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Theinterferenceincorrelatedmolecularmechanismobtainedmultidrug
resistanceofmouseS180’stumourcelfordiferentalkaloid
LIGuihai1,PANChengye2,SUNFujun1,YINGeping3,WANGXuerong1
(1ShandongAcademeofTraditionalChineseMedicine,jinan250014,China;2YuHuangdingHospital
ofYantai,Yantai256001,China;3JinanMilitaryGeneralHospital,Jinan250031,China)
[Abstract] Objective:Toobservethebaseoftheinterferenceincorelatedbioticactivematerobtainedmultidrugresistanceinduced
bychemotherapyfordiferentalkaloid,andtosupervisetheuseinclinictorestrainthemultidrugresistantofchemotherapy,andtherebytoim
provethecurativeefect.Method:AfterbestowingsubterdosageunitechemotherapeutanttoascitesS180mousetosetupthemousemodelsof
multidrugresistanceofS180tumourcel,andgivingthemousematrine,terandrine,oxymatrineandberberinehydroohloridefor4weeks,the
P170,LRP,TOPOI,Fasandapoposisweredeterminedbyflowcytometry.Result:matrineandterandrinecouldobviouslyreducetheexpress
ofP170,LRPandtheactivationofTOPOI,andincreasetheratiooftheexpressofFasandtheapoposisofdrugresistanttumourcel.Andat
thesametimeitcouldobviouslyreducetheexpressofintercelularadhesionmolecule(CD54).Conclusion:Matrineandterandrinecaninter
fereinMDRwhichresultsfromchemotherapeuticsbytheadjustmentofcorelatedbioticactivemater,besides,thediferentdegreeofalkaloid
efectwithdiferentconfiguration
[Keywords] alkaloid;multidrugresistance;mouse;P170;LRP;TOPOI;Fas [责任编辑 方文贤]
[收稿日期] 20050528
[基金项目] 河北省科学技术委员会基金项目(05276101D89)
[通讯作者] 王文智,Tel:(0311)86265053,Email:zyxb407@126com
骨复活汤对激素性股骨头坏死细胞凋亡的影响
田伟明1,王文智2,王鑫国2,徐国华1
(1河北医科大学 中医院,河北 石家庄 050011;
2河北医科大学 中医学院,河北 石家庄 050091)
[摘要] 目的:观察激素性股骨头缺血性坏死(SANFH)骨标本及骨复活汤对 SANFH细胞凋亡的影响。方法:
采用臀部注射醋酸氢化泼尼松建立兔股骨头骨坏死模型,6周处死取材,采用 TUNEL标记法,研究细胞凋亡情况。
结果:激素性骨坏死标本上,存在大量凋亡的骨细胞及成骨细胞,模型组与对照组、骨复活汤组及仙灵骨葆组家兔
股骨头骨细胞凋亡指数比较均有显著性差异(P<005)。结论:家兔早期 SANFH病程中,骨坏死是通过激素诱导
骨细胞及成骨细胞的凋亡和坏死共同作用的结果,骨复活汤在改善家兔 SANFH的骨细胞、成骨细胞凋亡及坏死方
面有一定作用。
[关键词] 骨复活汤;激素性股骨头缺血性坏死;兔;细胞凋亡;原位末端标记检测法
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中 国 中 药 杂 志
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[中图分类号]R2855 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2005)23184804
激素性股骨头缺血性坏死(SANFH)的发病率占
非创伤股骨头坏死的首位,但其确切的发病机制尚
未十分清楚,严重影响了临床预防和治疗工作的开
展。近年来一些国外学者报道在股骨头坏死骨组织
中发现大量的凋亡骨细胞,进一步阐述了股骨头坏
死的发病机制。本实验进一步了解 SANFH股骨头
局部细胞凋亡情况,探讨SANFH的发病机制及应用
