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The Measurement of Tyrosine Hydroxylase Activity in the Brain of Conscious Rats

清醒自由活动大鼠脑酪氨酸羟化酶活性的测定



全 文 :清醒自由活动大鼠脑酪氨酸羟化酶活性的测定
王 巍 o赵德忠 o王卫霞 o孙斌辉
k中国中医研究院 西苑医院 o北京 tsss|tl
≈摘要  目的 }建立清醒自由活动大鼠脑内酪氨酸羟化酶k× ‹l活性的测定方法 ∀方法 }应用脑微透析技术收
集经 y2羟基多巴胺ky2’ ‹⁄„l预处理的大鼠 o在 2芳香族氨基酸脱羧酶抑制剂 v2羟苄肼#盐酸k‘≥⁄tstxl灌流下 o
脑纹状体细胞外的透析液 ~用高效液相色谱2电化学检测方法测定透析液内多巴k⁄’°„l水平 o来反映脑内 × ‹ 的活
性 ∀并观察 × ‹ 抑制剂以及多巴胺受体的抑制剂和激动剂对其的影响 ∀结果 }预先用 y2’ ‹⁄„ 处理导致大鼠纹状
体透析液内 ⁄’°„缺失 o用 ‘≥⁄tstx阻断 ⁄’°„向多巴胺k⁄„l转化 o可测得 ⁄’°„的水平 o且 ⁄„ 的代谢产物 v o
w2二羟基苯乙酸水平逐步下降 ∀但在 × ‹ 抑制剂 Α2甲基 Θ2酪氨酸作用下 ⁄’°„ 又可消失 o说明测定的 ⁄’°„ 是来
自多巴胺神经末梢 ∀另外 o腹腔内给予多巴胺受体激动剂盐酸阿朴吗啡后 o脑透析液中 ⁄’°„ 水平减少 ~而给予多
巴胺受体抑制剂氟哌啶醇后 o微透析液中 ⁄’°„水平增加 ∀本研究测得在 s qst °°²¯#p t ‘≥⁄tstx灌流下 o经 y2
’ ‹⁄„预处理的 o插入探针 uw « ≥⁄大鼠纹状体中 ⁄’°„水平为ks qv| ? s qtul³°²¯#°¬±p tk ξ ? σ, ν € xl ∀结论 }在
脱羧酶抑制剂 ‘≥⁄ tstx灌流期间 o测得预先用 y2’ ‹⁄„处理大鼠纹状体透析液中 ⁄’°„ 水平可以认为是脑组织
× ‹ 活性的指数 o经工具药验证 o在体监测脑 × ‹ 活性的方法是可靠的 ∀
≈关键词  酪氨酸羟化酶 ~清醒大鼠 ~脑微透析 ~高效液相色谱2电化学检测法
≈中图分类号  • u{x qx ≈文献标识码  … ≈文章编号  tsst2xvsukussulsu2stvu2sw
酪氨酸羟化酶k× ‹ ~∞≤t qtw qty qul是外周和中
枢神经系统儿茶酚胺k≤ „l合成的限速酶 o神经活
动 !药物处理等因子通过 × ‹ 活性的调节来影响 ≤ „
的合成 o即 × ‹ 是生理性或药物性调节的重要环
节≈t  ∀有研究表明 ≤ „ 合成酶系中 × ‹ 活性比其它
u个酶k芳香性氨基酸脱羧酶和多巴胺 Β羟化酶l的
活性低 tss ∗ t sss 倍≈u  o对其活性的测定难度较
大 o目前国内有离体的 × ‹ 活性的测定方法≈v  o但无
在体脑内 × ‹ 活性的测定方法 ∀ … ‹ ≤ • ¶¨·¨µ¬±®等
在 t||s年首先应用微透析技术检测清醒大鼠脑 × ‹
活性≈w  o本文研究的清醒自由活动大鼠脑 × ‹ 活性
测定方法 o是一种在体连续监控 × ‹ 活性的方法 o更
接近生理状况 ∀对进一步研究激活或诱发 × ‹ 活性
方面的工作具有很大的价值 ∀此外 o在药物防治老
年痴呆和帕金森氏病的研究中 o不失为有价值的指
标 ∀
1 材料和方法
1 q1 动物和药物处理 成年的 ≥⁄大鼠k体重 uys
