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Immunoregulatory activity of polysaccharopeptide and astragalus polysaccharides on EAC Tumor-bearing mice

云芝黄芪有效组分对荷瘤小鼠免疫功能的影响



全 文 :云芝黄芪有效组分对荷瘤小鼠免疫功能的影响
李 进,鲍依稀,祝 绚,刘 靖,王宏萍
(重庆医科大学 免疫学教研室 临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室,重庆 400016)
[摘要] 目的:应用云芝黄芪有效组分单方及复方治疗肿瘤小鼠,以此来验证云芝黄芪有效组分单方及复方
抗肿瘤的免疫调节活性。方法:建立艾氏腹水癌(EAC)实体型荷瘤小鼠动物模型,随机分为6组,每组10只:生理
盐水组(NS,01mL·kg-1·d-1)、阿霉素单纯化疗组(AMD,4mg·kg-1·d-1,02mL,连续3d)、云芝糖肽组
(PSP,250mg·kg-1·d-1,02mL)、黄芪多糖组(APS,250mg·kg-1·d-1,02mL)、云芝黄芪复方组(PSP+APS,
250mg·kg-1·d-1,01mL)和阿霉素云芝黄芪综合治疗组(AMD+PSP+APS,用量同上)。分别治疗30d后采用
免疫细胞化学法检测荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞亚群的变化情况,计算脏器指数、抑瘤率,并与对照组及化疗组进
行比较。结果:云芝糖肽组和云芝黄芪复方组小鼠的CD3+,CD4+T细胞百分率以及CD4+/CD8+均显著高于对照
组(P<005),CD8+T细胞的百分率较阿霉素化疗组显著降低(P<005);综合治疗组CD3+,CD4+T细胞百分率
显著高于单纯化疗组(P<005);单纯化疗组小鼠胸腺指数较对照组明显降低(P<005),而综合治疗组的胸腺指
数显著高于单纯化疗组(P<001);并且各给药组肿瘤质量均显著低于NS对照组(P<005)。结论:云芝糖肽、云
芝黄芪复方对荷瘤小鼠及经化疗后的荷瘤小鼠均具有免疫增强作用。
[关键词] 云芝糖肽;黄芪多糖;艾氏腹水癌;淋巴细胞亚群;抑瘤率;脏器指数
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)08092404
[收稿日期] 20070520
[基金项目] 重庆市科学技术委员会基金(CSTC,2006BB5039);
重庆市教育委员会基金(KJ060307);重庆医科大学校办课题启动基金
(QD200540)
[通讯作者] 鲍依稀,Tel:(023)68485813,Email:yixibao@
163.com
  云芝糖肽(polysaccharopeptide,PSP)是云芝
COV1菌株菌丝体中提取出来的主要活性成分,大
量研究表明,云芝糖肽做为生物应答调节剂,具有抗
肿瘤和提高机体免疫功能的作用。目前,云芝糖肽
在临床上主要与放化疗一起使用,用于提高肿瘤患
者机体免疫力。黄芪为中医补气的要药,现代研究
其多糖成分(astragaluspolysaccharides,APS)具免疫
调节的作用,能促进多种免疫活性细胞分泌细胞因
子及抗体。本研究给艾氏腹水癌(EAC)实体型荷
瘤小鼠服用云芝糖肽和黄芪多糖单方及复方,并以
阿霉素化疗组作为阳性药对照,观察其免疫功能的
变化,以此来验证云芝黄芪有效组分单方及配伍复
方的免疫调节活性。
1 材料
1.1 药物
云芝糖肽(多糖含量为 424%,蛋白含量为
179%)购自江苏华源生物有限公司,批号050502,
无菌生理盐水溶解后4℃保存备用;黄芪多糖(多
糖含量70%)由惠州市东方植物保健科技有限公司
提供,批号060216,无菌生理盐水溶解后4℃保存
备用。阿霉素购于浙江海正药业股份有限公司,批
号H33021980。
1.2 动物与瘤株
雌性昆明种小鼠(KM)60只,4~6周龄,体重
(18±2)g,购自重庆医科大学实验动物中心,许可
证号 SYXK(渝)20020001;艾氏腹水癌瘤株(Ehrli
ch’sascitescarcinoma,EAC)由华中科技大学同济
医学院药学部提供,昆明小鼠腹腔传代接种。
1.3 仪器与试剂
光学显微镜 (OLYMPUS日本),电子天平
(JB200-3型,沈阳龙腾);亲和纯化的大鼠抗小鼠
CD3,CD4,CD8单克隆抗体为 eBioscience公司产
品,兔抗大鼠二抗试剂盒购于武汉博士德生物公司。
2 方法
2.1 荷瘤小鼠模型的建立与分组
无菌条件下,用生长7~8d的传代 EAC腹水
癌小鼠数只,脱臼处死后用75%乙醇消毒腹部抽取
腹水,用灭菌生理盐水稀释成含细胞密度为5×106
