全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第6期2005年6月·881·
发现SQDS是P13一K的抑制剂。这和其他证据[6~8]
均表明，SQDS具有生物学活性。SQDS抑制P13一K
的活性，因此抑制了P13一K介导的信号转导通路而
发挥作用。SQDS既具有槲皮素的作用，又增加其水
溶性，达到结构改造的目的。
本实验进一步阐明了SQDS的作用机制，这为
今后将SQDS应用于临床提供了一定的实验依据。
本实验结果还提示重组人P13一KpllO口催化亚基可
作为一种较为简便地筛选和开发有效的P13一K抑
制剂的分子靶点。
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塞隆骨提取物对体外大鼠成骨样细胞ROSl7／2．8的影响
潘 明1‘2，谭言飞3，杨志荣p
(1．四川i大学生命科学学院，四川成都610064；2．四川理工学院生物工程系，四川自贡643000；
3．四川大学生物材料工程研究中心，四川成都 610064)
摘 要：目的 研究塞隆骨提取物对体外培养大鼠成骨样细胞ROSl7／2．8代谢功能的调节作用，从而在细胞水平
上阐述塞隆骨防治骨质疏松的作用机制及药效成分的筛选。方法 采用超临界萃取法制备塞隆骨的脂、醇、水提液
及水煎提取液，用MTT法测定塞隆骨脂、醇、水提液及水煎液对成骨样细胞的增殖作用；测定碱性磷酸酶(ALP)
活性，观察上述提取液对细胞分化的影响。结果 10mg／mL塞隆骨脂提液和水提液对大鼠成骨样细胞ROSl7／
2．8有显著的增殖作用(P
关键词：塞隆骨；成骨样细胞；增殖；分化
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)06—0881—04
EffectofSailongboneextractsonratosteoblastoidcellsROS17／2．8invitro
PANMin91”，TANYan—fei3，YANGZhi—ron91
(1．CollegeofLifeSciences，SichuanUniversity，Chengdu610064，China；2．DepartmentofBioengineering，
SichuanInstituteofTechnology，Zigong643000，China；3．EngineeringResearchCenter
inBiomaterials，SichuanUniversity，Chengdu610064，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatethemodulationofSailongboneextractsonratosteoblastoidcells
ROSl7／2．8invitros astoclarifythemechanismofosteoporosispreventionandactivecomponentscreen—
ingofSalongbone．MethodsSailongbonefat～solubleextract，SailongboneethanolextractndSailong
收稿日期：2004—12-24
基金项目：四川省科技厅科技攻关项目(01SG003—14)
作者简介：潘明(1966一)，女，副教授，在读博士，硕士生导师，研究方向为天然产物开发及药理药效的分子机制研究。
Tel：(028)85410362E—mail：panmingl06@163．corn
*通讯作者杨志荣
万方数据
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boneaqueousextractwereextractedwithsuperc iticalfluidextraction(SCFE)，andailongboneboiling—
watercomponentwasextractedwithdistilledwaterdirectly．MTTassaywasappliedtOdeterminethepro一
1iferationofthecellpromotedbyfourSailongboneextractsatdifferentdoses．Differentiatingeffectsofthe
extractswithdifferentco centrationson hecellwereevaluatedbythexaminationsofalkaliphosphate
(ALP)activity．ResultsSailongbonefat—solubleandaqueousextract(each10mg／mL)couldsignificant一
1YimprovethproliferationofratosteoblastoidcellsROSl7／2．8(P<0．01)．Sailongbonefat—solubleex