∗ wws ªou只雌性 ov只雄性l被应用 ∀v2羟苄肼#盐
酸k‘≥⁄tstx ~≥¬ª°¤产品l溶于林格氏液 o经灌流入
≈收稿日期  usst2sw2ty
≈作者通讯  电话 }kstslyu{zxx||2ywts ~传真 }kstslyu{{s{yu
脑组织 ∀氟哌啶醇k‹°⁄l !盐酸阿朴吗啡k„°’l !Α2
甲基 Θ2酪氨酸k„  °×l均为 ≥¬ª°¤产品 o分别为腹
腔内给药用 ∀先把 {Λª y2羟基多巴胺ky2’ ‹⁄„ o
≥¬ª°¤产品l作为交感神经化学切断剂 o以 tˏ量单
侧注射到大鼠纹状体造成儿茶酚胺k≤ „l神经元损
害 ∀立体定位仪座标 }„° s qu °° o v qs °° o⁄∂
z qx °° ∀y2’ ‹⁄„注射后 t周进行微透析实验 ∀
1 q2 外科手术和脑微透析 麻醉 ≥⁄大鼠ku h戊
巴比妥钠 vs °ª#®ªp t o¬³l o将头部脱毛的大鼠固定
在立体定位仪上k固定门齿棒 o耳棒 o确保头部位置
的正确l o以手术刀划开鼠头部皮肤 o分离皮下组织 o
暴露头骨 o确定前卤位置 o并将 ≤  „rtu探针套管
对准此点 o按照上述座标 „°和  的值定位 o并用
铅笔作出记号 o以钻孔器在记号上钻一直径为 t qx
°°之孔径k在记号左前和右后约 t °°处各钻 u个
小孔 o用于固定套管l o以小针划开蛛网膜并止血 ∀
使 ≤  „rtu探针套管徐徐降至所需的深度 ∀外科
水泥固定套管 ∀需要透析取样时 o拔出套管内蕊 o插
入 ≤  „rtu探针 o动物放入 ≤  „rtus动物清醒装
置内 ∀探针的进出口端分别连接 u条聚乙烯管 o进
口管连接 ≤  „rtsu微透析泵 o以 u ∗ x ˏ#°¬±p t速
度灌流 o出口管连接 ≤  „rtzs低温收集器 o每 ts ∗
#uvt#
第 uz卷第 u期
ussu年 u月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ quz o‘²qu
ƒ ¥¨qoussu
ux分钟收集 t管 ∀先用林格k•¬±ª¨µl液灌流 o约收
集 t qx «后用 s qst °°²¯#pt‘≥⁄tstxk芳香族氨基
酸脱羧酶抑制剂l灌流 o使在透析液中基础的多巴
k⁄’°„l水平可检测 ∀
1 q3 化学分析 应用高效液相色谱2电化学检测器
k‹°≤2∞⁄l测定 ⁄’°„ 及其产物 v ow2二羟基苯乙
酸 k ⁄’°„≤ l ∀采用外标法定量 ∀ ‹°≤2∞⁄ 由
≤  „ruys 除气装置 !…„≥° 2{s 泵 !…„≥≤2w≤ 电
化学检测器 !玻璃碳工作电极k以 „ªr„ª≤¯为参考
电极l和 ≤ ‹∞2„…电脑化积分器k • ¬±§²º¶版l组
成 ∀工作电压设为 yss °∂ o增益 xs ±„ ∀柱为 °«¤2
¶¨ŒŒk ’⁄≥ otss °° ≅ v qu °° ov Λ°l o流动相含有
s qt °²¯#pt三氯乙酸k用固体乙酸钠调 ³‹ 到 v qul
与 s qst °°²¯#pt乙二胺四乙酸二钠k‘¤u2∞⁄× „l ∀
标准品二羟苯丙氨酸k2多巴 o2⁄’°„l !⁄’°„≤ 为
≥¬ª°¤产品 ∀分析测定限度约为 us©°²¯#usˏptk样
品量l ∀
2 结果
2 q1 标准曲线 2⁄’°„ }Ξ € ts{ .u{ Ψ , ρ €
s q|||| ~⁄’°„≤ } Ξ € tvy{ .v Ψ , ρ € s q||{y ∀说明
