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Studies on chemical constituents from rhizome of Anemone flaccida

地乌中的三萜皂苷类成分



全 文 :地乌中的三萜皂苷类成分
张兰天1,高石喜久2,张彦文3,段宏泉3
(1.天津大学 药物科学与技术学院,天津 300072;
2.日本国立德岛大学 药学部,日本 德岛 7708505;
3.天津医科大学 基础医学研究中心 药学院,天津 300070)
[摘要] 目的:研究地乌Anemoneflaccida中的化学成分。方法:采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、反相 HPLC制
备色谱等多种方法分离化合物,采用波谱方法鉴定化合物的结构。结果:从地乌根茎中分离得到12个三萜类化合
物,分别为齐墩果酸(1),齐墩果酸3OβD吡喃葡萄糖(1→2)βD吡喃木糖苷(2),五加苷K(3),齐墩果酸3O
αL吡喃鼠李糖(1→2)βD吡喃木糖苷(4),齐墩果酸3OβD吡喃葡萄糖(1→2)αL吡喃阿拉伯糖苷(5),齐
墩果酸3OβD吡喃葡萄糖醛酸(6),齐墩果酸3OβD吡喃葡萄糖醛酸甲酯(7),齐墩果酸28OαL吡喃鼠李糖
(1→4)βD吡喃葡萄糖(1→6)βD吡喃葡萄糖苷(8),齐墩果酸3OβD吡喃葡萄糖醛酸28OαL吡喃鼠李糖
(1→4)βD吡喃葡萄糖(1→6)βD吡喃葡萄糖苷(9),齐墩果酸3OβD吡喃葡萄糖醛酸甲酯28OαL吡喃鼠
李糖(1→4)βD吡喃葡萄糖(1→6)βD吡喃葡萄糖苷(10),齐墩果酸3OβD吡喃葡萄糖(1→2)βD吡喃木
糖28OαL吡喃鼠李糖(1→4)βD吡喃葡萄糖(1→6)βD吡喃葡萄糖苷(11),齐墩果酸3OαL吡喃鼠李糖
(1→2)αL吡喃阿拉伯糖28OαL吡喃鼠李糖(1→4)βD吡喃葡萄糖(1→6)βD吡喃葡萄糖苷(12)。结论:
化合物5~8,10,12为首次从该植物中分离得到;化合物2,5,11对Hela,BEL7402和HL60细胞具有细胞毒性。
[关键词] 银莲花属;地乌;三萜皂苷;抗癌活性
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)14169604
[收稿日期] 20080128
[基金项目] 天津医科大学科研基金(2004xk32)
[通讯作者] 段宏泉,Tel:(022)23542838,Email:duanhq@
tijmu.edu.cn
  地乌 AnemoneflaccidaFr.Schmidt为毛茛科银
莲属林荫银莲花的根茎,又名地雷、金串珠、蜈蚣三
七,分布于我国东北、华东、西南等地。地乌性温,味
辛微苦,有祛风湿,助筋骨,解毒的功效[1]。有关该
植物化学成分的研究报道不多,文献报道了8个三
萜皂苷成分[24]。作者对地乌的化学成分进行了研
究,从醋酸乙酯 提取物和正丁醇提取物中分离得到
12个化合物,通过波谱方法鉴定了各化合物的结
构,其中6个化合物为首次分离得到。细胞毒试验
数据显示化合物2,5,11对 Hela,BEL7402和 HL
60细胞具有一定的细胞毒作用。
1 仪器、试剂及药材
BrukerAVANCE300instrument(TMS内标);日
本电子JEOLJMS-SX102A;制备高效液相色谱仪
PU-2089(泵),RI-2031和 UV-2075(检测器)
(日本分光公司(JASCO));制备HPLC色谱柱YMC
-packODS-ASH-343-5(20mm×250mm,
YMC);GPC柱GS-31020G(20mm×500mm,Sho
dex)。凝胶色谱柱 ToyopearlHW-40C(Tosoh);柱
色谱和薄层色谱用硅胶均系青岛海洋化工厂生产,
所用试剂均为分析纯;实验所用的标准糖除 βD吡
喃葡萄糖为中生北控生物科技股份有限公司生产
外,其余均为Sigma公司生产。
芬兰 LABSYSTEMSMultiskanMS酶标仪;美国
REVCOCO2培养箱;胎牛血清为Heclone公司产品;
RPM1640为Gibco公司产品;MTT和 DMSO为 Sig
ma公司产品。
人宫颈癌 Hela细胞、人肝癌 BEL7402细胞和
人白血病 HL60细胞均为天津医科大学免疫教研
室提供。
药材采自湖北(2004年12月),由中南民族大
学生 命 科 学 学 院 万 定 荣 教 授 鉴 定,标 本
(D20040905)存放于天津医科大学药学院。
2 提取分离
取自然干燥的地乌根茎45kg,粉碎后用95%
的乙醇加热回流提取3次,每次6h。提取液减压浓
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    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
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July,2008
缩,得浸膏500g,浸膏加水混悬后,分别用石油醚、
醋酸乙酯 、正丁醇进行萃取,得醋酸乙酯提取物
208g,正丁醇提取物230g。醋酸乙酯提取物经反
复硅胶柱色谱、凝胶渗透色谱分离,制备高压液相色
谱纯化得到化合物2(2550mg),3(3300mg),4
(8808mg),6(3761mg)。正丁醇提取物经分离
