全 文 ：肝细胞靶向甘草次酸表面修饰脂质体的制备
毛声俊 o侯世祥 o金 辉 o张良珂 o蒋 彬
k四川大学 华西药学院 o四川 成都 ytsswtl
≈摘要  目的 }研制靶向于肝细胞的甘草次酸表面修饰脂质体 ∀方法 }化学合成 v2琥珀酸2vs2硬脂醇甘草次酸
酯k≥∏¦2Š„’≥·l作为导向分子 o采用乙醇注入法制备甘草次酸表面修饰脂质体k°2≥ 2Š„l ∀结果 }≥∏¦2Š„’≥·确能
掺入脂质膜中 o掺入比例最高可达总脂质的 | h ∀结论 }°2≥ 2Š„ 制备成功 o可作为肝细胞主动靶向给药的潜在途
径 ∀
≈关键词  甘草次酸 ~表面修饰 ~脂质体 ~肝细胞
≈中图分类号  • u{v ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussvlsvu{2sw
‘¨ ª¬¶«¬在 us世纪 |s年代初证实了大鼠肝细
胞膜组分中含有大量甘草次酸kª¯¼¦¼µµ«¨·¬±¬¦¤¦¬§o
Š„l特异结合位点 oŠ„ 与该位点的结合呈可饱和
性 !高度特异性 o且该位点具蛋白质性质≈t  ~国内也
有研究证实了肝细胞表面确存在大量 Š„ 受体≈u  ∀
为此我们设想将 Š„与硬脂醇 !琥珀酸酐偶联 o合成
一新型两亲性导向分子 o将其掺入脂质体中 o介导该
修饰脂质体与肝细胞表面的 Š„ 受体特异结合 o以
期达到肝细胞主动靶向作用 ∀本文首次就甘草次酸
表面修饰脂质体的制备工艺进行了研究 o以为进一
步探讨肝细胞对其摄取的机理及规律奠定基础 ∀
1 仪器与试药
‹°ttss 高效液相色谱仪 k美国l o≥¤µ·²µ¬²∏¶
tzut型电子天平k德国l o ¤¯√ µ¨±2usss型激光散射
粒径分析仪k英国  ¤¯√ µ¨±公司l o{x2u型恒温磁力
搅拌器k上海司乐仪器厂l o‹Œ× „≤ ‹Œ ‹2yss 透射电
子显微镜k日本l ∀
注射用大豆磷脂k上海太伟药业有限公司l o胆
固醇k生化试剂 o上海伯奥生物科技有限公司l o
≥ ³¨«¤§¨ ¬ Š2xsk°«¤µ°¤¦¬¤l o乙腈为色谱纯 o磷酸盐
缓冲溶液 ktu °°²¯ # pt ‘¤‹u°’w2xt °°²¯ # pt
‘¤u ‹°’w2zz °°²¯ #pt ‘¤≤¯o³‹ z qw ou{s °’¶°#
®ªp tl os qsx °²¯#p t ×µ¬¶2‹≤¯缓冲液k³‹ z qwl o脂
质体解体溶剂k乳化剂 ’°2无水乙醇2s qt °²¯#p t
≈收稿日期  ussu2ts2s|
≈基金项目  国家自然科学基金面上资助项目kvsuztytvl
≈通讯作者  侯世祥 ר¯ }ksu{l {xxsu{s| ƒ¤¬}ksu{l
{xxsu{s| ∞2°¤¬¯}«²∏¶¬¬ƒ uyv q±¨ ·
‹≤¯€ tΒusΒvsl ∀其余药品 !试剂均为分析纯 ∀
2 方法与结果
2 q1 导向分子的合成
称取硬脂醇 u qz ªo二环己基碳二亚胺 u qs ª混
匀 o加入 ≤∏≤¯适量 o{s ε 恒温搅拌 w «~加入 Š„w qz
ªo二甲基亚甲酰胺 us °o继续搅拌 w «∀将反应液
过滤 o滤液置冰水浴中冷却 o得黄色固体 ∀硅胶柱层
析分离 o采用乙酸乙酯与石油醚混合溶剂进行洗脱 o
得固体物 x ªo重结晶后得白色固体 w ªo经结构确证
