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Application of Hierarchical Cluster with High-Performance Liquid Chromatography in the Classification of Genus Clinopodium chinensis

高效液相色谱系统聚类分析方法在风轮菜属药材分类中的应用



全 文 :高效液相色谱2系统聚类分析方法
在风轮菜属药材分类中的应用
张雪辉 o陈建民
k中国协和医科大学 中国医学科学院 药用植物研究所 o北京 tsss|wl
≈摘要  目的 }探讨高效液相色谱技术应用于风轮菜属中药的鉴定研究 ∀方法 }利用高效液相色谱提供药材
的内在成分信息 o结合模式识别技术 o对风轮菜属植物进行了分类及鉴定 ∀结果 }色谱数据的系统聚类结果得到了
预期效果 o这对于研究风轮菜属药材的类别及近缘性提供了依据 ∀结论 }本方法具有简便 !快捷 !重现性好等优点 ∀
≈关键词  风轮菜属 ~系统聚类分析 ~药材分类
≈中图分类号  • u{u ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussvls|2s{tu2sx
风轮菜 Χλινοποδιυ µ χηινενσισ k …¨ ±·«l ’ q
Ž∏±·½¨ 始载于 5救荒本草6 o荫风轮 Χ. πολψ2
χεπηαλυ µ k∂¤±¬²·l ≤ q≠ q• ∏ ·¨‹¶∏¤±始载于5植物
实名图考6 ∀t||x年版5中国药典6收载了这 u个品
种 o药名 }断血流 ∀其制剂断血流片亦列入药典 ∀断
血流微苦 o辛凉 o归肝经 ∀功能止血 o用于崩漏 o子宫
肌瘤出血 o尿血 o牙龈出血 o创伤出血 ∀另该属植物
中还有 x种植物是传统的民间草药 o功能大致相同 ∀
唇形科风轮菜属植物约有 us种 o分布于欧洲 !中亚
及亚洲东部 o在我国共 tt 种 !x 个变种和 u 个变
型≈t  }荫风轮 Χ. πολψχεπηαλυ µ o匍匐风轮菜 Χ.
ρεπενσ k⁄q⁄²±l • ¤¯¯qo长梗风轮菜 Χ. λονγιπεσ ≤ q
≠ q• ∏ ·¨‹¶∏¤±q∞¬ ‹ q• q¬o风轮菜 Χ. χηινενσε o
风车草 Χ. υρτιχιφολιυ µ k‹¤±¦¨l≤ q≠ q• ∏ ·¨‹¶∏¤±
¬¨ ‹ q• q¬o寸金草 Χ. µεγαλαντηυ µ k⁄¬¨ ¶¯l ≤ q≠ q
• ∏ ·¨ ‹¶∏¤± ¬¨ ‹ q • q¬o寸金草 k原变型l Χ.
µεγαλαντηυ µ √¤µq µεγαλαντηυ µ o粗壮变种 Χ.
µεγαλαντηυ µ √¤µqροβυστυ µ ≤ q≠ q • ∏ ·¨‹¶∏¤± ¬¨
‹ q• q¬o美丽变种 Χ. µεγαλαντηυ µ √¤µqσπεχιοσυ µ
≤ q≠ q • ∏ ·¨ ‹¶∏¤± ¬¨ ‹ q • q¬o居间变种 Χ.