2⁄’°„和 ⁄’°„≤ 分别在 xss ot sss ou sss ³ª#us
ˏpt范围内与相应的峰高有良好的线性关系 ∀
2 q2 基础水平k探针插入第 t天测定l
2 q2 q1 由于 y2’ ‹⁄„ 的交感神经化学切除剂的作
用 o在林格氏灌流下透析液中 2⁄’°„未能测得 o但
⁄’°„≤ 能测得k表 tl ∀
表 t 在林格氏液灌流下 oy2’ ‹⁄„预处理
大鼠纹状体透析液中 ⁄’°„和 ⁄’°„≤ 的水平
灌流速度和
收集时间
收集时间
r°¬±
⁄’°„
r³°²¯#°¬±p t
⁄’°„≤
r³°²¯#°¬±p t
u Λ¯#°¬±p t#ux °¬± t ∗ zx skvl w q{v ? t quzkvl
注 }k l内为大鼠数 o每只大鼠用所收集透析液的平均值
2 q2 q2 在 2芳香族氨基酸脱羧酶抑制剂 ‘≥⁄tstx
灌流期间 o纹状体内 ⁄’°„ 形成 o⁄’°„≤ 水平下降
k表 u和图 tl ∀
表 u s qst °°²¯#p t ‘≥⁄tstx 灌流下 oy2’ ‹⁄„
预处理大鼠纹状体透析液中 ⁄’°„的水平
灌流速度和收集时间 收集时间 ⁄’°„r³°²¯#°¬±p t
u Λ¯#°¬±p t#ux °¬± xt ∗ vss s qv{y ? s qttykxl
注 }k l内为大鼠数 o每只大鼠用所收集透析液平均值
从表 u可见 x只 y2’ ‹⁄„ 预处理大鼠在 s qst
°°²¯#pt ‘≥⁄tstx 灌流下 o纹状体透析液 ⁄’°„
的水平为ks qv{y ? s qttyl ³°²¯#°¬±p t ∀
图 t s qst °°²¯#p t‘≥⁄tstx
灌流下 ⁄’°„和 ⁄’°„≤ 水平的变化
由图 t可见在 ‘≥⁄tstx灌流期间 o纹状体透析
液内 ⁄’°„含量上升 o而其代谢产物 ⁄’°„≤ 的含
量逐步下降 ∀
2 q3 „°’对 ⁄’°„水平的影响k探针插入第 t天l
结果见表 v ∀
表 v „°’ 对大鼠纹状体细胞外液 ⁄’°„水平的影响
灌流液
及处理
收集时间
r°¬±
⁄’°„r
³°²¯#°¬±p t
变化率
r h
s qst °°²¯#p t
‘≥⁄tstx ¬³ „°’ 前 uy ∗ twx s quz ? s qszkwl
s qst°°²¯#p t
‘≥⁄tstx n¬³ „³² uy ∗ xs s qstty wu q|ytl
注 }k l 内为透析液的样品数 tl以 ¬³ „°’ 前的 ⁄’°„ 值为
tss h o¬³ „°’ 后测得的最低值为对照值的 h数
在 s qst °°²¯#pt ‘≥⁄tstx灌流下 o⁄’°„ 值
为 s quz ³°²¯ # °¬±p tk对照值l o¬³u qx°ª#®ªp t „°’
后 ouy ∗ xs °¬±内降低到对照值的 wu q|y h o约 tss
°¬±才恢复到原来的水平 ∀ „°’ 为 ⁄„ 受体的激动
剂 o可使 ⁄’°„ 含量降低 o较快恢复原来水平 o说明
其为短时的激动剂 ∀
2 q4 ‹°⁄对 ⁄’°„水平的影响k表 wl
表 w ‹°⁄对大鼠纹状体细胞外液内 ⁄’°„水平的影响
灌流液
及处理
收集时间
r°¬±
⁄’°„r
³°²¯#°¬±p t
变化率
r h
s qst °°²¯#p t
‘≥⁄tstx ¬³ ‹°⁄前 tt ∗ |s s quy ? s qsykwl
s qst °°²¯#p t
‘≥⁄tstx n¬³ ‹°⁄ |t ∗ tss v qwy tvvw qztl
