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Studies on the seed embryo germination and propagation of Dendrobium candidum in vitro

铁皮石斛的种胚萌发及其离体繁殖研究



全 文 :铁皮石斛的种胚萌发及其离体繁殖研究
唐桂香1,黄福灯2,周伟军1
(1浙江大学 农业与生物技术学院 农学系,浙江 杭州 310029;
2浙江省农业科学院 作物与核技术利用研究所,浙江 杭州 310021)
[摘要] 目的:研究铁皮石斛种胚萌发和快速繁殖的组织培养技术,为铁皮石斛的繁殖建立最佳培养条件。
方法:以成熟的铁皮石斛种胚为研究材料,以1/2MS为基本培养基,接种到含有不同植物生长物质 BA(6苄基腺嘌
呤)和NAA(萘乙酸)组合及含有马铃薯提取液、香蕉提取物及活性碳的培养基上,诱导铁皮石斛种胚的萌发、原球
茎增殖、分化及试管苗生根。结果与结论:添加20%马铃薯液有利于种胚的萌发,种胚萌发率为7937%;BA10mg
·L-1和NAA01mg·L-1最有利于原球茎增殖,培养基中添加2%活性碳原球茎增殖倍数高;NAA有助于试管苗的生
根,不同含量NAA以05mg·L-1时试管苗平均根数最多和平均根长最长。
[关键词] 铁皮石斛;种胚萌发;原球茎的增殖
[中图分类号]S567 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2005)20158304
[收稿日期] 20040112
[通讯作者] 唐桂香,Tel:(0571)86971770,Email:tanggx@zju.
edu.cn
铁皮石斛 Dendrobiumcandidum为兰科石斛属植
物,是我国传统名贵药材之一。石斛种子细如粉尘,
一个蒴果内所含种子达100万粒之多。由于缺乏胚
乳,种子需与真菌共生才能萌发,自然条件下萌发率
非常低(不足 5%)[1]。因此石斛的自然繁殖率低,
常规繁殖又较难,铁皮枫斗的价格一直居高不下。
利用植物组织培养实现快速繁殖是石斛人工繁殖集
约化栽培幼苗的最佳途径。
自1960年法国人 Gmorel利用石斛茎尖组织培
养无病毒植株的繁殖技术创立以来,石斛组织培养
逐步走向成熟化。我国石斛组织培养起步较晚,直
到1984年徐云鹃等[2]才首次报道获得霍山石斛试
管苗。石斛组织培养再生植株与很多因素有关,如
外植体的种类、培养基类型、植物生长物质种类与含
量、培养条件等[35]。本试验以成熟的铁皮石斛种胚
为材料,以1/2MS为基本培养基,探讨植物生长物
质(BA和NAA)的不同组合、马铃薯提取液、香蕉提
取物及活性碳对铁皮石斛种胚的萌发、原球茎的增
殖、分化及试管苗生根的影响,以用于生产实际。
1 材料和方法
11 材料 成熟的铁皮石斛果实由浙江大学农业
与生物技术学院昆虫研究所提供。BA,NAA等植物
生长调节剂为美国 Sigma或日本 Wako等化学公司
的产品。
12 原球茎萌发 将含有成熟胚的铁皮石斛的果
实在75%乙醇中浸泡1min,无菌水冲洗1~2次,再
在05%的次氯酸钠溶液浸泡消毒15min,用无菌水
冲洗5~6次。在无菌条件下,用解剖针轻轻触破消
毒好的铁皮石斛果实,将种胚分别铺于 1/2MS,1/2
MS+20%马铃薯提取液,1/2MS+5%香蕉提取液固
化的培养基上,30d后计算种胚萌的萌发率。
13 原球茎增殖 将萌发的原球茎分别接种在含
有BA与NAA不同组合、活性碳(activatedcarbon,简
称AC)及马铃薯提取液(potatoextract,简称 PE)的
1/2MS液体、固体培养基上,30d后计算原球茎的增
殖率。
原球茎的增殖率=原球茎的增殖总数/原球茎外植体总数
14 原球茎的诱导分化 将种胚诱导产生的原球
茎分别接种在含有 BA与 NAA不同组合、AC和 PE
的1/2MS液体、固体培养基上,45d后测定原球茎
诱导芽的和原球茎诱导芽的增重倍数。
繁殖系数=诱导产生芽的总数/原球茎外植体的总数
增重倍数=[培养结束后原球茎的质量(mg)-培养开始
前原球茎的质量(mg)]/培养开始前原球茎的质量(mg)
15 芽的生根及栽培 将含有1~2片叶片的铁皮
石斛原球茎诱导芽接种在不同含量 NAA,20% PE
和02%AC上,30d后计算苗的成活率、每丛苗的
平均根数及长度。将苗高3cm、根长2cm左右的铁
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皮石斛苗移栽在陶粒蕨根火山岩蛭石(1∶2∶2∶5)
的栽培基质中,移栽前,基质进行高温、高压灭菌,并
用01% KMnO4的消毒液浸试管苗,移栽后置于大
棚阴凉处,保持适温(25℃)高湿(RH90%)条件,待
试管苗成活后移入大田栽植。
BA,NAA等植物生长物质采用过滤灭菌法灭菌
(045μm),1/2MS培养基采用高温(121℃)、高压
灭菌20min,固体培养基用 85g·L-1的琼脂条固
化,每1L1/2MS培养基中添加20g的食用白砂糖,
pH调为50~53,培养温度为24~26℃,每天光照
18h,光照强度为6000lx。
2 结果与分析
21 马铃薯和香蕉提取液对铁皮石斛种胚萌发的
影响 添加 5%香蕉泥和 20%马铃薯提取物的1/2
MS培养基可明显提高种胚的萌发率,种胚萌发率分
别为5250%和7937%,而在未添加任何天然附加
物的 1/2MS培养基上,种胚萌发率为 0。这与刘瑞
驹等认为马铃薯提取物对铁皮石斛原球茎的萌发、
分化和增殖有促进作用及香蕉提取物促进幼苗生长
和发育相一致[6]。
22 固体和液体培养基对铁皮石斛原球茎诱导增