得到化合物1(260mg),5(384mg),7(58mg),8
(100mg),9(612mg),10(200mg),11(803
mg),12(500mg)。
3 细胞毒试验
研究采用MTT法[5]。取对数生长期的 Hela细
胞、BEL7402细胞和 HL60细胞,用含10%胎牛血
清的RPM1640培养基制成5×104个 /mL的细胞悬
液,按每孔180个/L接种于96孔板中。在37℃,
5% CO2条件下培养24h后每孔加入样品液20μL。
待测样品用DMSO溶解(DMSO体积分数≤01%),
化合物样品质量浓度分别为30,10mg·L-1,每个
浓度平行6孔;样品的每个浓度均设置6孔为空白
对照,每孔加入20μL的 RPMI1640培养液。培养
72h后,吸去上清液,每孔加入无血清培养液新鲜
配置的1mg·L-1的MTT,37℃温育4h,弃去上清
液,每孔加入150μL的DMSO,在490nm处测定吸
光度(A)值。取6孔平均值,按公式:细胞增殖抑制
率=[(1-加药细胞 A值/对照细胞 A值)×
100%],计算每个质量浓度下的细胞增殖抑制率
(表1)。
表1 化合物对肿瘤细胞的抑制率(n=6) % 
化合物
Hela
Ⅰ Ⅱ
BEL7402
Ⅰ Ⅱ
HL60
Ⅰ Ⅱ
1 1382 436 -1145 -729 1788 547
2 6041 2054 6292 701 7571 7610
3 2145 -109 526 -426 547-2591
4 1345 436 1883 931 -036-1168
5 3649 2203 5037 332 7700 7610
6 -145 073 057 -576 1022 000
7 1491 1054 -1035 -808 876-1423
8 910 654 -698 769 -255 1095
9 582 945 -847-1239 803 292
10 1745 727 1263 -125 1168 547
11 5959 838 1365 166 7568 7468
12 1345 618 -1244-1407 1569 1131
  注:药物质量浓度(Ⅰ)30mg·L-1;(Ⅱ)10mg·L-1
4 结构鉴定
化合物5 白色无定型粉末。ESIMSm/z773
[M+Na]+。1HNMR(Pyridined5,300MHz)δ:084
(3H,s),097(3H,s),101(3H,s),102(3H,s),
105(3H,s),124(3H,s),130(3H,s),549(1H,
brs,H12),497(1H,d,J=54Hz,Ara3,H1),
521(1H,d,J=74Hz,Glu3,H1)。碳谱数据见
表2,3。波谱数据与文献[7]报道的数据一致,化合
物5酸水解所得糖的Rf值与D吡喃葡萄糖和 L吡
喃阿拉伯糖标准品的 Rf值一致。因此鉴定化合物
5为齐墩果酸3OβD吡喃葡萄糖(1→2)αL吡
喃阿拉伯糖苷。
化合物6 白色无定型粉末。mp205~206℃,
ESIMSm/z655[M+Na]+。1HNMR(Pyridined5,
300MHz)δ:086(3H,s),097(3H,s),110(6H,
s),102(3H,s),120(3H,s),133(6H,s),547
(1H,brs,H12),504(1H,d,J=75Hz,GluA3,
H1)。碳谱数据见表2,3。波谱数据与文献[8]报
道的数据一致,化合物6酸水解所得糖的 Rf值与
D吡喃葡萄糖醛酸标准品的 Rf值一致。因此鉴定
化合物6为齐墩果酸 3OβD吡喃葡萄糖醛酸。
化合物7 白色无定型粉末。ESIMSm/z653
[M+Na]+。1HNMR(Pyridined5,300MHz)δ:080
(3H,s),094(3H,s),097(3H,s),098(3H,s),
102(3H,s),123(3H,s),127(3H,s),503(1H,
brs,H12),500(1H,d,J=75Hz,GluA3,H1),
375(3H,s,GluA3,OCH37)。碳谱数据见表2,3。
波谱数据与文献[9]报道的数据一致,化合物7酸
水解所得糖的Rf值与D吡喃葡萄糖醛酸标准品的
Rf值一致。因此鉴定化合物7为齐墩果酸3Oβ
D吡喃葡萄糖醛酸甲酯。
化合物8 白色无定型粉末。ESIMSm/z949
[M+Na]+。1HNMR(Pyridined5,300MHz)δ:085
(3H,s),091(3H,s),196(3H,s),106(3H,s),
015(3H,s),125(6H,s),546(1H,brs,H12)。
626(1H,d,J=80Hz,Glu′28,H1),470(1H,d,
J=78Hz,Glu″28,H1),172(3H,d,J=77Hz,
Rha28,CH36),588(1H,brs,Rha28,H1)。碳
谱数据见表2,3。波谱数据与文献[10]报道的数据
一致,化合物8酸水解所得糖的 Rf值与 D吡喃葡
萄糖和L吡喃鼠李糖标准品的 Rf值一致。因此鉴
定化合物8为齐墩果酸28OαL吡喃鼠李糖(1→
4)βD吡喃葡萄糖(1→6)βD吡喃葡萄糖苷。
化合物 10 白色无定型粉末。ESIMSm/z
1123[M+Na]+。1HNMR(Pyridined5,300MHz)δ:
085(3H,s),091(3H,s),100(3H,s),109(3H,
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  表2 化合物5~8,10,12苷元的13CNMR波谱数据