注 }kl 内为透析液的样品数 tl以 ¬³ ‹°⁄前的 ⁄’°„ 值为
tss h o¬³ ‹°⁄后测得的最高值为对照值的 h数
在 s qst °°²¯#pt ‘≥⁄tstx灌流下 o⁄’°„ 值
为 s quy ³°²¯#°¬±p tk对照值l o¬³s qx°ª#®ªp t ‹°⁄
后 |t ∗ tss °¬±时 ⁄’°„ 值升高最高 o为对照值的
tvvw qz h o约 vss °¬±时才恢复到原来水平 ∀ ‹°⁄
为 ⁄„ 受体的抑制剂 o使 ⁄’°„ 升高 o作用时间较
长 ∀
#vvt#
第 uz卷第 u期
ussu年 u月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ quz o‘²qu
ƒ ¥¨qoussu
2 q5 „  °× 对透析液中 ⁄’°„水平的影响
„  °× 为 × ‹ 的抑制剂 o腹腔给药 uxs °ª#
®ªp t后 ws °¬±o透析液中 ⁄’°„ 水平下降 uu qu h
k以给药前 ⁄’°„水平为 tss h l otss °¬±的透析液
中无 ⁄’°„测得 ∀
3 讨论
× ‹ 是所有儿茶酚胺类递质合成的共同步骤 o
是多巴胺和去甲肾上腺素合成的限速因子 o在儿茶
酚胺类递质生物合成的调节上 o无论是突触水平上
的短周期调节 o还是神经元胞体水平上的长周期调
节都要通过对 × ‹ 的作用来达到 ∀因此对此酶活性
的测定 o有助于了解各种因子对儿茶酚胺合成的影
响 ∀老年人学习记忆功能减退 !老年痴呆 !帕金森氏
病 !衰老等都与儿茶酚胺类递质有关 ∀
酪氨酸在 × ‹ 作用下转化为 2⁄’°„ o后者在
脱羧酶的作用下转化为多巴胺k⁄„l ∀脑内脱羧酶
活力很强 o2⁄’°„很难能在脑内积聚 o当用脱羧酶
抑制剂k苄丝肼l抑制该酶活性后 o测定纹状体内 2
⁄’°„的积聚含量反映 × ‹ 的活性≈w  ∀本研究中预
先用 y2’ ‹⁄„ 处理 o由于其造成大鼠纹状体儿茶酚
胺神经元损害 o使纹状体透析液内 ⁄’°„ 缺失 ∀用
脱羧酶抑制剂 ‘≥⁄tstx阻断 ⁄’°„向 ⁄„转化 o而
酪氨酸可在 × ‹ 的作用下生成 ⁄’°„ o因此可测得
⁄’°„的含量 o且 ⁄„的代谢产物 ⁄’°„≤ 水平逐步
下降 ∀但在 × ‹ 抑制剂 „  °× 作用下 o⁄’°„ 又可
消失 o说明我们测定的 ⁄’°„ 确实是来自多巴胺神
经末梢的 ∀故在 ‘≥⁄tstx灌流期间 o测得纹状体透
析液中 ⁄’°„水平可以认为是脑组织 × ‹ 活性的指
数 ∀另外 o我们在腹腔内给予多巴胺受体激动剂
„°’后 o能兴奋突触前受体k即 ⁄„自身受体l o反馈
抑制 × ‹ 活力 o微透析液中 ⁄’°„水平减少 ~而给予
多巴胺受体抑制剂 ‹°⁄后 o反馈性增加 × ‹ 活力 o
微透析液中 ⁄’°„ 水平增加 ∀故从 2⁄’°„ 积聚
量k× ‹ 活力l的变化 o可以检测药物对突触前 ⁄„受
体的作用特征 ∀也进一步说明应用 ‘≥⁄tstx测定
× ‹ 活性 o是在体监测脑 × ‹ 活性可靠的方法 ∀
≈参考文献 
≈t  韩济生 o任民峰 o汤 健 o等 q中枢神经介质概论 q第二版 q北京 }
科学出版社 ot|{u q|v q
≈u  张德昌 q医学药理学 q北京 }北京医科大学中国协和医科大学联
合出版社 ot||{ qtys q
≈v  胡 刚 o金国章 q多巴胺自身受体调控大鼠纹状体酪氨酸羟化