为 Š„’≥·∀称取 Š„’≥·v qx ªo琥珀酸酐 s qy ªo加
入少量吡啶混匀 o置微波反应器中反应 us °¬±∀
׏≤检查反应基本完全 o产物硅胶柱层析纯化 o乙
酸乙酯与石油醚混合溶剂进行洗脱 o得白色固体
v qx ªo经核磁共振氢谱及质谱等确证其结构为 ≥∏¦2
Š„’≥·k有关数据略l o合成路线见图 t ∀
2 q2 导向分子定量方法的建立 为合理考察 !评
价 °2≥ 2Š„ 的制备工艺及验证导向分子是否在
脂质体膜上成功表达 o本研究特建立了 ≥∏¦2Š„’≥·
的 ‹°≤ 定量方法 ∀色谱柱 }分析柱为 ≥«¬°2³¤¦®
≤≤2’⁄≥ 柱kw qy °° ≅ txs °° ox Λ°l o预柱为
≠ • Š2’⁄≥kw qy °° ≅ ts °° ots Λ°l ~流动相乙腈2
乙醇ktsΒ|sl ~流速 t qs °# °¬±p t ~检测波长 uwz
±° ~柱温 us ε ~理论塔板数按 ≥∏¦2Š„’≥·色谱峰计
算应不低于 u sss ∀归一化法测定含量  |{ h ∀标
准 曲线回归方程 Α € zzw qyw Χ p us qz{ oρ €
s q||| z ∀ ≥∏¦2Š„’≥·进样量在 s qtsz z ∗ x qv{x
Λªo其峰面积响应值与 ≥∏¦2Š„’≥·的进样量有良好
的线形关系 ∀精密度 • ≥⁄€ s qwz h oν € x ~高 !中 !
低 v个浓度的平均加样回收率 € || quw h o• ≥⁄ €
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第 u{卷第 w期
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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t qsz h oν € y ~重现性 • ≥⁄€ s q|y h oν € x ∀
2 q3 普通脂质体的制备
肝窦状隙的平均孔径约为 tsy ±° o最大可达
uss ∗ vss ±° ∀为使制备的脂质体能到达肝实质细
胞 o应将其粒径控制在 tss ±°左右 ∀为此 o我们选
择乙醇注入法制备脂质体 o并采用单因素法对制备
工艺进行了考察 ∀
2 q3 q1 水相
分别配制 s q| h 氯化钠溶液 o°…≥ os qsx °²¯ #
pt×µ¬¶2‹≤¯缓冲液作为水相 ∀取磷脂k°≤l和胆固
醇k≤ ‹l组成的混合类脂乙醇溶液适量 o分别快速注
入恒温搅拌的上述 v种水相中 o挥尽乙醇 o即得脂质
体混悬液 ∀室温下放置 uw «后 o观察其物理外观变
化 o同时测定其粒径大小与分布 ∀结果发现 o以 °…≥
为水相时 o所得脂质体最为稳定 o粒径约 tus ±° o大
小分布均匀 ∀因此 o确定用 °…≥作为水相 ∀
图 t ≥∏¦2Š„’≥·合成路线
2 q3 q2 磷脂k°≤l和胆固醇k≤ ‹l的用量
分别取 °≤ 和 ≤ ‹ 适量 o精密称定 o溶于适量无
水乙醇中 o配成 °≤Β≤ ‹k摩尔比l分别为 xΒu ouΒt ovΒ
u otΒt otΒu的系列混合类脂溶液 ∀分别将不同比例
的类脂溶液注入 °…≥中 o同法制备脂质体 o并记录