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个/mL的瘤细胞悬液,于每只小鼠的右侧腋窝皮下
接种02mL(7d可长出可触及的实体瘤结节,成功
率近100%)[1]。接种后立即称重并随机分为6组,
每组10只:生理盐水组(NS)、阿霉素单纯化疗组
(AMD)、云芝糖肽组(PSP)、黄芪多糖组(APS)、云
芝黄芪复方组(PSP+APS)和阿霉素云芝黄芪综合
治疗组(AMD+PSP+APS),次日开始用药。
2.2 给药剂量与方法
NS组 灌胃生理盐水(01mL·kg-1·d-1);
AMD组 腹腔注射阿霉素(4mg·kg-1·d-1,02mL,
连续3d);PSP组 灌胃云芝糖肽(250mg·kg-1·
d-1,02mL);APS组 灌胃黄芪多糖(250mg·kg-1
·d-1,02mL);PSP+APS组 灌胃云芝糖肽(250mg
·kg-1·d-1,01mL)和黄芪多糖(250mg·kg-1·
d-1,01mL);AMD+PSP+APS组 用量同上。
2.3 指标检测
2.3.1 给药后每日观察 各组小鼠的食欲、大便、
毛色、活动等一般状况。
2.3.2 免疫细胞化学法检测淋巴细胞亚群 给药
30d后称重,眼球取血,EDTA抗凝,常规法分离小
鼠外周血淋巴细胞,稀释重悬后,滴加于多聚赖氨酸
处理过的洁净载玻片上,纯丙酮固定,3%H2O2灭活
内源性过氧化物酶,正常兔血清封闭,分别滴加1∶
500稀释好的 CD3,CD4,CD8单克隆抗体,4℃过
夜,洗涤后滴加生物素化二抗进行孵育,再加配制好
的SABC工作液,37℃温育30min,再加 DAB显色
液显色,苏木素轻度复染,再脱水透明封片,高倍镜
下观察,细胞浆和细胞膜显黄色者为阳性细胞,只显
蓝色者为阴性细胞,分别选取5个高倍视野计数总
阳性细胞的百分率并摄像。
2.3.3 脏器指数及抑瘤率计算 眼球取血后,脱臼
处死小鼠,取出脾脏、胸腺及肿瘤称重,计算脾脏指
数、胸腺指数和抑瘤率。
脏器指数(%)=脏器重量/体重×100%
抑瘤率(%)=(1-实验组平均瘤重/对照组平均
瘤重)×100%
2.4 统计学方法
结果以珋x±s表示。用SPSS115软件对试验结
果数据进行方差分析,随后的两两比较采用 LSDt
检验。P<005为有显著性差异。
3 结果
3.1 一般状况
给药后每日观察各组小鼠的行为、自主活动、摄
食、饮水、毛发、粪便、尿液均未见异常,眼、耳、鼻、口
亦未见分泌物。
3.2 药物对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响
免疫细胞化学法检测小鼠外周血T淋巴细胞亚
群的变化,结果显示云芝糖肽组和云芝黄芪复方组小
鼠的 CD3+,CD4+ T淋巴细胞百分率以及 CD4+/
CD8+均显著高于对照组(P<005),CD8+T细胞的
百分率较阿霉素化疗组显著降低(P<005);而黄芪
多糖组虽然CD3+,CD4+,CD8+T淋巴细胞百分率以
及CD4+/CD8+高于对照组,但差异均无显著性;综合
治疗组CD3+,CD4+T细胞百分率显著高于单纯化疗
组(P<005),其CD4+/CD8+虽较化疗组升高,但差
异无显著性,见表1,图1,2。
表1 免疫细胞化学法检测各组小鼠外周血淋巴细胞亚群的变化(珋x±s,n=10)
组别 剂量/mg·kg-1·d-1 CD3/% CD4/% CD8/% CD4/CD8
NS - 075±003 045±001 029±001 156±009
AMD 4 065±0031) 038±007 035±004 110±034
PSP 250 084±0021) 061±0061) 026±0032) 236±0241)
APS 250 081±006 059±009 030±003 203±055
PSP+APS 250+250 086±0041) 065±0121) 027±0052) 250±0831)
PSP+APS+AMD 250+250+4 078±0072) 052±0122) 031±006 169±025
  注:与NS组比较1)P<005;与AMD组比较2)P<005(表2,3同)
3.3 脏器指数
给药30d后称量小鼠体重,然后取出胸腺、脾
脏称重,计算脏器指数,发现单纯化疗组小鼠胸腺指
数较对照组明显降低(P<005),而综合治疗组的
胸腺指数显著高于单纯化疗组(P<001);脾脏指
数各组之间差异无显著性,见表2。
3.4 抑瘤率
给药30d后取小鼠瘤组织称重,发现用药各组
肿瘤质量均显著低于生理盐水对照组(P<005),抑
瘤率分别为 AMD组3724%,PSP组3316%,APS
组352%,PSP+APS组4286%,AMD+PSP+APS
组4796%,而各用药组之间差异无显著性。见表3。
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图1 免疫细胞化学法CD8+T淋巴细胞(SP,×400)
