全 文 ：金毛狗居群遗传多样性的 ƒ°分析
伍 莲 t o邓洪平 uov3 o徐 洁 v o宋琴芝 v o刘光华 v o张力仁 v o郭 明 v
ktq西南大学 荣昌校区 o重庆 wsuwys~
uq四川大学 生命科学学院 博士后流动站 o四川 成都 ytssyw~
vq生命科学学院 三峡库区植物生态与资源重点实验室 o重庆 wssztxl
≈收稿日期 ussy2sv2tt
≈基金项目 重庆市林业科技重点项目 kuws2wtvytul
≈通讯作者 3 邓洪平 oר¯}ksuvly{uxutsxo∞2°¤¬¯}§¨ ±ª«³
¶º∏q §¨∏q¦±
金毛狗 Χιβοτιυµ βαροµ ετζ属蚌壳蕨科多年生高
大树状蕨类植物 ∀为著名的药用植物 o我国仅有 t
种 o为国家 µ级保护植物 ≈t ∀金毛狗广泛分布于重
庆 !四川 !云南等省区 o常生长于山沟林荫湿处 ∀伍
莲等曾对该物种居群形态多样性分化进行了研
究 ≈u o但有关其遗传多样性的研究尤其是用 ƒ°
技术研究其遗传多样性未见报道 o本研究旨在从基
因角度揭示其濒危机理 o为该种的保护和合理利用
提供一定的理论依据 ∀
1 材料和方法
1q1 材料
以采自重庆市的北碚 !大足 !永川 !涪陵 !南川 !
城口 !秀山等 z个区县金毛狗相对集中分布之地为
研究居群 k表 tlo每居群取 vs个个体 ∀
表 t 金毛狗 z个居群概况
居群 调查地点 地理位置
城口 vtβ|{χ~∞ts{βyzχ
涪陵 u|βwtχ~∞tszβuuχ
≤ 南川 u|βtxχ~∞tszβtvχ
⁄ 永川 u|βxtχ~∞tsyβuuχ
∞ 大足 vsβtyχ~∞tsxβx|χ
ƒ 北碚 u|βxsχ~∞tsyβuuχ
秀山 u{βwzχ~∞ts{β|zχ
1q2 方法
采用 ƒ°技术进行分析研究 ≈v2x ∀
1q2q1 基因组 ⁄提取 在研钵中放入 t ª新鲜
材料 os1u ª°∂ °o加入液氮 o迅速研磨成粉末状 o立
即将粉末转入 x °的离心管中 ~加入 s1u °Β2巯
基乙醇 o再加入 u °u ≅ ≤×
提取缓冲液 o充分混
匀 oyx ε 水浴中保温 t «o其间轻轻颠倒离心管 o以
便提取液与样品粉末充分混匀 ~加入等体积的氯仿 2
异戊醇 kuwΒtlo轻缓颠倒离心管混匀 o室温下 o
tu sss µ# °¬±pt离心 ts °¬±~将上清液转入另一离
心管中 o加入 s1u °tsh ≤×
o再加入等体积的
氯仿 2异戊醇 kuwΒtlo轻缓颠倒离心管混匀 o室温下 o
tu sss µ# °¬±pt离心 ts °¬±~将上清液转入另一离
心管中 o加入等体积的氯仿 2异戊醇 kuwΒtlo轻缓颠
倒离心管混匀 ow ε 下 otu sss µ# °¬±pt离心 ts
°¬±~将上清液转入另一离心管中 o加入无水乙醇 o在
p us ε 下放置 tu «o以获得 ⁄k白色沉淀 l~w ε
下 o| sss µ# °¬±pt离心 ts °¬±o倒去上清液 ∀沉淀
在室温下自然风干 o然后 o用 vss Λ×∞溶解 ⁄ o
在 pus ε 下保存 ≈vow ∀
1q2q2 ⁄的选择性扩增 在 ux Λ的反应体系
中进行 ots ≅ °≤ ¥∏©©¨µu1x Λo§×°¶s1x Λo
∞¦² 引物 t1s Λo ¶¨ 引物 t1s Λoפ´ 酶 s1x
Λoƒ°2• ¤·¨µtz1x Λo预扩增稀释样品 u1s Λo
在 w ε 下离心数秒 o混匀 o按下列参数 °≤ 循环 }预
变性 |w ε u °¬±o第一轮扩增参数 }|w ε vs ¶oyx
ε vs ¶ozu ε {s ¶∀以后每轮循环退火温度递减
s1z ε o扩增 tw轮 ∀接着按下列参数扩增 uv轮 Β|w
ε vs ¶oxx ε vs ¶ozu ε {s ¶o延长加时 zu ε x
°¬±o反应物在 w ε 下保存 ∀
1q2q3 电泳检测 选择性扩增产物 x Λo加载样
缓冲液 u Λo|w ε 变性 v °¬±o迅速置于冰水浴中 x
°¬±o迅速点样 o进行 yh的变性聚丙烯酰胺凝胶电
泳检测 ∀
1q2q4 数据处理 由电泳得出 ƒ°图谱 ∀在白
色背景下观察谱带 o根据变性聚丙烯酰胺电泳图谱
统计带数 o在同一迁移位置上 o出现条带 o记为 to无
条带记为 so得到金毛狗的二态数据矩阵 ∀
2 结果分析
2q1 金毛狗居群间的 ƒ°多态性
#{ywt#
第 vu卷第 tw期
ussz年 z月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo ¶¶∏¨ tw
∏¯¼o ussz
从 yw对引物组合中筛选出 x对引物 o对金毛狗
进行选择性扩增 o共扩增出了 t xzx条带 o其中 ts|