其在室温下物理外观发生变化的时间 ∀结果表明 o
当 °≤Β≤ ‹ € tΒt时 o制备的脂质体最稳定 ∀故处方
中确定 °≤ 与 ≤ ‹ 的用量比例为 tΒt ∀
2 q3 q3 水浴温度
将处方量的混合类脂溶液分别注入 ws oxs oys o
zs ε 水浴恒温的 °…≥中 o恒速搅拌至挥尽乙醇 ∀结
果发现 o温度控制在 ys ε 以下时 o所得脂质体物理
外观与室温下放置的稳定时间无明显差异 ~zs ε
时 o在制备过程中即有白色沉淀析出 ∀水浴温度越
低 o则挥尽乙醇所需时间越长 o易造成磷脂氧化 ∀故
最终选定的水浴温度为 ys ε ∀
2 q3 q4 搅拌速度
在制备过程中发现 o搅拌速度过快 o液体易产生
泡沫 ~速度慢则脂质体易发生粘连和聚集 o且粒度分
布不均匀 o故选定搅拌速度为中速 o即 xss µ#°¬±p t ∀
优选出的脂质体制备工艺为 }精密称取处方量
的磷脂与胆固醇 o另加入适量脂溶性抗氧化剂维生
素 ∞o以无水乙醇溶解 o配成混合类脂溶液k°≤Β≤ ‹
€ uΒtl ∀取适量快速注入 ts °恒温至 ys ε 的
°…≥中 o电磁搅拌kxss µ#°¬±p tl至挥尽乙醇k约 tx
°¬±l o即得普通脂质体混悬液 ∀
2 q4 甘草次酸表面修饰脂质体的制备
2 q4 q1 导向分子的加入方式
取适量上述混合类脂溶液k≥∏¦2Š„’≥·溶入l o
快速注入 °…≥中 o挥尽乙醇 o得甘草次酸表面修饰
脂质体混悬液 o记为 °2≥ 2Š„t ∀另取等量的混合
类脂溶液首先制备得普通脂质体混悬液 o再取与
°2≥ 2Š„t等量的 ≥∏¦2Š„’≥·o用适量无水乙醇溶
解后注入其中 o继续搅拌至挥尽乙醇 o所得脂质体混
悬液记为 °2≥ 2Š„u ∀
精密吸取脂质体混悬液 t °o上样于 Š2xs
≥ ³¨«¤§¨ ¬柱 o以 °…≥洗脱 o收集淡蓝色的脂质体部
分 o置 ts °容量瓶中 o加入解体溶剂稀释至刻度 o
混匀 o进样 ‹°≤ o依法测定 u种不同工艺制备得到
的 °2≥ 2Š„ 中 ≥∏¦2Š„’≥·的含量 ∀结果表明 o
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≥∏¦2Š„’≥·无论在脂质体形成前后加入 o均能有效
掺入脂质膜中 o掺入比率k脂质体部分 ≥∏¦2Š„’≥·
含量r加入的 ≥∏¦2 Š„’≥·总量 ≅ tss h l分别为
|x qu h和 |x qx h ou种方法无显著差异 ∀为操作方
便 o选用 °2≥ 2Š„t的制备方法 o即在脂质体形成
前将 ≥∏¦2Š„’≥·与类脂共溶于无水乙醇后再注入
水相中 ∀
2 q4 q2 导向分子与混合类脂的用量
分别取 ≥∏¦2Š„’≥·适量 o精密称定 o加入适量
上述混合类脂溶液溶解 o配成一系列不同摩尔比例
k导向分子Β磷脂l的混合溶液 o余下操作照 °2≥ 2
Š„t的制备方法进行 o依法测定 ≥∏¦2Š„’≥·含量 o
计算其掺入比率 o结果见表 t ∀
由表 t可见 o当 ≥∏¦2Š„’≥·与混合类脂的比例
为 tΒts时 o掺入比率最高 ~进一步增加 ≥∏¦2Š„’≥·
的比例 o所得 °2≥ 2Š„ 为白色混浊液 o短时间内
即出现大量絮状沉淀物 o无法测定其含量 ∀因此 o确
定该导向分子在处方中的最佳用量比例为 ≥∏¦2