µεγαλαντηυ µ √¤µqιντερνεδιυ µ ≤ q≠ q • ∏ ·¨‹¶∏¤±
¬¨ ‹ q• q¬o披针叶变种 Χ. µεγαλαντηυ µ √¤µqλαν2
χιφολιυ µ ≤ q ≠ q • ∏ ·¨ ‹¶∏¤± ¬¨ ‹ q • q¬o异
≈收稿日期  ussu2s|2ts
≈通讯作者  陈建民 ר¯ }kstsl yu{||zvs ƒ¤¬}kstsl
yu{||zvs ∞2°¤¬¯}¦«¨ ±­¬¤±°¬± ƒ «²·°¤¬¯q¦²°
色风轮菜 Χ. δισχολορ k⁄¬¨ ¶¯l ≤ q≠ q • ∏ ·¨‹¶∏¤± ¬¨
‹ q• q¬o疏花风轮菜 Χ. λαξιφλορυ µ k ‹¤¼¤·¤l ≤ q
≠ q• ∏ ·¨‹¶∏¤±o细风轮菜k瘦风轮菜l Χ. γραχιλε
k…¨ ±·«ql ¤·¶∏° o邻近风轮菜k光风轮l Χ. χονφινε
k‹¤±¦¨l’ qŽ∏±·½¨ o邻近风轮菜k原变型l Χ. χονφινε
√¤µq χονφινε o球花变种 Χ. χονφινε √¤µqγλοβοσυ µ ≤ q
≠ q • ∏ ·¨ ‹¶∏¤± ¬¨ ‹ q • q¬o峨嵋风轮菜 Χ.
οµειενσε ≤ q≠ q • ∏ ·¨‹¶∏¤± ¬¨ ‹ q• q¬∀
戴金瑞≈u 对荫风轮 Χ. πολψχεπηαλυ µ !风轮菜
Χ.χηινενσισ!邻近风轮菜 Χ. χονφινε !细风轮菜 Χ.
γραχιλε !匍匐风轮菜 Χ. ρεπενσx种风轮菜属植物进
行了形态 !性状 !解剖构造及显微观察和扫描电子显
微镜实验 o比较了它们在生药学方面的异同 ∀在生
药性状方面 o认为荫风轮与风轮菜形态基本相似 o
茎 !叶均被糙硬毛 ∀邻近风轮菜和细风轮菜植株矮
小纤细 o茎 !叶毛稀少 o其中邻近风轮菜茎 !叶无毛 ∀
匍匐风轮菜略同风轮菜 o但茎 !叶淡黄色 o毛略稀但
更长 o植株高为风轮菜的 tru ∗ trv ∀周翰儒对荫风
轮 Χ. πολψχεπηαλυ µ !风轮菜 Χ. χηινενσε !邻近风
轮菜 Χ. χονφινε !细风轮菜 Χ. γραχιλε的营养器官进
行了解剖学研究 o通过 w种植物的茎 !根检索表的相
似性认为其化学成分亦可能相似 ∀
为了较系统的了解我国风轮菜属植物之间的相
关性 o我们应用 ‹°≤ 对 {种 t变种植物不同产地 !
不同采收日期共计 ts个品种 us个样品进行聚类分
析 ∀每种植物都含有许多化学成分 o同属不同种的
植物必定含有一些相同的化学成分 o这是化学分类
#ut{#
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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学的基本观念之一 ∀对每一种植物进行系统的植化
工作 o分离鉴定化学成分 o最后进行归纳比较 o这是
植物进行化学分类的经典方法 o但是费力费时 o投入
巨大 ∀利用色谱2光谱联用技术 o采用有用数据进行
聚类分析 o也是化学分类学研究的一条途径 ∀
1 实验材料
1 q1 仪器与试剂
• ¤·¨µ¶×  yss ≤²±·µ²¯¯¨ µ液相色谱仪 o• ¤·¨µ¶× 
yss泵 o• ¤·¨µ¶×  ||y 二极管阵列检测器 o• ¤·¨µ¶
¬¯¯ ±¨±¬∏° usus数据处理系统 ∀甲醇为色谱纯 o水
为双蒸水 ∀
1 q2 色谱条件
„ª¬¯¬¨±·’ • …„÷ ≥…2≤t{柱 kw qy °° ≅ txs
°° ox Λ°l ~流动相梯度变化见表 t ~柱温为室温 ~检
测波长 uvs ±°k皂苷类供试品l及 uyx ±°k黄酮类
供试品l ~灵敏度为 t„ ˜ƒ≥ ∀