条是多态性的 o占 y1|uh k表 ul∀平均每对引物可
获得 vtx个 ⁄片段 o最多在引物 ∞2≤与 2
≤×o获得 wvy个 ⁄片段 o最少在引物 ∞2≤与
2≤o只获得 uty个 ⁄片段 ∀而每对引物可扩
增出 tx ∗ uy个多态性 ⁄片段 o平均可扩出 ut1{
个 ∀
表 u 各引物组合扩增 z个居群的 ƒ°带数及其多态性
引物 总带数 多态性带数 多态性带百分比
∞2≤o 2≤≤ uwy uu {1|w
∞2≤o 2≤× vut uv z1tz
∞2≤o 2≤× wvy uy x1|y
∞2≤o 2≤ uty uv ts1ys
∞2≤≤o 2≤ vxy tx w1ut
合计 t xzx ts|
平均 vtx ut1{ y1|u
2q2 金毛狗居群间的遗传距离
用 ¤¦¦¤µ§系数计算居群间的遗传距离 k表 vlo
∆ιϕ t p (Βιϕ /Μιϕlo其中 ∆ιϕ是居群 ¬和 间的遗传距
离 oΒιϕ是居群 ¬和 共同具有的 ƒ°扩增带数 oΜιϕ
是居群 ¬和 所能记录扩增带数的总带数 ∀ ∆ιϕ为 so
表示没有观察到居群 ι和 ϕ的 ƒ°谱带中有差异 ~
∆ιϕ为 to表示居群 ¬和 的 ƒ°谱带中没有共同的
扩增带 ≈wox ∀
表 v z个居群间的遗传距离
居群
≤ ⁄ ∞ ƒ
s
s1|wz y s
≤ s1|vt u s1|u| y s
⁄ s1|w{ t s1|u| v s1|tt { s
∞ s1|wv y s1|st u s1{|z s s1{{x v s
ƒ s1|wy y s1|vz y s1|uz u s1|tw w s1{|x s s
s1|y| w s1|wz w s1|wz { s1|ww | s1|yu w s1|xs vs
从表 v得知 o居群
o≤o⁄o∞oƒ相互之间的遗
传距离在 s1{{x v ∗ s1|vz yo居群 ⁄o∞间的遗传距
离最近 o为 s1{{x vo这 x个居群 o地理种源较近 o其
中居群 ⁄o∞之间的地理种源最近 ~居群 与其余 y
个居群间的遗传距离在 s1|vt u ∗ s1|y| wo居群
来自城口 o与这 y个居群间的地理种源相对较远 ~居
群 与其余 y个居群间的遗传距离在 s1|ww | ∗
s1|y| wo居群 o间的遗传距离最远为 s1|y| wo居
群 来自秀山 o与其余 y个居群的地理种源最远 ∀
通过上述的分析得出 o居群间所处的地理种源越近 o
它们之间的遗传距离越小 ~反之 o所处的地理种源越
远 o居群间遗传距离越大 ~这也说明居群间的遗传距
离受地理种源的影响 ∀
2q3 金毛狗居群间遗传距离聚类分析
将居群间的遗传距离数据输入 ≥°≥≥系统中 o采
用
²¯¦®距离组间连线法进行聚类 o得到图 t∀
图 t 金毛狗 z个居群间遗传距离聚类分析
从图 t得知 o在
²¯¦®距离小于 xo≤o⁄oƒ居群
聚类形成一个群 o表现出遗传距离小 o这与它们来自
比较近的地理种源相吻合 ~但是 o
o∞居群来自较近
的地理种源 o在
²¯¦®距离大于 xo形成独立的群 o表
明这两个居群产生遗传变异 ~在
²¯¦®距离大于 tso
oo仍形成独立的群 o表现出遗传差异大 o这与
它们不同地理种源的差异相吻合 ∀
3 小结
通过对重庆市药用植物金毛狗居群遗传多样性
的 ƒ°分析研究证明 }金毛狗在居群水平存在明
显的遗传多样性 o在 x对选择性扩增引物中 o共扩增
出了 ts|条多态性谱带 o占 y1|uh ∀聚类分析结果
表明居群间的遗传距离与地理种源密切相关 o较近
地理种源的居群间遗传相似性高 o遗传距离小 ~较远
地理种源的居群间遗传相似性低 o遗传距离大 ∀表
明地理种源影响居群间的的遗传距离 ∀
≈参考文献
≈t 宋会兴 q四川省国家级重点保护蕨类植物资源及保护对策
≈ q国土与自然资源研究 oussuokul}ztq
≈u 伍 莲 o邓洪平 o徐 洁 o等 q濒危药用植物金毛狗形态多样
性分化研究 ≈ q中国中药杂志 oussxovskttl}{y|q
≈v 邹喻苹 o汪小全 o雷一丁 o等 q几种濒危植物及其近缘类群总
⁄的提取与鉴定 ≈ q植物学报 ot||wovykzl}xu{q
≈w 季维智 o宿 兵 q遗传多样性研究的原理与方法 ≈ q杭州 }
浙江科学技术出版社 ot|||}|q
≈x 余建英 o何旭宏 q数据统计分析与 ≥°≥≥应用 ≈ q北京 }人民
邮电出版社 oussv}vq
≈责任编辑 张宁宁
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第 vu卷第 tw期
ussz年 z月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo ¶¶∏¨ tw
∏¯¼o ussz