Š„’≥·Β混合类脂 € tΒts ∀
表 t 不同处方配比中
导向分子 ≥∏¦2Š„’≥·的掺入比率
t{2Š„2≥∏¦Β混合类脂r°²¯Β°²¯ 掺入比率r h
t }ys |x qt
t }ws |x qu
t }us |x qw
t }ts |x qy
t }x p
2 q5 °2≥ 2Š„与 °的形态观察
分别将所得 °2≥ 2Š„ 与 ° 溶液上样 Š2xs
≥ ³¨«¤§¨ ¬柱 o°…≥进行洗脱 o收集蓝色乳光部分 ∀室
温条件下用 u h磷钨酸负染样品后 o透射电子显微
镜观察粒子形态 o并拍摄照片 o结果见图 u ∀
图 u °2≥ 2Š„与 °的透射电镜照片
由图可见 o乙醇注入法制备的 °形态较为圆
整 o而 °2≥ 2Š„ 的形态则以圆形为主 o另有部分
呈多边性 ∀
2 q6 °2≥ 2Š„ 与 °的粒径大小分布测定与物
理稳定性
分别取 °2≥ 2Š„ 与 °混悬液适量 o加入至
蒸馏水 wss °中 o用粒径分析仪分别测定所得纳米
粒的表面积平均粒径及其分布 ∀分别在室温kux
ε l !冰箱贮存kw ε l条件下 o记录样品物理外观开
始发生变化的时间 o结果见表 u ∀由表可见 o°2≥ 2
Š„与 °的表面积平均粒径及粒径分布相似 o°
的物理稳定性则略优于 °2≥ 2Š„ ∀
表 u °2≥ 2Š„与 °的表面积平均粒径及分布 !物理稳定性比较
脂质体 表面积平均粒径 ∆≈u ov 粒径分布
物理稳定性
ux ε w ε
° ttz ±° ≈ δks qtl € xv ±° oδks qxl € z| ±° oδks q|l € tu{ ±°  zs « tw §
°2≥ 2Š„ ttu ±° ≈ δks qtl € vy ±° oδks qxl € yx ±° oδks q|l € ttv ±°  xu « tt §
3 讨论
3 q1 导向分子 ≥∏¦2Š„’≥·的两亲性
在合成的导向分子 ≥∏¦2Š„’≥·中 o硬脂醇的碳
链为疏水端 o甘草次酸连接的琥珀酸为亲水端 o故该
两亲性分子可以较高的比例掺入脂质体双层膜中 ∀
我们曾进行了导向分子 ≥∏¦2Š„’≥·的正辛醇r水分
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配系数测定 o证实了其确具有两亲性 o且亲脂性明显
强于亲水性 ∀
3 q2 关于表面修饰的配体表达量
目前 o关于脂质体表面修饰时配体表达量究竟
多少比例适宜 o尚无定论 ∀这主要是由于不同细胞
受体识别 !结合配体的能力存在较大差异所致 ∀一
般情况下 o配体数目占载体的比例多为 ts h k摩尔
比l左右 ∀本研究制备的 °2≥ 2Š„ 中导向分子占
混合类脂的 | h o应能满足主动靶向于肝k实质l细胞
的要求 ∀
3 q3 °2≥ 2Š„与 °的形态观察
乙醇注入法制备的脂质体在置于透射电镜下观
察时 o由于改变了脂质体本身的存在状态 o加之脂质
双分子层膜经电子束轰击后易破裂 o并伴有膜融合
现象发生 o因此在拍摄照片时难以获得理想效果 o实
际观察中见到的脂质体形态比照片所示效果要好 ∀
3 q4 受体介导的肝细胞主动靶向给药系统
肝细胞膜上存在有去唾液酸糖蛋白受体k„≥2
Š°2• l o针对该受体对药物或载体进行修饰 o通过受
