全 文 ：ｔｈｅｔｈｒｅｅｓｐｅｃｉｅｓｏｆｃｅｒｔｉｆｉｅｄｒｈｕｂａｒｂＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｉｔｄｉｓｃｌｏｓｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｔａｂｌｅｄｉｆｅｒｅｎｃｅｏｆｐｕｒｇａｔｉｖｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓａ
ｍｏｎｇｔｈｒｅｅｓｐｉｅｃｅｓｏｆｃｅｒｔｉｆｉｅｄＲｈｕｂａｒｂ，ｗｈｉｃｈｐｒｏｂａｂｌｙｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｔｈｅｕｌｔｉｍａｔｅｄｉｆｅｒｅｎｃｅｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ
Ｃｈｉｎｅｓｅｐａｔｅｎｔｍｅｄｉｃｉｎｅｓ
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　ｒｈｕｂａｒｂ；ｓｐｅｃｉｅｓ；ｐｕｒｇａｔｉｖｅａｃｔｉｖｉｔｙ；Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ；ｐｏｔｅｎｃｙ
［责任编辑　古云侠］
［收稿日期］　２００６０３２５
［基金项目］　四川省科技厅应用基础项目（０１ＳＧ００３２１４）
［通讯作者］　  杨志荣，Ｔｅｌ：（０２８）８５４１０３６２，Ｅｍａｉｌ：ｐａｎ
ｍｉｎｇ１０６＠１６３．ｃｏｍ
塞隆骨提取物对成骨样细胞增殖及凋亡作用的研究
潘　明１，２，石　珏１，３，罗　霞１，３，侯若彤１，余梦瑶１，３，杨志荣１
（１．四川大学 生命科学学院，四川 成都 ６１００４１；
２．四川理工学院，四川 自贡 ６４３０００；
３．四川省中药研究所 中药细胞与分子生物学实验室，四川 成都 ６１００４１）
［摘要］　目的：研究塞隆骨提取物对体外培养成骨样细胞代谢功能的调节作用及对其凋亡的影响。方法：采
用超临界萃取法制备塞隆骨的脂、醇、水提物、水煎提取液及骨胶提取物，以大鼠成骨样细胞ＲＯＳ１７／２８为细胞模
型，添加塞隆骨各提取物至大鼠成骨细胞培养体系中，ＭＴＴ法测定成骨样细胞的增殖情况，以流式细胞术检测成骨
样细胞凋亡比例。结果：１×１０－２ｇ·ｍＬ－１塞隆骨脂和水提物对大鼠成骨样细胞 ＲＯＳ１７／２８有显著的促进增殖作
用（Ｐ＜００１）；与空白组相比，各塞隆骨提取物使成骨细胞的亚二倍体峰比例明显减少，琼脂糖凝胶电泳结果表明
这些提取物能够降低成骨样细胞的凋亡率，推迟凋亡的发生。结论：塞隆骨通过促进成骨样细胞的增殖，降低成骨
样细胞的凋亡率和推迟其凋亡的发生，来发挥健骨的作用。
［关键词］　塞隆骨提取物；成骨样细胞；增殖；凋亡
［中图分类号］Ｒ２８５．５　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１５３０２（２００６）２３１９９１０４
　　塞隆骨为高原鼢鼠的干燥全骨架，研究发现其
部分药理学作用与传统名贵中药材虎骨类似［１］，
但其在治疗骨质疏松的机制尚不明确［２］。本实验
通过研究塞隆骨不同提取物对成骨样细胞增殖和凋
亡的影响来探索其在促进骨形成、健骨方面的作用
机制。
１　材料
１．１　药材及细胞
高原鼢鼠Ｍｙｏｓｐａｌａｘｂａｉｌｅｙｉ，２００３年５～６月采自
四川省阿坝州若尔盖县；大鼠成骨样细胞 ＲＯＳ１７／
２８，由本校医学院病原生物学教研室提供。
１．２　药物制备方法
１．２．１　塞隆骨各提取物的制备
１．２．１．１　超临界萃取塞隆骨脂溶性成分提取　使