殖的影响 固体和液体培养基及BA和NAA不同含
量处理对铁皮石斛原球茎诱导及增殖的影响见表
1。萌发的种胚在接种后15d左右即可见原球茎的
增殖,至培养45d后原球茎成倍地增殖(图1)。BA
和NAA4种组合处理的液体培养基,铁皮石斛原球
茎的增殖率均大大高于相同处理的固体培养基;BA
浓度太低,原球茎发生率低;BA浓度太高,则原球茎
出现严重的玻璃化现象。不论固体和液体培养基,
均以BA10mg·L-1和NAA01mg·L-1最有利原球
茎诱导增殖,繁殖系数分别达到103和171。试验
进一步发现,固体培养基培养出的原球茎呈黄绿色,
而液体培养基培养出的原球茎呈黄白色,且液体培
养基培养出的原球茎在诱导培养基上的成活率较
低,在不添加活性碳的1/2MS培养基上成活率只有
175%,而在添加活性碳的培养基上成活率为
640%。固体培养基上培养出的原球茎在诱导培养
基上的成活率均为100%。另外添加活性碳可以改
善液体培养基上原球茎的色泽,有利于原球茎的发
生,但在原球茎诱导增殖率上无明显的差异。
23 不同植物生长物质含量、天然附加物和活性
碳对铁皮石斛芽繁殖系数和增重倍数的影响 由表
表1 固体和液体培养基对铁皮石斛诱导
原球茎增殖的影响
培养基
植物生长物质组合/mg·L-1
BA NAA
原球茎增殖系数
固体培养基 0.1 0.1 2.80±0.20
0.5 0.1 8.70±0.30
1.0 0.1 10.30±0.35
2.0 0.1 7.10±0.10
液体培养基 0.1 0.1 6.90±0.64
0.5 0.1 10.30±0.49
1.0 0.1 17.10±0.92
2.0 0.1 9.80±0.28
液体培养基+活性碳 0.1 0.1 9.70±0.35
0.5 0.1 13.20±0.71
1.0 0.1 18.00±1.27
2.0 0.1 10.90±0.64
注:每接种瓶接种10个萌发种胚,至少接种30个种胚,60d后
统计结果
图1 种胚原球茎增殖
2可知 BA对原球茎诱导芽影响大,而 NAA对原球
诱导芽影响小;BA含量高(2mg·L-1),原球茎芽繁
殖系数为271和278,比 BA为1mg·L-1时的繁殖
系数增加1左右。另外,在相同植物生长物质含量
的培养基中,添加 2%活性碳和 20%马铃薯提取液
有利于提高铁皮石斛原球茎诱导芽的繁殖系数。添
加马铃薯提取液和活性碳的培养基对铁皮石斛增重
影响较大,由表2可知,在相同植物生长物质含量的
培养基中,添加 2%活性碳和 20%马铃薯提取液以
BA2mg·L-1,NAA015mg·L-1效果最佳,原球茎诱
导芽的重量可增加4756倍(见图2)。
24 不同NAA含量及活性碳对铁皮石斛苗成活率
和生根的影响 根系生长的好坏是试管苗移栽成活
的关键,NAA有助于试管苗的生根。表 3为不同含
量NAA对铁皮石斛试管苗生根的影响,结果表明不
同含量NAA,以05mg·L-1试管苗平均根数最多和
平均根长最长。在培养基中添加活性碳有助于提高
试管苗的成活率,但对苗的根数和根长影响小。
25 试管苗的移栽 试管苗出瓶前 6d,打开瓶塞
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表2 不同植物生长物质含量、马铃薯提取液和活性碳对铁皮石斛原球茎诱导芽增殖系数(倍)的影响
培养基
植物生长物质组合/mg·L-1
BA NAA
原球茎诱导芽
繁殖系数
原球茎诱导芽
增重倍数
1/2MS 1.0 0.10 1.88±0.03 17.25
1.5 0.10 2.35±0.05 14.42
2.0 0.15 2.71±0.06 10.64
2.0 0.20 2.78±0.10 13.47
1/2MS+2%AC 1.0 0.10 1.90±0.02 13.90
1.5 0.10 2.32±0.03 24.66
2.0 0.15 2.76±0.04 20.98
2.0 0.20 2.79±0.03 19.20
1/2MS+20%PE 1.0 0.10 1.85±0.02 15.10
1.5 0.10 2.45±0.06 19.59
2.0 0.15 2.80±0.03 16.11
2.0 0.20 2.89±0.04 11.98
1/2MS+2%AC+20%PE 1.0 0.10 1.94±0.03 23.44
1.5 0.10 2.52±0.05 39.58
2.0 0.15 3.08±0.02 47.56
2.0 0.20 3.04±0.03 20.58
表3 不同NAA含量及活性碳对铁皮石斛成活率和生根的影响
NAA/mg·L-1
苗成活率/% 每根苗平均根数/条 每根苗平均根长/cm
1/2MS 1/2MS+AC 1/2MS 1/2MS+AC 1/2MS 1/2MS+AC
0.01 86 98 0.9 1.1 1.2 1.3
0.1 62 98 1.9 2.0 2.0 2.3
0.5 54 100 3.5 3.7 3.0 3.1
1 46 100 2.4 2.4 1.5 1.7
2 42 98 2.2 2.4 0.8 1.0
图2 原球茎诱导产生芽
在培养室内炼苗后,再小心取出幼苗,洗净根部培养
基,移栽在含陶粒蕨根火山岩蛭石(1∶2∶2∶5)的栽
培基质中。结果表明,铁皮石斛试管苗的移栽成活
率较低,关于铁皮试管苗的移栽成活率有待于进一
步的研究。
3 讨论
由于石斛自然繁殖力极低,用组织培养方法快
速大量繁殖试管苗,是解决种苗的有效途径。国内
外研究表明石斛组培除可用种子作为外植体外,也
可用根茎、节、叶等外植体通过产生愈伤组织,进而
分化出拟原球茎获得植株[4]。曾宋君等[7]认为种胚
萌发原球茎增殖分化的基本培养基为 N6改良培养
