形态结构明显破坏，
睾丸脏器系数、睾丸精子头数及 ＤＳＰ显著降低。与
张育等研究一致［１１］。由此提示，随意超剂量、长期
服用含砷中药，可能造成药源性慢性砷中毒，从而导
致生殖毒性。近年来Ａｓ２Ｏ３作为抗肿瘤药在临床得
到广泛应用。Ａｓ２Ｏ３作为抗肿瘤药成人用量一般为
１０～２０ｍｇ·ｄ－１，按人平均体重６０ｋｇ计算，用量为
０１６７～０３３４ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１。根据动物种属用
药剂量换算公式［１２］，大鼠相对应换算剂量为１０～
２０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１。本实验结果表明，０７５ｍｇ·
ｋｇ－１·ｄ－１和１５ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１Ａｓ２Ｏ３已能够明显
诱导大鼠生精细胞凋亡增加产生生殖毒性，且呈剂
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量依赖性，提示临床应用 Ａｓ２Ｏ３治疗各种肿瘤的同
时，应适当考虑其对患者的生殖毒性，尤其是对儿童
白血病患者生殖功能的保护非常重要。
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ＥｆｅｃｔｓｏｆＡｓ２Ｏ３ｏｎａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄＢｃｌ２／Ｂａｘｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
ｒａｔｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｃｅｌｓ
ＣＨＥＮＷｅｉ，ＳＨＵＸｉａｏｌｉｎ，ＬＵＸｉａｎｇ，ＬＩＪｉｒｏｎｇ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｉｓｔｏｌｏｇｙａｎｄＥｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，ＺｕｎｙｉＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｅｇｅ，Ｚｕｎｙｉ５６３００３，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｏｃｃｕｒｅｎｃｅｏｆｇｅｒｍｃｅｌａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｃｌ２／Ｂａｘａｆｔｅｒａｎｉｓｏｄｏｓｅｓ
ａｒｓｅｎｉｃ（Ａｓ２Ｏ３）ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｔｅｓｔｅｓｏｆｔｈｅａｄｕｌｔｍａｌｅｒａｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＦｏｒｔｙｈｅａｌｔｈｙｍａｌｅＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙｒａｔｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄ
ｒａｎｄｏｍｌｙｉｎｔｏｆｏｕｒｇｒｏｕｐｓａｎｄｗｅｒｅａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｗｉｔｈ０（ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ），０３７５，０７５，１５ｍｇ·ｋｇ－１ｏｆＡｓ２Ｏ３ｂｙｉｎｔｒａ
ｇａｓｔｒｉｃａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅｌｙｆｏｒ１６ｗｅｅｋｓ．Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆｔｅｓｔｉｃｕｌａｒｓｐｅｒｍｈｅａｄｗｅｒｅｃｏｕｎｔｅｄａｎｄｔｈｅｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｏｆｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ
ｖｉｓｃｅｒａａｎｄｄａｉｌｙｓｐｅｒｍｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（ＤＳＰ）ｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄｉｎｅｖｅｒｙｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｇｅｒｍｃｅｌｗｅｒｅａｓｓｅｓｓｅｄｂｙｉｎｓｉｔｕｔｅｒｍｉｎａｌ
ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｍｅｄｉａｔｅｄｄＴＵＰｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｃｌ２／Ｂａｘｉｎｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｃｅｌｓ
ｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｇｒａｄｅｓｗｅｒｅｌｏｃａｔｅｄａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｅｄｂｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔ：① ＩｎｔｈｅｔｅｓｔｅｓｏｆＡｓ２Ｏ３ｔｒｅａｔｅｄｒａｔｓ，
ｔｈｅｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｏｆｔｅｓｔｉｃｕｌａｒｖｉｓｃｅｒａ，ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｔｅｓｔｉｃｕｌａｒｓｐｅｒｍｈｅａｄａｎｄＤＳＰｉｎｔｈｅｍｉｄｄｌｅａｎｄｈｉｇｈｄｏｓｅｇｒｏｕｐｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉ
ｃａｎｔｌｙ，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜００１）；ｈｏｗｅｖｅｒｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｅｘｏｆｇｅｒｍｃｅｌ（ＡＩ）ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ
ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜００１）．Ｂｃｌ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉｄｄｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐａｎｄｈｉｇｈｄｏｓｅｇｒｏｕｐｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜００１）．Ｂａｘｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉｄｄｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐａｎｄｈｉｇｈｄｏｓｅｇｒｏｕｐｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜００１）；②ＴｈｅｄｅｐｅｎｄａｂｉｌｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｂｅｔｗｅｅｎＤＳＰａｎｄＡＩｓｈｏｗｅｄａｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｒｅｌａｔｉｏｎ
（ｒ＝－０５６３，Ｐ＜００１）．③ＴｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｒｅｌａｔｉｏｎｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｂｅｔｗｅｅｎＡＩａｎｄＢｃｌ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｃｅｌｓ（ｒ＝－
０８２５，Ｐ＜００１）；ＴｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｒｅｌａｔｉｏｎｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｂｅｔｗｅｅｎＡＩａｎｄＢａｘｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｃｅｌｓ（ｒ＝０７１０，Ｐ＜
００１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＯｎｅｏｆｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｍａｌｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆＡｓ２Ｏ３ｍｉｇｈｔｂｅｔｈａｔＢｃｌ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄａｎｄＢａｘ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｅｎｃｏｕｒａｇｅｄｗｈｉｃｈｉｎｄｕｃｅｓｔｈｅｄｅｃｒｅａｓｅｏｆｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｓｐｅｒｍｃｅｌｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｒａｔ；Ａｓ２Ｏ３；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｇｅｒｍｃｅｌ；Ｂｃｌ２；Ｂａｘ
［责任编辑 古云侠］
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