图2 免疫细胞化学法CD4+T淋巴细胞(SP,×400)
表2 各组胸腺指数及脾脏指数结果(珋x±s,n=10)
组别
剂量
/mg·kg-1·d-1
胸腺指数 脾脏指数
NS - 019±005 048±003
AMD 4 013±0031)046±016
PSP 250 021±003 051±009
APS 250 021±002 050±019
PSP+APS 250+250 023±003 053±007
PSP+APS+AMD250+250+4 022±0032)048±007
表3 各组肿瘤质量(g)及抑瘤率(珋x±s,n=10)
组别
剂量
/mg·kg-1·d-1
瘤重
/g
抑瘤率
/%
NS - 196±0353 -
AMD 4 123±03351) 3724
PSP 250 131±02781) 3316
APS 250 127±03021) 3520
PSP+APS 250+250 112±01951) 4286
PSP+APS+AMD250+250+4 102±00581) 4796
4 讨论
艾氏腹水癌起源于1932年,由Ehrlich氏癌(自
发性乳腺癌)生理盐水悬液注入小鼠腹腔内而
成[2],一般采用KM小鼠腹腔传代保存,广泛应用于
肿瘤治疗药物的筛选及肿瘤机制研究,是国内外常
用的可移植性瘤细胞株之一。本研究将 EAC细胞
经生理盐水稀释后注射到小鼠右腋皮下,建立实体
型荷瘤小鼠动物模型,成功率近100%。
中药尤其是中药复方具有多层次、多靶点、多环
节、多途径的优势,但是传统剂型存在作用机制不明
确、质量控制不稳定、煎服不方便等缺点,而中药有
效组分配伍在克服了传统剂型的缺点的同时,仍具
有较好的疗效[3],其主要特点是成分清楚、作用目
标明确、质量稳定可控、毒副作用小,与传统中成药
具有相似的整体功能。本研究应用云芝和黄芪的有
效组分云芝糖肽和黄芪多糖配伍使用,既达到成分
清楚、质量稳定可控的目的,又发挥了传统中药组方
的整体功能,以此来治疗肿瘤,提高机体免疫力,具
有十分广阔的应用前景。
云芝Coriolusversicolor为多孔菌科植物彩绒革盖
菌的子实体或培养的菌丝体,性寒,味微甘,归肝、脾、
肺经,有清热、消炎功效。云芝糖肽是云芝COV1菌株
菌丝体中提取出来的主要活性成分[4]。研究表明,云
芝糖肽能显著增加CD4+T细胞的数量、CD4+/CD8+
以及B淋巴细胞的数量和百分率,使肿瘤患者的免疫
系统得以增强[5,6];在动物实验中,Ho[7]等发现云芝糖
肽可以促进鼠脾淋巴细胞的增殖,增加鼠脾淋巴细胞
释放白细胞介素2(interleukin2,IL2),白细胞介素12
(interleukin12,IL12)、γ干扰素(interferonγ,IFNγ)
和白细胞介素18(interleukin18,IL18)等Th1型细胞
因子;在体外细胞培养模型中,发现云芝糖肽(50~200
μg·mL-1)可促进PHA诱导的人外周血淋巴细胞IL6
的高效表达[8]。另外,云芝糖肽还可显著增加非小细
胞型肺癌患者血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M
(IgM)的含量[9]。因此PSP可以增强T,B淋巴细胞作
用,促进Th1型细胞因子生成,促进抗体的产生。黄芪
RadixAstragali是中医补气的要药,黄芪多糖为其主要
有效成分,近年来许多学者从不同角度对其进行了研
究,发现APS具有很好的免疫调节作用。Shao[10]等的
研究表明,APS具有促进小鼠B淋巴细胞和巨噬细胞
活化的作用,翁玲[11]等的研究表明,APS能显著增强正
常小鼠脾细胞分泌IL3,IL4,IL6的能力,显著增强化
疗后的 S180荷瘤小鼠脾细胞分泌 IL2,IL3,IL6及
IFNγ的能力,促进荷瘤小鼠自然杀伤(naturalkiler,
NK)细胞的杀伤活性。
鉴于此,本研究将云芝黄芪的主要有效成分进
行单独及配伍使用,对荷瘤小鼠以及接收化疗的荷
瘤小鼠进行治疗,发现云芝糖肽组和云芝黄芪复方
组小鼠的 CD3+,CD4+ T细胞百分率以及 CD4+/
CD8+的比值均显著高于对照组(P<005),CD8+
T细胞的百分率较阿霉素化疗组显著降低(P<
005);综合组可以显著抑制单纯化疗组导致的
CD3+,CD4+T细胞百分率的降低(P<005);用药
各组肿瘤质量均显著低于对照组(P<005),单纯
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化疗组小鼠胸腺指数较对照组明显降低(P<
005),而综合组的胸腺指数显著高于单纯化疗组
(P<001),说明云芝糖肽、云芝黄芪复方对荷瘤
小鼠及经化疗后的荷瘤小鼠均具有免疫增强作用。
中医药防治肿瘤的不断深入研究是我国研究肿