用ＭＦ－３７Ｋ－３８０型超临界萃取仪分２次提取，每
次装粉碎骨粉约２００ｇ，在压力２０ＭＰａ，温度４０℃，
ＣＯ２流量２０Ｌ·ｈ
－１条件下连续提取４ｈ，获骨粉脂
溶性成分。
１．２．１．２　醇溶部分的提取　萃取脂溶性成分后，残
渣用７５％的乙醇在沸水浴上回流提取，每次回流２
ｈ，待提取液冷却后抽滤分离清液，重复３次；合并３
次的提取液，用减压蒸馏装置回收乙醇，获骨粉醇溶
部分。
１．２．１．３　水溶性成分的提取　乙醇提取残渣用蒸
馏水在沸水浴上回流提取，每次２ｈ，待提取液冷却
后过滤，减压蒸去水分，获骨粉水溶性成分。
１．２．１．４　塞隆骨水煎液的提取　粉碎的骨粉，混合
取样，直接用蒸馏水在沸水浴上回流提取，每次２ｈ，
重复３次，合并３次的提取液，减压浓缩，获骨粉水
煎液部分。
１．２．１．５　骨胶提取物提取　骨粉称取２００ｍｇ，加
入Ｔｒｉｓ甘氨酸缓冲液 （ｐＨ８３），４ｍＬ，置６０℃
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水浴中提取６ｈ，过滤，滤渣用２ｍＬ上述缓冲液洗
涤，合并滤液，离心，上清液置透析袋中，以蒸馏
水为背景透析脱盐，透析液置蒸发皿中于６０℃恒
温水浴上加热蒸干，刮下提取物，干燥后即为骨胶
提取物。
２　方法
２．１　大鼠成骨样细胞的培养
实验方法参照文献［３］。试剂：ＤＭＥＭ培养基
（ＧＩＢＣＯ），胎牛血清，胰蛋白酶（ＧＩＢＣＯ）；碱性磷酸
酶试剂盒（Ｒｏｃｈｅ，ＵＳＡ）；３（４，５二甲基噻唑２）２，
５二苯基四唑氢溴酸盐（ＭＴＴ）购自 Ｓｉｇｍａ公司；
ＭＥＭ培养基购自 Ｇｉｂｃｏ公司；基因组 ＤＮＡ纯化试
剂盒；１０％胎牛血清（ＨｙＣｌｏｎｅ公司）；０８３％Ｔｒｉｓ
ＮＨ４Ｃｌ，１０％小牛血清（ＨｙＣｌｏｎｅ公司）；ＤＬ２０００（上
海生工）。
２．２　分组
将培养细胞分为脂提液试验组；醇提液试验组；
水提液试验组；水煎液试验组；空白对照组。
２．３　细胞增殖测定（ＭＴＴ法）
实验方法参照文献［４］。结果采用ｔ检验。
２．４　细胞凋亡检测
琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞：２％的琼脂糖凝
胶封槽，加入足量的电泳缓冲液。ＮＡ样品与溴酚
蓝充分混合后用加样。以 ＤＬ２０００作为 ＤＮＡ标记
物。电压８０Ｖ，电泳 １ｈ。将凝胶置于溴化乙啶
（ＥＢ）中染色１０ｍｉｎ，用清水漂洗后，在紫外灯下观
察结果。
流式细胞仪检测凋亡比例：将培养的成骨样细
胞用胰蛋白酶消化，镜下计数，制成单细胞悬液。调
整细胞含量为１×１０６个／ｍＬ，用流式细胞仪在４８８
ｎｍ测定吸光度（Ａ），以Ｅｌｉｔｅ软件分析（ｔ检验）细胞
凋亡率。
３　结果
３．１　塞隆骨提取液对成骨样细胞增殖的影响
３．１．１　塞隆骨脂、醇、水提物及水煎液对大鼠成骨
样细胞ＲＯＳ１７／２８增殖结果，见表１。
从表１可以看出，与对照组比，在培养２ｄ时，
塞隆骨脂提液对大鼠成骨样细胞 ＲＯＳ１７／２８有极
显著的增殖作用；塞隆骨水煎液对大鼠成骨样细胞
ＲＯＳ１７／２８有显著的增殖作用。在培养４ｄ时，所
有组别的 Ａ与同组别２ｄ时相比均有增加，但与空
白对照组比较，均无显著性差异。
表１　塞隆骨不同提取物对成骨样细胞的增殖作用
组别
剂量
／ｇ·ｍＬ－１
Ａ
２ｄ ４ｄ
空白对照 － ０２８±００３ ０７４±００６
脂提液 １×１０－２ ０３５±００２２） ０１４±００２
醇提液 １×１０－２ ００９±００１ ０６６±００４
水煎液 １×１０－２ ０３１±００２１） ０６６±００５
水提液 １×１０－２ ０２９±００２ ０５７±００５