(Pyrd5,75MHz)
No 5 6 7 8 10 12
1 391 391 400 395 391 394
2 269 265 271 286 270 270
3 893 895 897 788 896 892
4 400 400 391 399 400 403
5 562 562 563 563 562 564
6 189 189 189 190 190 190
7 334 338 347 336 336 336
8 400 424 402 404 403 400
9 485 485 485 486 484 485
10 374 374 375 379 374 375
11 241 243 232 239 241 238
12 1230 1230 1229 1234 1233 1233
13 1452 1453 1455 1446 1446 1446
14 426 426 427 426 421 426
15 287 287 287 288 286 286
16 243 243 243 243 238 243
17 471 471 472 475 475 475
18 424 424 425 422 421 421
19 470 469 470 467 466 467
20 314 315 315 312 312 312
21 347 347 342 345 344 345
22 337 338 338 330 329 330
23 287 288 288 293 270 287
24 172 175 174 170 174 174
25 159 159 159 162 160 161
26 178 179 179 180 180 180
27 266 267 267 265 265 265
28 1807 1807 1814 1771 1769 1770
29 336 337 347 335 336 336
30 242 243 243 242 241 236
s),114(3H,s),126(3H,s),131(3H,s),541
(1H,brs,H12),500(1H,d,J=75Hz,GluA3,
H1),375(3H,s,GluA3,OCH37),625(1H,d,
J=76Hz,Glu′28,H1),470(1H,d,J=78Hz,
Glu″28,H1),171(3H,d,J=77Hz,Rha28,CH3
6),588(1H,brs,Rha28,H1)。碳谱数据见表2,
3。波谱数据与文献[9]报道的数据一致,化合物10
酸水解所得糖的 Rf值与 D吡喃葡萄糖、D吡喃葡
萄糖醛酸和L吡喃鼠李糖标准品的 Rf值一致。因
此鉴定化合物10为齐墩果酸3OβD吡喃葡萄糖
醛酸甲酯28OαL吡喃鼠李糖(1→4)βD吡喃葡
萄糖(1→6)βD吡喃葡萄糖苷。
化合物 12 白色无定型粉末。ESIMSm/z
1227[M+Na]+。1HNMR(Pyridined5,300MHz)δ:
091(9H,s),096(3H,s),112(3H,s),118(3H,
s),131(3H,s),543(1H,brs,H12),492(1H,d,
  表3 化合物5~8,10,12糖部分的13CNMR波谱数据
(Pyrd5,75MHz)
No 5 6 7 8 10 12
3′1 1054 1078 1077   1077 1053
2 815 760 759   757 764
3 739 786 784   783 745
4 688 737 737   736 691
5 655 777 777   776 651
6   1735 1714   1713  
7     526   524  
3″1 1065         1022
2 769         732
3 787         730
4 720         744
5 787         700
6 630         190
28′1       961 961 961
2       743 743 758
3       792 792 791
4       713 713 713
5       785 785 785
6       696 696 691
28″1       1053 1053 1053
2       758 758 743
3       770 770 776
4       786 787 787
5       776 776 770
6       618 618 617
281       1033 1033 1032
2       730 730 728
3       732 732 730
4       744 744 742
5       708 707 707
6       193 193 189
J=55Hz,Ara3,H1),165(3H,d,J=60Hz,
Rha3,CH36),615(1H,brs,Rha3,H1),625
(1H,d,J=78Hz,Glc′28,H1),505(1H,d,J=
760Hz,Glc″28,H1),587(1H,brs,Rha28,H
1),172(3H,d,J=61Hz,Rha28,CH36)。碳谱
数据见表2,3。波谱数据与文献[11]报道的数据一
致,化合物12酸水解所得糖的 Rf值与 D吡喃葡萄
糖、L吡喃阿拉伯糖和L吡喃鼠李糖标准品的Rf值