表 t 流动相梯度表
时间 r°¬± 甲醇r h 水r h
s ts |s
x ux zx
ts vs zs
us ws ys
vs wx xx
vx ws ys
ws vs zs
xs ts |s
注 }流速均为 t qss °#°¬±p t
1 q3 药材来源
ts种风轮菜属药材样品见表 u ∀
表 u 药材样品植物学分类及鉴定
药材编号 来源 鉴定种类
t 霍山 o安徽 ot||x2sx采集 Χλινοποδιυ µ . χηινενσεt)
u 霍山 ,安徽 ,t||x2sz采集 Χ. χονφινεt)
v 丽江 ,云南省 ,t||y2sz采集 Χ. ρεπενσu)
w 霍山 ,安徽 ,t||x2sx采集 Χ. γραχιλεt)
x 霍山 ,安徽 ,t||x2sx采集 Χ. υρτιχιφολιυ µ t)
y 峨眉山 ,四川省 ,t||x2s|采集 Χ. οµειενσεu)
z 丽江 ,云南省 ,t||y2sz采集 Χ. µεγαλαντηυ µ u)
{ 丽江玉龙山 ,云南省 ,t||y2sz采集 Χ. µεγαλαντηυ µ √¤µqιντερνεδιυ µ αu)
| 丽江玉龙山 ,云南省 ,t||y2sz采集 Χ. µεγαλαντηυ µ √¤µqιντερνεδιυ µ βu)
ts 霍山 ,安徽 ,t||u2sx采集 Χ. πολψχεπηαλυ µ t)
tt 霍山 ,安徽 ,t||x2sx采集 Χ. χηινενσεt)
tu 霍山 ,安徽 ,t||x2sz采集 Χ. χονφινεt)
tv 丽江 ,云南省 ,t||y2sz采集 Χ. ρεπενσu)
tw 霍山 ,安徽 ,t||x2sx采集 Χ. γραχιλεt)
tx 霍山 ,安徽 ,t||x2sx采集 Χ. υρτιχιφολιυ µ t)
ty 峨眉山 ,四川省 ,t||x2s|采集 Χ. οµειενσεu)
tz 丽江 ,云南省 ,t||y2sz采集 Χ. µεγαλαντηυ µ u)
t{ 丽江玉龙山 ,云南省 ,t||y2sz采集 Χ. µεγαλαντηυ µ √¤µqιντερνεδιυ µ αu)
t| 丽江玉龙山 ,云南省 ,t||y2sz采集 Χ. µεγαλαντηυ µ √¤µqιντερνεδιυ µ βu)
us 霍山 ,安徽 ,t||u2sx采集 Χ. πολψχεπηαλυ µ tl
注 }tl安徽中医学院中药系王德群副教授采集 !鉴定 ul中国医学科学院药用植物研究所顾志平副研究员采集 !鉴定
2 实验方法
2 q1 供试品溶液的制备
该属植物的主要成分是皂苷和黄酮 o我们从这
两个方面对生药样品进行处理 o从而分别获得皂苷
类供试品溶液和黄酮类供试品溶液 ∀
皂苷类供试品溶液的制备 }精密称取生药样品
u ªo加 ws °甲醇超声提取半小时 o放置过夜再超
声半小时 o过滤 o滤液浓缩至近干 o走大孔树脂k内径
tx °° o柱高 ts ∗ tu °° o先用乙醇冲洗 us °o后
用蒸馏水继续冲洗至无醇l o先用蒸馏水冲洗 us ∗
ws °至淡黄色 o后用 |x h乙醇洗脱 o收集乙醇液
zx ∗ {s °o浓缩至干 o甲醇定容于 x °量瓶中 o作
为母液 ∀测量时取 s qu °母液 o用甲醇稀释定容
至 u °o待测 ∀
黄酮类供试品溶液的制备 }精密称取生药样品
u ªo加 ws °甲醇超声提取半小时 o放置过夜再超
声半小时 o过滤 o滤液浓缩至近干 o再用甲醇定容至
ts °o作为母液备用 ∀测量时取 s qw °o用甲醇
#vt{#
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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稀释定容至 u °o待测 ∀