　　注：与空白对照组比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１（表２～４同）
３．１．２　不同剂量塞隆骨脂、水煎液、骨胶提取物及
地塞米松对大鼠成骨样细胞 ＲＯＳ１７／２８增殖的结
果，见表２～４。
表２　不同剂量塞隆骨脂提取物对成骨样细胞的增殖作用
组别
剂量
／ｇ·ｍＬ－１
Ａ
１ｄ ３ｄ ５ｄ
空白对照 　 － ０３６±００３ ０４５±００２ ０３５±００２
地塞米松 １×１０－８ ０３９±００４ ０４９±００５ ０２８±００２
脂提取物 １×１０－１ ０３４±００４ ０５１±００８ ０３８±００３
　 １×１０－２ ０３６±００６ ０７７±００７１） ０４５±００５
　 １×１０－３ ０４１±００２ ０５８±００６ ０３３±００２
１ ０４１±００３ ０５８±００４ ０３８±００３
　　表２显示，在培养１ｄ时，塞隆骨脂提取物各浓
度组及地塞米松组与空白组比较，增殖作用不明显；
在培养３ｄ时，与空白对照组相比，塞隆骨脂提取物
１×１０－２ｇ·ｍＬ－１组有明显的增殖作用，差异有显著
性意义，增殖效果优于地塞米松组；地塞米松组与空
白对照组相比，增殖作用不明显；在培养５ｄ时，各
实验组对成骨样细胞的增殖作用均有下降。
表３　不同剂量塞隆骨水煎液提取物
对成骨样细胞的增殖作用
组别
剂量
／ｇ·ｍＬ－１
Ａ
１ｄ ３ｄ ５ｄ
空白对照 － ０３６±００３ ０４５±００２ ０３５±００２
地塞米松 １×１０－８ ０３９±００４ ０４９±００５ ０２８±００２
水煎液 １×１０－１ ０４１±００４ ０５６±００３ ０３４±００３
　 １×１０－２ ０４２±００６ ０７０±００６１） ０４９±００５
　 １×１０－３ ０４３±００５ ０５４±００５ ０４４±００４
　 １×１０－４ ０１８±００２ ０５３±００５ ０３９±００３
　　表３显示，在培养１ｄ时，塞隆骨水煎液各浓度
组及地塞米松组与空白组比较，增殖作用不明显；在
培养３ｄ时，与空白对照组相比，塞隆骨水煎液１×
１０－２ｇ·ｍＬ－１组有明显的增殖作用；地塞米松组增
殖作用不明显；在培养５ｄ时，各实验组对成骨样细
胞的增殖作用均有下降。
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表４　不同剂量塞隆骨骨胶提取物
对成骨样细胞的增殖作用
组别
剂量
／ｇ·ｍＬ－１
Ａ
１ｄ ３ｄ ５ｄ
空白对照 　 － ０３６±００３ ０４５±００２ ０３５±００２
地塞米松 １×１０－８ ０３９±００４ ０４９±００５ ０２８±００２
骨胶　　 １×１０－１ ０４９±００２１）０５４±００４ ０２０±００３
　 １×１０－２ ０５３±００３１）０４８±００６ ０３２±００２
　 １×１０－３ ０４４±００２ ０４９±００５ ０３２±００２
　 １ ０４５±００６ ０１４±００３ ０１８±００３
　　表４显示，在培养１ｄ时，塞隆骨骨胶各浓度组
及地塞米松组与空白组比较，增殖作用较明显，塞隆
骨骨胶１×１０－１，１×１０－２ｇ·ｍＬ－１组有明显的增殖
作用，差异呈显著性意义；在培养３ｄ时，与空白对
照组相比，地塞米松组增殖作用不明显；在培养５ｄ
时，各实验组对成骨样细胞的增殖作用均有下降。
从表２，３，４得出，塞隆骨脂提取物１×１０－２ｇ·
ｍＬ－１组、塞隆骨水煎液１×１０－２ｇ·ｍＬ－１组、塞隆骨
骨胶１×１０－１，１×１０－２ｇ·ｍＬ－１组对成骨样细胞的
增殖具有显著的促进作用，与空白对照组比较，差异
呈显著性意义，与地塞米松组比较，增殖作用较强。
３２　塞隆骨提取液对成骨样细胞凋亡的影响
３．２．１　细胞凋亡　ＤＮＡ凝胶电泳结果见图１。
图１　塞隆骨不同提取物对成骨细胞凋亡的影响