酶活性的机制 q基础医学与临床 ot||{ ot{kvl }vy q
≈w  • ¶¨·¨µ¬±® … ‹ ≤ o⁄¨ ∂µ¬¨¶ …o ⁄∏µ¤± • q ˜¶¨ ¬¦µ²§¬¤¯¼¶¬¶©²µ
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¶¦¬²∏¶• ¤·¶q ‘¨ ∏µ²¦«¨ ° ot||s oxwkul }v{t q
≈x  徐叔云 o卞如濂 o陈 修 q药理实验方法学 q第二版 q北京 }人民
卫生出版社 ot||t qyy{ q
Τηε Μεασυρεµεντ οφ Τψροσινε Ηψδροξψλασε Αχτιϖιτψ
ιν τηε Βραιν οφ Χονσχιουσ Ρατσ
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„©·¨µ¬±·µ¤³¨µ¬·²±¨ ¤¯ ¤§°¬±¬¶·µ¤·¬²± ²© §²³¤°¬±¨ µ¨¦¨³·²µ¤ª²±¬¶·¤³²°²µ³«¬±¨ ·«¨ ⁄’°„ ²∏·³∏·º¤¶§¨¶¨¤¶¨§q„©·¨µ¬±·µ¤³¨µ¬·²±¨ ¤¯
¤§°¬±¬¶·µ¤·¬²± ²© §²³¤°¬±¨ µ¨¦¨³·¨µ¤±·¤ª²±¬¶·«¤¯²³¨µ¬§²¯ o·«¨ ⁄’°„ ²∏·³∏·º¤¶¬±¦µ¨¤¶¨§q × «¨ ¶·∏§¼ ¶«²º §¨·«¤··º ±¨·¼2©²∏µ
«²∏µ¶²©·¨µ¬°³¯¤±·¤·¬²± ²©·«¨ ³µ²¥¨ º¬·«¬±©∏¶¬²± ²© s qst °°²¯ #p t ‘≥⁄tstx o·«¨ ⁄’°„ ¯¨ √¨¯ ¬± ·«¨ ¶·µ¬¤·∏° ²© y2«¼§µ²¬2
§²³¤°¬±¨ 2³µ¨·µ¨¤·¨§µ¤·¶º¤¶s qv| ? s qtu³°²¯r°¬±k÷ ? ≥ o± € xl qΧονχλυσιον :× «¨ ⁄’°„ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²±¬±¶·µ¬¤·¤¯ §¬¤¯¼¶¤·¨¶¦²∏¯§¥¨
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«¼§µ²¬¯¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¼¬±·«¨ ¥µ¤¬±¬¶µ¨ ¬¯¤¥¯¨q
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[ Κεψ ωορδσ] ·¼µ²¶¬²± «¼§µ²¬¯¤¶¨ ~¦²±¶¦¬²∏¶µ¤·¶~ °¬¦µ²§¬¯¼¶¬¶¬± ¥µ¤¬±~ ‹¬ª« ° µ¨©²µ°¤±¦¨ ¬´∏¬§ ≤«µ²°¤·²ªµ¤³«¼ p ∞¯ ¦¨·µ²2
¦«¨ °¬¦¤¯ ⁄¨ ·¨¦·²µ¶¼¶·¨°
≈责任编辑 方文贤 
大豆提取物对去卵巢大鼠能量平衡的作用
王继峰 o李 华 o牛建昭 o张 弛 o刘连起 o李贡宇 o屠衡箐
k北京中医药大学 o北京 tsssu|l
≈摘要  目的 }确定大豆提取物及其有效成分对去卵巢大鼠能量代谢的药理作用 ∀方法 } • ¬¶·¤µ大鼠 |s只 o
随机分成正常组 !假手术组 !模型组 !雌激素组 !高剂量大豆黄酮组 !低剂量大豆黄酮组 !高剂量大豆提取物组 !低剂
量大豆提取物组 !大豆多糖组 o每组 ts只 ∀除假手术组与正常组外 o其余各组均切除双侧卵巢 ∀术后 t周开始每