瘤的特色之一,相信随着中药方剂有效成(组)分配
伍研究的深入开展,对中医学术进步及产业发展均
将起到积极推动作用[2]。并且由于艾氏腹水癌来
源于小鼠自发性乳腺癌,因此,本研究也为临床治疗
乳腺癌提供了新的可能,为乳腺癌的中医药治疗提
供了有价值的信息。
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Immunoregulatoryactivityofpolysaccharopeptideandastragalus
polysaccharidesonEACTumorbearingmice
LIJin,BAOYixi,ZHUXuan,LIUJing,WANGHongping
(DepartmentofImmunology,KeyLaboratoryofLaboratoryMedicalDiagnostics,MinistryofEducation,
ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)
  [Abstract] Objective:Toinvestigatetheimmunoregulatoryactivitiesofpolysaccharopeptideandastragaluspolysaccharideson
EACtumorbearingmice.Method:Ehrlich'sascitescarcinoma(EAC)Kunming(KM)micewereusedtoestablishtheanimalmodel
forsolidtumor.Micewererandomlydividedintosixgroups(n=10):NSgroup(NS,10mL·kg-1·d-1),AMDgroup(AMD,4
mg·kg-1·d-1,0.2mL,onlyforthefirst3days),PSPgroup(PSP,250mg·kg-1·d-1,0.2mL),APSgroup(APS,250mg·
kg-1·d-1,0.2mL),complexprescriptiongroup(PSP+APS,250mg·kg-1·d-1,0.1mL)andcombinedtreatgroup(AMD+
PSP+APS,samedosageasabove).Afterthirtydaysoftreatment,immunocytochemicalmethodwasemployedtodetectthechangesof
TlymphocytesubsetsinthePBMCoftumorbearingmice.Subsequently,theorganindexesandtumorinhibitionratewerecalculated
andcomparedwiththoseofcontrolgroup.Result:PercentageofCD3+,CD4+ TcelandtheratioofCD4+/CD8+ wereobviously
prominenceinthePSPandPSP+APSgroupscomparedwiththoseofNSgroup(0.05),percentageofCD8+Tcelwassignificantly
decreasedcomparedwiththatofAMDgroup;percentageofCD3+,CD4+TcelwereobviouslyincreasedinAMD+PSP+APSgroup
relativetothatofAMDgroup;thethymusindexofAMDgroupwassignificantlydecreasedcomparedwiththatofNSgroup,butthethy
musindexofAMD+PSP+APSgroupwasobviouslyincreasedcomparedwiththatofAMDgroup;theweightoftumorineachadminis
trationgroupwassignificantlydecreasedcomparedwiththatofNSgroup.Conclusion:PSPandPSP+APScomplexprescription
showedtheremarkableimmunoregulationonEACmicewithchemotherapyornot.
[Keywords] polysaccharopeptide;astragaluspolysaccharides;ehrlich'sascitescarcinoma;lymphocytesubset;inhibitionrate
oftumor;organindex [责任编辑 古云侠]
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