体2配体的特异相互作用 o可达到药物或载体的细胞
靶向 ∀然而 o有研究表明 „≥Š°2• 的结合活性可随
许多病理条件的变化而变化 o几乎所有的肝脏疾病 o
由于血清中存在结合抑制剂 o„≥Š°2• 的结合活性
均可能降低≈v  ∀此外有研究发现 o连有半乳糖的脂
质体亦被 Ž∏³©©¨µ细胞摄取 o该脂质体在肝细胞内的
分布量并不高≈w  ∀由此可见 o仅通过 „≥Š°2• 介导
实现肝细胞靶向给药的能力是有限的 o发现和利用
新的与肝细胞膜受体特异结合的配体 o开发新型受
体介导的肝细胞内靶向给药系统 o十分必要 ∀本研
究首次成功制备得到的甘草次酸表面修饰脂质体 o
可作为肝细胞主动靶向给药的潜在途径 o具有进一
步的研究与开发价值 ∀
≈参考文献 
≈t  ‘¨ ª¬¶«¬  oŒµ¬¨ „ o ‘¤ª¤·¤ ‘o ·¨¤¯ q ≥³¨ ¦¬©¬¦…¬±§¬±ª ²© Š¯ ¼2
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≈u  杨山麦 o周方成 o顾云娣 o等 q离体鼠肝细胞膜上甘草次酸和
甘草酸受体的表达 q中华肝脏病杂志 ot||| ozk增刊l }uz q
≈v  ≥·²¦®¨ µ·• o  ²µ¨¯¯ „ Š q ‹ ³¨¤·¬¦…¬±§¬±ª °µ²·¨¬±} ׫¨ Š¤¯¤¦2
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[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ¶·∏§¼·«¨ ³µ¨³¤µ¤·¬²± ²© ¬¯³²¶²° ¶¨¶∏µ©¤¦¨2°²§¬©¬¨§ º¬·«ª¯¼¦¼µµ«¨·¬±¬¦¤¦¬§·¤µª¨·¬±ª·² «¨ ³¤·²¦¼·¨¶q
Μετηοδ : v2¶∏¦¦¬±¬¦2vs2¶·¨¤µ¼¯ ª¯¼¦¼µµ«¨·¬±¬¦¤¦¬§k≥∏¦2Š„’≥·l o²±¨ ²©·«¨ ¤°³«¬³«¬¯¬¦ª¯¼¦¼µµ«¨·¬±¬¦¤¦¬§ §¨µ¬√¤·¬√ ¶¨o º¤¶¶¼±·«¨ 2
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συλτ : פµª¨·¬±ª °²¯ ¦¨∏¯ ¶¨¦¤± ¥¨ °¬¬¨ §¬±·²·«¨ ¬¯³²¶²°¤¯ °¨°¥µ¤±¨ qŒ·º¤¶¦²±©¬µ° §¨·«¤··«¨ ·¤µª¨·¬±ª °²¯ ¦¨∏¯ ¶¨¬¶| h ²©·«¨ ·²·¤¯
¬¯³¬§¶¤··«¨ °²¶·¬±·«¨ ¬¯³²¶²° ¶¨qΧονχλυσιον : ¬³²¶²° ¶¨¶∏µ©¤¦¨2°²§¬©¬¨§ º¬·«ª¯¼¦¼µµ«¨·¬±¬¦¤¦¬§ º¤¶¶∏¦¦¨¶¶©∏¯ ¼¯ ³µ¨³¤µ¨§oº«¬¦«
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[ Κεψ ωορδσ] ª¯¼¦¼µµ«¨·¬±¬¦¤¦¬§~¶∏µ©¤¦¨2°²§¬©¬¦¤·¬²±~ ¬¯³²¶²° ¶¨~«¨ ³¤·²¦¼·¨¶
≈责任编辑 刘  
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