周测量 t次体重 !日进食量 ∀y周后处死动物 o计算饲料转化率 o测量身长 o计算体重系数 o分离腹部脂肪并称重 ∀
结果 }切除卵巢后动物进食量 !体重与体重系数增加 !饲料转化率加大 o腹部脂肪堆积 ∀雌激素组 o大豆提取物组及
大豆黄酮组均不同程度减弱去卵巢引起的能量代谢改变 o但大豆多糖无作用 ∀结论 }去卵巢大鼠可作为更年期妇
女肥胖的动物模型 o大豆提取物有减弱去卵巢引起的病理改变 o其有效成分为黄酮类化合物 ∀
≈关键词  去卵巢大鼠 ~体重指数 ~腹部脂肪 ~大豆黄酮 ~雌激素
≈中图分类号  • u{x qx ≈文献标识码  … ≈文章编号  tsst2xvsukussulsu2stvx2sx
更年期妇女由于卵巢萎缩 o功能下降 o体内的雌
激素水平明显低于绝经前 ∀ • ¬±ª • • 等人报道 o更
年期妇女体重平均每年增加 t磅 o而且主要是脂肪
组织的增加 o并呈向中性肥胖 o腹围有明显的增
加≈t  ∀大量的研究表明 o腹部肥胖的/苹果型0身材
与血脂的增加 !血压的升高 !胰岛素抵抗有密切的关
系 o而这些都是患心血管疾病的重要的危险因素≈u  o
因此 o降低体重并且减少腹部脂肪的堆积对预防 µ
型糖尿病 !脂代谢紊乱 !高血压 !某些癌症和冠心病
有非常重要的意义 ∀我们在实验中发现切除大鼠卵
巢后动物体重明显增加 o血胆固醇增高 o肝内脂肪与
胆固醇积蓄和性器官如子宫与阴道萎缩 ∀但去卵巢
动物的能量代谢规律并无文献报道 ∀因此本课题研
究目的在于 ≠通过切除大鼠卵巢建立更年期妇女肥
胖的动物模型 ~ 探讨切除卵巢大鼠能量代谢的规
律及其机制 ~≈ 初步确定大豆提取物及其有效成分
的药理作用 ∀
≈收稿日期  usst2s{2s{
≈基金项目  国家科委生命科学技术发展中心5新药基金6资助
k|y2|st2uxyl
≈作者通讯  电话kstslywu{y||x ~传真 }kstslyw|x{uwu ~ ∞2
°¤¬¯}º¤±ª­­©©ƒ uyv q±¨ ·
1 材料和方法
1 q1 实验材料
1 q1 q1 动物
• ¬¶·¤µ雌性大鼠 o体重kuws ? tsl ªo购自医学
科学院动物研究所实验动物繁育所 ∀实验期间饲喂
于二级动物室 o温度kux ? tl ε ∀
1 q1 q2 药物
大豆提取物与大豆黄酮均由本教研室提供 ∀临
用前将二者配成所需要的浓度 ∀阳性对照药物为尼
尔雌醇k±¬¯¨ ¶·µ¬²¯¬l o北京四环制药二厂生产 o批号为
usssswsv o制成蒸馏水混悬液 ∀大豆多糖是在制取
大豆提取物时 o提取液经过大孔树脂的水洗脱液 ∀
1 q1 q3 主要仪器
电子读数分析天平 o日本 ≥«¬°¤§½∏公司生产 ∀
1 q2 实验方法
1 q2 q1 分组
• ¬¶·¤µ大鼠 |s只 o随机分成正常组 !假手术组 !
模型组 !雌激素组 !高剂量大豆黄酮组 !低剂量大豆
黄酮组 !高剂量大豆提取物组 !低剂量大豆提取物
组 !大豆多糖组 o共 |个组 o每组 ts只 ∀各组每日均
给予普通全价饲料喂养 o饮水为自来水 ∀
1 q2 q2 造模
#xvt#
第 uz卷第 u期
ussu年 u月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ quz o‘²qu
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