骨复活汤对 SANFH股骨头局部细胞凋亡的干预作
用。
1 料材与方法
11 药物 骨复活汤由仙灵脾、熟地黄、骨碎补、鸡
血藤、丹参、怀牛膝、水蛭等药物组成,由河北医科大
学中医院提供,1g·mL-1,试验时减压浓缩至所需浓
度;仙灵骨葆购于贵州同济堂制药有限公司。
12 动物及分组 健康新西兰家兔,雌雄各半,6
月龄,体重18~24kg,购自中国人民解放军白求
恩国际和平医院动物室;将实验动物随机分为模型
组、对照组、骨复活汤组及仙灵骨葆组,每组均为 8
只。
13 试剂 TUENL试剂盒购自河北博海生物工程
有限公司;DAB显色试剂盒购自河北博海生物工程
有限公司;蛋白酶K华美公司进口分装。
14 造模方法及给药 采用臀部肌注大剂量醋酸
泼尼松法造模,每周 2次,每次为 75mg·kg-1,对
照组注射等量生理盐水,骨复活汤组及仙灵骨葆组
同模型组一样,用药同时每日给予骨复活汤(15g·
kg-1)及仙灵骨葆(06g·kg-1)灌胃给药,为了预防
感染所有动物每周 2次肌注青霉素(5×104单位/
只),共注射6周。
15 HE染色 分别于用药后6周处死动物,剖取
右侧股骨头,剔除周围软组织,沿冠状面劈开,置
10%福尔马林溶液中固定,5%硝酸脱钙,系列乙醇
脱水,石蜡包埋,切片,HE染色,光镜观察。骨细胞
坏死病理变化用空骨陷窝百分数表示,即在 100倍
放大倍率下,任选10个高倍镜视野,每个视野计数
50个骨陷窝,分别数出空骨陷窝数,求出空骨陷窝
所占的百分数。
16 细胞凋亡(TUNEL)法检测 取材同 15,以
TUNEL染色阳性细胞着色定于胞核内,呈棕褐色或
棕黄色,少数胞质出现阳性颗粒。否则视为假阳性
着色。每张切片随机选10个高倍镜视野(放大 200
倍),每个区域计数50个骨细胞,计算凋亡细胞指数
(凋亡细胞数/视野中细胞总数)。
17 统计学处理方法 经 SAS统计软件做方差分
析、q检验处理,实验数据用珋x±s表示。
2 结果
21 空骨陷窝情况 对照组兔股骨头骨髓内骨细
胞着色均匀,形态正常,分布适中;模型组兔股骨头
骨髓内骨细胞不着色,形成大量空骨陷窝;骨复活汤
组兔股骨头骨髓内骨细胞变性,核变扁偏于一侧,骨
细胞核部分着色,骨细胞分布较对照组少,空骨陷窝
少;仙灵骨葆组兔股骨头骨髓内骨细胞变性,核变扁
偏于一侧,骨细胞核少部分着色,空骨陷窝少,骨细
胞分布较骨复活汤组少。各组股骨头骨细胞空骨陷
窝百分比见表 1,其方差分析:F=2695,P=
00001,4组间有显著性差异,q检验:模型组与对
照组、骨复活汤组及仙灵骨葆组家兔股骨头空骨陷
窝率比较,有显著性差异(P<005),骨复活汤组与
仙灵骨葆组比较,无显著性差异(P>005),骨复活
汤组、仙灵骨葆组与对照组空骨陷窝率比较,有显著
性差异(P<005),见表1。
表1 各组家兔股骨头骨细胞空骨陷窝百分比、凋亡
细胞指数(珋x±s,n=8)
组别
剂量
/g·kg-1
空骨陷窝计数 凋亡细胞指数
对照组 - 12.01±2.132) 3.10±0.412)
模型组 - 26.03±4.541) 30.41±4.911)
骨复活汤组 15 16.50±2.561,2,3) 21.93±2.271,2,3)
仙灵骨葆组 0.6 17.51±2.981,2) 23.28±2.471,2)
注:与对照组比较1)P<005;与模型组比较2)P<005;与仙灵骨
葆组比较3)P>005
22 骨细胞凋亡 对照组标本上的骨细胞凋亡极
少(图1),骨细胞凋亡指数为310±041;模型组可
见骨细胞核中有棕黄色颗粒的阳性细胞,即凋亡细
胞,骨髓组织内出现大量凋亡的骨细胞(图2),其骨
细胞凋亡指数为3041±491;骨复活汤组骨细胞凋
亡较病理模型组少(图 3),骨细胞凋亡指数为
2193±227;仙灵骨葆组标本上,骨细胞凋亡较病
理模型组少,骨细胞凋亡指数为 2328±247;方差
分析:F=12259,P=00001,4组间有显著性差
异。q检验:模型组与对照组、骨复活汤组及仙灵骨
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葆组股骨头骨细胞凋亡指数比较,P<005,有显著
性差异;骨复活汤组与仙灵骨葆组股骨头骨细胞凋
图1 对照组骨细胞凋亡不明显(TUNEL×400)
图2 模型组骨细胞凋亡明显增多(TUNEL×400)
图3 骨复活汤组骨部分骨细胞凋亡(TUNEL×400)
亡指数比较,P>005,无显著性差异;骨复活汤组、
仙灵骨葆组与对照组股骨头骨细胞凋亡指数比较,
P<005,有显著性差异,见表1。
23 成骨细胞凋亡 对照组标本上的成骨细胞凋
亡极少(图4),在模型组的骨标本上,可见成骨细胞
核中有棕黄色颗粒的阳性细胞,出现大量成骨细胞
凋亡(图5),骨复活汤组成骨细胞凋亡较病理模型
组少(图6),仙灵骨葆组的骨标本上,成骨细胞凋亡
较病理模型组少。
图4 对照组成骨细胞凋亡不明显(TUNEL×400)
3 讨论
研究表明,生物体细胞可通过坏死或凋亡 2种
模式死亡,两者在功能、结构机制和特征上都存在着
本质性不同,细胞凋亡是在局部环境、生理或病理性
刺激引起的,一种受基因控制的程序性细胞死亡过
图5 模型组成骨细胞凋亡明显增多(TUNEL×400)
图6 骨复活汤组部分成骨细胞凋亡(TUNEL×400)
程,是一种主动的细胞死亡形式,其过程主要包括5
个阶段,即凋亡的激发、细胞内凋亡信号的传导及调