一致。因此鉴定化合物12为齐墩果酸 3OαL吡
喃鼠李糖(1→2)αL吡喃阿拉伯糖28OαL吡喃
鼠李糖(1→4)βD吡喃葡萄糖(1→6)βD吡喃
葡萄糖苷。
化合物1,2,3,4,9,11的氢谱、碳谱及质谱数据
经与文献报道的有机波谱数据对比基本一致,分别
鉴定为齐墩果酸[2],齐墩果酸 3OβD吡喃葡萄糖
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(1→2)βD吡喃木糖苷[2],五加苷 K[6],齐墩果酸
3OαL吡喃鼠李糖(1→2)βD吡喃木糖苷[2],齐
墩果酸 3OβD吡喃葡萄糖醛酸 28OαL吡喃鼠
李糖(1→4)βD吡喃葡萄糖(1→6)βD吡喃葡
萄糖苷[11],齐墩果酸 3OβD吡喃葡萄糖(1→2)
βD吡喃木糖 28OαL吡喃鼠李糖(1→4)βD
吡喃葡萄糖(1→6)βD吡喃葡萄糖苷[3]。
5 结果与讨论
本研究报道了从地乌中分离得到的12个五环
三萜类化合物,均为齐墩果烷型三萜,细胞毒试验表
明,化合物2,5,11对Hela,BEL7402和HL60具有
一定的抑制作用,有必要进一步进行深入研究。
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ZHANGLantian1,TAKAISHIYoshihisa2,ZHANGYanwen3,DUANHongquan3
(1.TheColegeofPharmaceuticalsandBiotechnology,TianjinUniversity,Tianjin300072China;
2.FacultyofPharmaceuticalSciences,UniversityofTokushima,Shomachi178,Tokushima7708505,Japan;
3.BasicMedicalResearchCenter,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)
[Abstract] Objective:TostudythechemicalconstituentsfromAnemoneflaccida.Method:Chemicalconstituentswereisola
tedbyrepeatedcolumnchromatography(silicagel,ToyopearlHW40CandpreparativeHPLC).Thestructureswereelucidatedonthe
basisofspectraldataanalysis.Result:Twelvetriterpeneswereisolatedandtheirstructureswereidentifiedasfolow:oleanolicacid
(1),oleanolicacid3OβDglccopyranosyl(1→2)βDxylopyranoside(2),eleutherosideK(3),oleanolicacid3OαLrham
nopyranosyl(1→2)βDxylopyranoside(4),oleanolicacid3OβDglccopyranosyl(1→2)αLarabinofurnoside(5),oleanolic
acid3OβDglccuronopyranose(6),oleanolicacid3OβDglccuronopyranosemethylester(7),oleanolicacid28OαLrhamnopy
ranosyl(1→4)βDglccopyranosyl(1→6)βDglccopyranosyl(8),oleanolicacid3OβDglccuronopyranose28OαLrhamnopyr
anosyl(1→4)βDglccopyranosyl(1→6)βDglccopyranoside(9),oleanolicacid3OβDglccopyranosylmethylester28OαL
rhamnopyranosyl(1→4)βDglccopyranosyl(1→6)βDglccopyranoside(10),oleanolicacid3OβDglccopyranosyl(1→2)βD
xylopyranosyl28OαLrhamnopyranosyl(1→4)βDglccopyranosyl(1→6)βDglccopyranoside(11),oleanolicacid3OαLrh
amnopyranosyl(1→2)αLarabinopyrnosyl28OαLrhamnopyranosyl(1→4)βDglccopyranosyl(1→6)βDglccopyranoside
(12).Conclusion:compounds58,10,12wereisolatedfromthisplantforthefirsttime.Compounds2,5and11showedpositive
antitumoractivities.
[Keywords] Anemone;Anemoneflaccida;triterpenesaponins;antitumoractivity
[责任编辑 王亚君]
·9961·
第33卷第14期
2008年7月
         
    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 14
July,2008