１．脂提取物 １×１０－２ｇ·ｍＬ－１；２．水煎提取物 １×１０－２ｇ·
ｍＬ－１；３．骨胶提取物１×１０－１ｇ·ｍＬ－１；４．骨胶提取物１×１０－２
ｇ·ｍＬ－１；５．地塞米松１×１０－８ｇ·ｍＬ－１；６．空白对照组；Ｍ．
ＤＬ２０００
图１显示，成骨细胞培养４ｄ后，空白对照组出
现大小约为１８０～２００ｂｐ整数倍的 ＤＮＡ梯形断裂
条带（Ｌａｎｅ６）；而塞隆骨凋亡率（脂 １×１０－２ｇ·
ｍＬ－１、水煎 １×１０－２ｇ·ｍＬ－１、骨胶 １×１０－１ｇ·
ｍＬ－１）作用于成骨样细胞后，ＤＮＡ部分降解，骨胶
１×１０－２ｇ·ｍＬ－１作用于成骨样细胞后和地塞米松
１×１０－８ｇ·ｍＬ－１组作用于成骨样细胞后，均没有观
察到ＤＮＡ降解。
３．２．２　细胞凋亡率　流式细胞仪检测细胞凋亡比
例，见表５。
表５　不同塞隆骨提取物对成骨细胞凋亡率的影响
组别 剂量／ｇ·ｍＬ－１ 凋亡率／％
脂提取物　 １×１０－２ ２４６１±０４８１）
水煎提取物 １×１０－２ ２５３７±０５３１）
骨胶提取物 １×１０－１ ３４０１±０６４１）
骨胶提取物 １×１０－２ １７０９±０２６２）
地塞米松　 １×１０－８ １５９６±０１４２）
空白对照　 　 － ４８０３±０８５
　　注：与对照组比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１
　　由表５可以看出，细胞培养４ｄ后，在细胞内源
性雌激素被耗尽，缺乏外源性雌激素的情况下，空白
组结果出现明显的亚二倍体峰（所占比例为
４８９％）；而培养液中加入脂１×１０－２ｇ·ｍＬ－１、水
煎１×１０－２ｇ·ｍＬ－１、骨胶 １×１０－１ｇ·ｍＬ－１，１×
１０－２ｇ·ｍＬ－１、地塞米松１×１０－８ｇ·ｍＬ－１对细胞处
理５ｄ，亚二倍体细胞所占比例显著降低，与空白组
相比较，地塞米松 １×１０－８ｇ·ｍＬ－１组和骨胶 １×
１０－２ｇ·ｍＬ－１组差异呈极显著性意义，脂１×１０－２ｇ
·ｍＬ－１、水煎１×１０－２ｇ·ｍＬ－１、骨胶１×１０－１ｇ·
ｍＬ－１差异呈显著性意义。
４　讨论
塞隆骨性微温、味辛咸，入肝肾经，主要功能为
祛风除湿散寒、舒筋活络、强筋健骨及增强机体抵抗
力，部分药理学作用与传统名贵中药材虎骨（已禁
用）类似。
本实验研究了塞隆骨提取物对体外大鼠成骨样
细胞ＲＯＳ１７／２８增殖的影响。一定浓度的塞隆骨
水提液和塞隆骨脂提液对大鼠成骨样细胞ＲＯＳ１７／
２８有增殖作用；塞隆骨脂提取物和水煎液各浓度
组增殖作用不明显，但在培养３ｄ时，一定浓度的塞
隆骨脂提取物和水煎液有明显的增殖作用。塞隆骨
骨胶各浓度组对大鼠成骨样细胞 ＲＯＳ１７／２８有显
著增殖作用，其中高浓度的塞隆骨骨胶的增殖作用
更为明显；而醇提液对成骨样细胞有明显的抑制作
用。说明其药效成分可能是脂溶物和溶于水的某些
成分。
ＤＮＡ电泳图谱显示，塞隆骨提取物能促进细胞
增殖并抑制细胞凋亡。成骨细胞培养４ｄ后，塞隆
骨提取物，包括脂提、水煎液、骨胶，作用于成骨样细
胞后，ＤＮＡ只有部分降解，而一定浓度塞隆骨胶作
用于成骨样细胞后，几乎没有观察到 ＤＮＡ降解；当
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细胞培养４ｄ后，在细胞内源性雌激素被耗尽，缺乏
外源性雌激素的情况下，培养液中加入一定浓度的
脂、水煎、骨胶、地塞米松对细胞处理５ｄ，亚二倍体
细胞所占比例显著降低，差异呈显著性意义。在实
验中得出的地塞米松组不能诱导大鼠成骨细胞
ＲＯＳ１７／２８凋亡与文献报道相一致［３］。
本实验在细胞水平上进行了塞隆骨作用机制的
探讨，也从细胞水平上为塞隆骨健骨和作为虎骨部
分作用替代品提供了理论依据。
［参考文献］