控、凋亡效应分子的激活、蛋白及 DNA分子的断裂、
细胞死亡。细胞凋亡与细胞产生一样都是机体自然
的生理过程,两者并存,且保持动态平衡,这种平衡
是保持机体组织器官形态学稳定性、机体生理功能
和内外环境稳定的必要条件,如果细胞凋亡过多或
过少,导致这种平衡破坏,就会导致疾病的产生。
激素作为非创伤性股骨头缺血性坏死的重要原
因业已被广泛接受,对 SANFH发病机制的研究,提
出了诸多学说,如脂肪栓塞、骨内高压、脂肪细胞增
大、骨细胞内脂滴聚集、骨质疏松、累积性骨细胞功
能紊乱等,但其确切机制尚未十分明了[1]。而且,以
上学说并未明确证明骨细胞发生的是坏死,因为并
未观察到坏死为特征的细胞肿胀及炎症反应[2]。实
验证实激素是一种细胞凋亡诱导剂[3],促使成骨细
胞和骨细胞凋亡导致骨细胞减少[4],同时还影响成
骨细胞功能,使成骨作用延迟,介导细胞凋亡,造成
骨丢失[5]。因此,认为激素诱发的股骨头缺血性坏
死实际上是一个误称,骨细胞不是坏死而是永久的
凋亡。
TUNEL法由 Gavrieli等于 1992年创立,虽然不
能区分凋亡特异性的 DNA降解和坏死非特异性的
DNA降解,但因其主要用于原位检测核内染色质的
断裂和双链DNA被生物素标记后特异性地用于检
测凋亡细胞,能帮助识别细胞凋亡及其在组织中的
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分布,且DNA的裂解出现在细胞形态学改变之前,
故被广泛应用于细胞凋亡的检测[6]。本实验采用
TUNEL法对 SANFH检测出大量的阳性细胞,说明
SANFH的骨细胞、成骨细胞的确存在DNA特异性裂
解。凋亡细胞数明显高于对照组,提示细胞凋亡参
与SANFH的发生发展。本研究组织学观察有不同
程度的空骨陷窝形成,空骨陷窝数明显高于对照组,
意味着出现了骨细胞的死亡[1],故认为在激素性早
期骨坏死中,骨细胞的死亡是以骨细胞凋亡和坏死
共同作用的结果方式进行的。
骨复活汤组骨细胞凋亡较病理模型组少,两组
比较,有显著性差异(P<005),骨复活汤组成骨细
胞凋亡也较病理模型组少,光镜下见股骨头空骨陷
窝数较少,与病理模型组股骨头空骨陷窝数比较,有
显著性差异(P<005),说明骨复活汤可明显降低
SANFH家兔股骨头骨细胞和成骨细胞凋亡及坏死,
骨复活汤在改善家兔SANFH的骨细胞、成骨细胞凋
亡及坏死方面有一定作用,这可能是其治疗股骨头
缺血坏死的机制之一。
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EfectofGufuhuodecoctiononlocalapoptosisofsteroidinduced
necrosisoffemoralhead
TIANWeiming1,WANGWenzhi2,WANGXinguo2,XUGuohua1
(1.TraditianalChineseMedicineHospital,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China;
2.TraditianalChineseMedicineColege,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050091,China)
[Abstract] Objective:ToobservethebonespecimenofSANFH(steroidinducedavascularnecrosisoffemoralhead)andtheefectof
GufuhuodecoctiononlocalapoptosisofSANFH.Method:Modelrabbitsofnecrosisoffemoralhead,madebyintraglutealinjectionwithpred
nisoneacetate,werekiledafter6weekstostudytheapoptosisbymeansofTUNEL.Result:Agreatnumberoffadedosteocytesandos
teoblastsexistedinspecimenofSANFH.Therewassignificantdiferenceinapoptosisindexesbetweenmodelandcontrolgroup,Gufuhuode
coctionandXianlinggubaogroup(P<005).Conclusion:InthecourseofSANFH,thenecrosisresultsfromtheinteractionofapoptosisand
necrosisofsteroidinducedosteocytesandosteoblasts.GufuhuodecoctionhassomeefectsonimprovingapoptosisandnecrosisofSANFH.
[Keywords] Gufuhuodecoction;SANFH(steroidinducedavascularnecrosisoffemoralhead);rabbits;apoptosis;TUNEL(TdTne
diateddUTPnickendlabeling) [责任编辑 方文贤]
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