基,而根茎、节、叶等外植体分化出拟原球茎的基本
培养基为 MS和 B5培养基。这与本试验结果不一
致。本试验结果表明以 1/2MS为基本培养基,BA
10mg·L-1和 NAA01mg·L-1最有利于原球茎增
殖,培养基中添加2%活性碳时原球茎增殖倍数高。
关于根茎、节、叶等外植体分化出拟原球茎进而分化
成石斛植株,还有待于进一步的研究。
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Studiesontheseedembryogerminationandpropagationof
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(1.DepartmentofAgronomy,ColegeofAgricultureandBiotechnology,ZhejiangUniversity,Hangzhou310029,China;
2.InstituteofCropandNuclearTechnologyUtilization,ZhejiangAcademyofAgriculturalScience,Hangzhou310021,China)
[Abstract] Objective:TodetermineoptimumcultureconditionsfortheseedembryocultureandrapidpropagationofDendrobiumcan
didum.Method:SeedembryosofD.candidumwereincubatedinthemediumcontainingacombinationof6benzylaminopurine(BA)and1
naphthaleneaceticacid(NAA),potatoextract,bananaextractandactivatedcarboninordertoinduceseedembryogermination,protocormdif
ferentiation,plantletpropagationandplantletrooting.ResultandConclusion:Themaximumembryogerminationpercentagewasobtainedin
the1/2MSmediasupplementedwith20%potatoextract.The1/2MSmediumsupplementedwith10mg·L-1BAand01mg·L-1NAAwas
verybeneficialtotheprotocormdiferentiationandpropagationofD.candidum.Thehighestprotocormpropagationindexwasobtainedfrom
themediumcontainingtheactivatedcarbon.Thehighestrootnumbersandlengthwereobservedinplantsgrowingin1/2MSmediumcontain
ing05mg·L-1NAA.
[Keywords] Dendrobiumcandidum;embryogermination;protocormpropagation
[责任编辑 张宁宁]
(上接第1568页)
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Developmentofthestudyongermplasmresourcesofmedicinal
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HUANGLuqi1,LVDongmei1,YANGBin1,SHAOAijuan1,CHENMin1,WEIJianhe2
(1ChinaAcademyofTraditionalChineseMedicine,Beijing100700,China;
2InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesand
ChinesePekingUnionMedicalColege,Beijing100094,China)
[Abstract] Accordingtothesuccessfulexperienceofstudyingoncrops,thispaperintroducedtheconceptionofthecorecolectionof
medicinalplants,andanalyzedthecharacteristicandthewaytoconstructit.Studiesonthecorecolectionwouldfulfilthemanagementandu
tilizethegermplasmresourcesconvenientlyandprovideanewideaandamethodtostudyonthegermplasmresourcesofmedicinalplants.Itis
necessarytostudyonthecorecolectionforthedevelopmentofthegermlasmresourcesofmedicinalplants.
[Keywords] medicinalplants;germplasmresources;corecolection
[责任编辑 张宁宁]
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