［１］　夏远军，沈　霖．补肾法治疗骨质疏松的分子机制［Ｊ］．中国中
医骨伤科杂志，２００４，１２（４）：５３．
［２］　海　平．塞隆骨对大鼠骨质疏松症治疗作用的研究［Ｊ］．山东
中医杂志，２００２，２１（４）：２３１．
［３］　涂平生，徐　杰．补肾方剂对成骨细胞作用的研究进展［Ｊ］．解
剖学研究，２００４，２６（２）：１５２．
［４］　ＭｏｓｍａｎｎＴ．Ｒａｐｉｄｃｏｌｏｒｉｍｅｔｉｃａｓｓａｙｆｏｒｃｅｌｕａｒｇｒｏｗｔｈａｎｄｓｕｒｖｉｖ
ａｌ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙａｓｓａｙ［Ｊ］．ＪＩｍｍｕ
ｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ，１９８３，６５：５５．
ＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＳａｉｌｏｎｇｂｏｎｅｅｘｔｒａｃｔｓｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄ
ａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｃｅｌｓ
ＰＡＮＭｉｎｇ１，２，ＳＨＩＪｕｅ１，３，ＬＵＯＸｉａ１，３，ＨＯＵＲｕｏｔｏｎｇ１，ＹＵＭｅｎｇｙａｏ１，３，ＹＡＮＧＺｈｉｒｏｎｇ１
（１．ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＳｃｈｏｏｌ，ＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００６４，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｉｇｏｎｇ６４３０００，Ｃｈｉｎａ；
３．ＣｅｌｕａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＬａｂｏｆＳｉｃｈｕａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００４１，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＳａｉｌｏｎｇｂｏｎｅｅｘｔｒａｃｔｓｏｎｒａｔｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｃｅｌｓｉｎ
ｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｓａｉｌｏｎｇｂｏｎｅｆａｔｓｏｌｕｂｌｅｅｘｔｒａｃｔ，ＳａｉｌｏｎｇｂｏｎｅｅｔｈａｎｏｌｅｘｔｒａｃｔａｎｄＳａｉｌｏｎｇｂｏｎｅａｑｕｅｏｕｓｅｘｔｒａｃｔｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｗｉｔｈｓｕ
ｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＳＣＦＥ），ａｎｄＳａｉｌｏｎｇｂｏｎｅｂｏｉｌｉｎｇｗａｔｅｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｗｉｔｈｄｉｓｔｉｌｅｄｗａｔｅｒｄｉｒｅｃｔｌｙ．ＭＴＴａｓｓａｙ
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Ｖｏｌ３１，Ｉｓｓｕｅ　２３
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２００６