2 q2 ‹°≤ 色谱图的制备
在上述色谱条件下 o分别吸取待测样品 ts ˏ
进样 o得色谱图 ∀部分色谱图见图 t ∀
图 t 风轮菜属部分药材 ‹°≤ 图
¤q峨嵋风轮菜皂苷类供试品 ¥q荫风轮皂苷类供试品
¦q峨嵋风轮菜黄酮类供试品 §q荫风轮黄酮类供试品
2 q3 ‹°≤ 方法学研究
2 q3 q1 精密度实验 分别准确吸取峨嵋风轮菜
皂苷类供试品溶液和黄酮类供试品溶液 ts ˏo每
个溶液各连续进样 x次 o记录每个色谱峰的保留时
间及其峰面积积分值 o获得每个色谱峰保留时间的
• ≥⁄为 s qy h ∗ t qs h o其色谱峰峰面积的 • ≥⁄为
s q{ h ∗ t qw h ∀
2 q3 q2 重复性实验 取 x份峨嵋风轮菜药材粉
末 o精密称定 ∀按 2 q1 项下皂苷类供试品溶液的制
备方法制备 x份峨嵋风轮菜的皂苷类供试品溶液 ∀
准确吸取上述供试品 ts ˏ进样 o记录每个色谱峰
的保留时间及其峰面积积分值 o获得每个色谱峰保
留时间的 • ≥⁄为 s qx h ∗ t qx h o其色谱峰峰面积
的 • ≥⁄为 s q{ h ∗ u qs h ∀
另取 x份峨嵋风轮菜药材粉末 o精密称定 ∀按
2 q1 项下黄酮类供试品溶液的制备方法制备 x份峨
嵋风轮菜的黄酮类供试品溶液 ∀准确吸取上述供试
品 ts ˏ进样 o记录每个色谱峰的保留时间及其峰
面积积分值 o获得每个色谱峰保留时间的 • ≥⁄为
s q{ h ∗ u qs h o其色谱峰峰面积的 • ≥⁄为 t qs h ∗
u qu h ∀
2 q3 q3 稳定性实验 取上述精密度实验中的供
试品溶液 o每隔 u «进样 t次 o连续进样 x次 ∀记录
每个色谱峰的保留时间及其峰面积积分值 o获得每
个色谱峰保留时间的 • ≥⁄为 t qs h ∗ u qs h o其色
谱峰峰面积的 • ≥⁄为 t qs h ∗ u qx h ∀
2 q4 数据分析
2 q4 q1 系统聚类分析 把所有样品的色谱峰的保
留时间从小到大排列起来 o并记录其下的色谱峰面
积 o若此保留时间处无色谱峰出现 o则其面积为 s o
这样就得到了 ts个风轮菜属药材品种其 us个样品
的色谱峰面积表 o并以此进行系统聚类分析 ∀经过
≥°≥≥统计软件的分析 o得到如下树状聚类图谱k图
ul ∀
从图 u中可以清晰地看到样品分类结果相当
好 o同种生药聚类距离很短 o而不同种生药之间聚类
的距离较长 o从标尺 us处截下可将该 ts种生药分
成 w类 }风轮菜 !细风轮菜 !峨嵋风轮菜与邻近风轮
菜为 t类 o荫风轮单独为 t类 o风车草与寸金草居间
变种 ¥为 t类 o寸金草与寸金草居间变种 ¤为 t类 ~
前二者在标尺 ut处又合为 t类 o后二者在标尺 uv
处也合为 t类 o该分类情况与植物学分类情况相吻
合 ∀
2 q4 q2 ƒ¬¶«¨µ线性判别函数 每个样品取 x个样
本 o总样本量为 tss ∀在正确分类的前提下 o利用
ƒ¬¶«¨µ判别法建立了各类的判别函数 o即 ƒ¬¶«¨µ线
#wt{#
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图 u 风轮菜属药材系统聚类分析树状图谱
样品编号见表 u
性判别函数 o各个生药的分类函数如下 }
风轮菜 }Ψ € p v{x .|{| p t .|{x ≅ ts p w Ξu n x .vyv ≅
ts p v Ξz ;
邻近风轮菜 : Ψ € p v |yv {vy n t .tt| ≅ ts p w Ξx n
u| .|t{ Ξy p t .z|u ≅ ts p w Ξ{ p t .y Ξuv ;
匍匐风轮菜 : Ψ € p tsz |ww .{ n t .{yy ≅ ts p v Ξv n
u .stz ≅ ts p y Ξx n s .xvz Ξy p v .uu{ ≅ ts p y Ξ{ n s .tzu Ξut p
u .{{v ≅ ts p u Ξuv ;
细风轮菜 : Ψ € p t {|z t{| n tu .y|| Ξty ;
风车草 : Ψ € p vx t{x xss n x .wzx Ξu n uv .wt{ Ξw ;
峨嵋风轮菜 : Ψ € p { x|y .{sy p { .uwy ≅ tsp | Ξv p
{ .usz ≅ ts p { Ξx p u .vzx ≅ ts p y Ξy n x .{xz ≅ ts p y Ξ{ n
t .uzw ≅ ts p z Ξuv ;
寸金草 : Ψ € p { vsv .{sy n w .yt| ≅ ts p v Ξv n t .t{w ≅
ts p w Ξx n t .vvs Ξy p t .{|x ≅ ts p w Ξ{ p z .tvy ≅ ts p u Ξuv ;
寸金草居间变种 α : Ψ € p u .ut ≅ ts p { n tv .ztt Ξu n
x{ .yxt Ξw n x .wzu ≅ ts p u Ξz ;
寸金草居间变种 β : Ψ € p utwv .xt n u .xtu ≅ ts p x Ξv n
u .x ≅ ts p w Ξx n z .uvy ≅ ts p v Ξy p w .ssu ≅ ts p w Ξ{ p
v .{{u ≅ ts p w Ξuv ;
荫风轮 : Ψ € p yyt vsv .y p t .vyu ≅ ts p u Ξv p t .wzu ≅
ts p x Ξx p v .|uv Ξy n u .vxy ≅ ts p x Ξ{ n t .{ys Ξuv ;
判别函数用于将观测值分类 o即将新例观测值
代入上述判别函数 o哪个判别函数值最大 o就判为哪
一类k表 vl ∀
Ξu p Ξy分别为皂苷类样品在z qt o{ qv o| qu o
| qy ots qs ots qy及 u{ qs °¬±处色谱峰面积 ~Ξut与
Ξuv为黄酮类样品在 z qu和 { q{ °¬±处色谱峰面积 ∀
由表 v可见 o错判样品数为 s o错判样品数的百
分数为 s qss h o判对样品百分数为 tss h ∀
3 讨论
对于同一批样品 o用不同的系统聚类方法进行
表 v 各组原始样品的 ƒ¬¶«¨µ判别结果
样品编号 原类别 判别归类 样品编号 原类别 判别归类
t 风轮菜 风轮菜 tt 风轮菜 风轮菜
u 邻近风轮菜 邻近风轮菜 tu 邻近风轮菜 邻近风轮菜
v 匍匐风轮菜 匍匐风轮菜 tv 匍匐风轮菜 匍匐风轮菜
w 细风轮菜 细风轮菜 tw 细风轮菜 细风轮菜
x 风车草 风车草 tx 风车草 风车草
y 峨嵋风轮菜 峨嵋风轮菜 ty 峨嵋风轮菜 峨嵋风轮菜
z 寸金草 寸金草 tz 寸金草 寸金草
{ 寸金草居间变种 ¤ 寸金草居间变种 ¤ t{ 寸金草居间变种 ¤ 寸金草居间变种 ¤
| 寸金草居间变种 ¥ 寸金草居间变种 ¥ t| 寸金草居间变种 ¥ 寸金草居间变种 ¥
ts 荫风轮 荫风轮 us 荫风轮 荫风轮
聚类 o所得到的结果是不同的 ∀看一个聚类方法是
否可取 o主要取决于这种方法所得的结果是否正确 ∀
本文尝试用原始数据直接进行分类 o分类效果不好 o
先将原始数据进行标准化变换后再进行聚类 o效果
要好得多 ∀通过对数据的变换 o消除了变量变化幅
度的影响 o使变化范围较小的变量与变化范围较大
的变量成为同等重要 o但这种现象有时未必合理 ∀
在样本的相似性量度计算方法的选择上 o本文
没有采用常用的欧氏距离或绝对值距离 o这两种方
法的聚类结果都不理想 o而采用夹角余弦法 o分类结
果较好 ∀
由于样本量的限制 o文中建立的 ƒ¬¶«¨µ判别函
数会存在一定的/病态0 o但其可根据色谱峰面积直
接进行判别 o非常简明方便 ∀
#xt{#
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综上所述 o本文利用高效液相色谱获得植物的
内在成分信息 o同时借助数学和计算机技术 o利用多
学科手段 o探讨风轮菜属药材的分类及鉴定问题 o从
结果来看基本可行 ∀从另一角度看 o本方法较为客
观地克服了认为的主观因素 ∀因此 o本方法作为一
种辅助手段用于风轮菜属药材的分类及鉴定是可行
的 ∀
≈参考文献 
≈t  中国科学院中国植物志编辑委员会 q中国植物志kyy 卷l q北
京 }科学出版社 ot|zz quuu q
≈u  戴金瑞 q研究生毕业论文摘要汇编 q上海 }上海医科大学出版
社 ot|{v qys q
≈v  张福良 q聚类分析与中药质量研究 q北京 }人民卫生出版社 o
t||w qts q
Αππλιχατιον οφ Ηιεραρχηιχαλ Χλυστερ ωιτη Ηιγη2Περφορµ ανχε Λιθυιδ
Χηροµ ατογραπηψιν τηε Χλασσιφιχατιον οφ Γενυσ Χλινοποδιυµ χηινενσισ
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·«¨ ° ·¨«²§¬¶¤¦¦¨³·¤¥¯¨o¶¬°³¯¨oµ¤³¬§o¬±¨ ¬³¨ ±¶¬√¨¤±§µ¨³¨ ¤·¤¥¯¨q
[ Κεψ ωορδσ] ª¨ ±∏¶ Χλινοποδιυ µ χηινενσισ~‹¬¨µ¤µ¦«¬¦¤¯ ¦¯∏¶·¨µ~ƒ¬¶«¨µ©∏±¦·¬²±~¦¯¤¶¶¬©¬¦¤·¬²± ²© ° §¨¬¦¬±¤¯ ³¯¤±·¶
≈责任编辑 袁桂京 
5新编中药志6第 w卷简介
5新编中药志6是著名中药学专家 !中国工程院院士肖培根研究员主编 o化学工业出版社出版的一部全面介绍我国中药资
源与现代研究的大型工具书 ∀全书共 w卷 o其内容丰富 !翔实 o保持了与 usss年版5中华人民共和国药典6一部的一致性 o可以
作为是药典的注释 ∀本书第 t ∗ v卷全部为植物药 o已于 ussu年初面世并受到广大中医药界专家的高度评价 o现在第 w卷也
出版了 ∀ 5新编中药志6第 w卷内容分为两部分 o第一部分 收载常用动物与矿物药 zs余种 o第二部分为全书总索引 ∀第一部
分 o收载的常用动物与矿物药涵盖了5药典6一部中的全部动 !矿物药 ∀对每个中药品种 o均就其历史 !原动k矿l物 !采制 !药材
及产销 !化学成分 !药材鉴定 !性味及功效 !药理作用及临床应用 o以及地方代用品 !伪品等情况作了全面介绍 o并附了参考文
献 ∀同时为适应中药质量评价和现代化 !国际化的需要 o加强了化学成分与中药成分的定性鉴定 o中药特征性成分或有效成
分的定量分析等方面的内容 ~对一些重要的常用中药 o还加强了药材的宏观与微观鉴别的内容 ~文献追踪至 usst年 o个别到
ussu年上半年 ∀第二部分 o包含全书总索引 z种 }中药功能索引 !药理作用索引 !化学成分中文名索引 !化学成分英文名索引 !
药材与原植k动l物拉丁学名索引 !药材与原植k动 !矿l物名称汉语拼音索引 !药材与原植k动 !矿l物名称中文笔画索引 ∀这些
索引是根据不同读者的多种需求而编制 o可满足在中药现代化研究 !新药研发 !药品检验管理 !药材经销等各种部门工作的专
业人员使用 ∀本卷正文前还附有本卷所收载药材 !原动物与原矿物的彩色插图 |u幅 ∀
#yt{#
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