tract(10mg／mL)significantlyenhancedALPactivity(P<0．01)．Fat—solubleextract(1．0，0．1mg／mL)
couldimprovethALPactivitiy(P
aresomecomponentspromotingheproliferationandifferentiationofosteoblast，andSailongbonecanbe
thesubstituteofthboneoftigerasaC：hinesemateriamedica．
Keywords：Sailongbone；osteoblastoidcells；proliferation；differentiation
高原鼢鼠，藏名塞隆，是青藏高原特有动物，其
风干全骨——塞隆骨是国家一类动物新药材。塞隆
骨性微温、味辛成，入肝肾经，主要功能为祛风除湿
散寒、舒筋活络、强筋健骨及增强机体抵抗力，有机
化学、无机元素和药理学作用与传统名贵中药材虎
骨(已禁用)类似[1矗]。虎骨入药已有上千年历史，在
治疗骨代谢疾病中应用相当广泛，因此对塞隆骨进
行骨代谢疾病的药理作用的探讨及有效成分的筛
选，以塞隆骨代替虎骨入药，使因禁止使用虎骨而停
止的传统中成药生产得以恢复，挽回国家经济损失
是很有价值和意义的。
骨质疏松症是以骨量减少、骨的微观结构退化
为特征的，致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的
一种全身性骨骼疾病[3]。随着人口日趋老龄化，骨质
疏松已列为三大老年人疾病之一，严重威胁我国老
年人健康。研究报道塞隆骨对骨质疏松大鼠的骨密
度、骨灰分、骨钙水平以及骨组织形态学均有明显的
改善作用[4]，但其作用机制尚不明了。成骨细胞是骨
组织中的重要细胞，其增殖与分化是骨形成、发育、
修复的关键[5]。本实验以大鼠成骨样细胞RoSl7／
2．8为细胞膜型，通过MTT法和碱性磷酸酶
(ALP)活性检测分析塞隆骨不同的提取组分对大
鼠成骨细胞代谢功能的影响，为研究塞隆骨能否取
代虎骨防治骨质疏松提供实验依据。
1材料
1．1药材制备：供本试验用的高原鼢鼠，于2003年
5～6月采自四川省阿坝洲若尔盖县。样本为成鼠，
随机取样。将选择的样鼠剥皮剔肉，取其骨骼，风干。
用去离子水冲洗干净，在60℃恒温箱中烘干，经粉
碎过30～60目筛制成骨粉，备用。
1．2细胞：大鼠成骨样细胞ROSl7／2．8，由四川I大
学医学院病原生物学教研室提供。
1．3 主要试剂：DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、
胰蛋白酶(Gibco)，5mg／mLMTT液(Sigma)，
ALP试剂盒(Roche，美国)。
2 方法
2．1塞隆骨各提取物的制备
2．1．1脂溶物提取：用MF一37K一380型超临界
萃取仪(德阳二重四创科技有限公司)分2次提取，
每次装200g粉碎骨粉于提取桶中，在压力35～40
MPa、温度40。C、CO。流量20L／h条件下连续提取
4h，得率2．5％，获骨粉脂溶部分。
2．1．2醇溶物提取：超临界萃取后的残渣用75％
乙醇在沸水浴上回流提取，每次回流2h，待提取液
冷却后抽滤，分离清液，重复3次；合并提取液，减压
蒸馏回收乙醇，浓缩至含生药1g／mL，得率
1．64％，获骨粉醇溶液。
2．t．3水溶物提取：75％乙醇提取残渣用蒸馏水
在沸水浴上回流提取，每次2h，待提取液冷却后用
纱布滤过其渣质，重复3次，合并3次的提取液，减
压蒸去水分，浓缩至含生药1g／mL，得率为
1．42％，获骨粉水溶性成分。
2．1．4水煎液提取：塞隆骨制备好的骨粉直接用蒸
馏水提取，每次2h，重复3次，合并3次的提取液，
减压浓缩至含生药1g／mL，得率为2．75％，获骨粉
水煎部分。
2，2大鼠成骨样细胞ROSl7／2．8的培养：大鼠成
骨样细胞ROSl7／2．8于含10％FBS的DMEM培
养基中，37cC、5％CO。恒温培养箱内培养。在培养
瓶中长满至单层后，用0．1％EDTA、0．25％oo胰酶
消化传代。传代培养的细胞在实验前一天换液，实验
时用0．1％EDTA、0．25％胰酶消化1～2min，加
10％FBS的DMEM细胞培养液将细胞浓度调为
1．0×104／mL，以每孔200肚L加入96孔细胞培养
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第6期2005年6月·883·
板中。培养24h后，弃去原培养液，换成无血清
DMEM培养液，培养24h。
2．3实验分组：脂提液试验组；醇提液试验组；水提
液试验组；水煎液试验组；正常对照组。
2．4细胞增殖测定：用MTT法[61检测成骨样细胞
增殖情况，确定所需药物作用于成骨样细胞的适合
浓度。弃掉96孔板中的培养液，加入180弘L培养
基和20pL各组药物，每个浓度组复孑L为6个。培
养24、72h后，弃掉孔内液体，各孑L细胞用0．01
mol／LpH7．4的PBS洗涤2次，加入200弘L无血
清DMEM培养液和20pLMTT液，37℃孵育4
h；移去MTT溶液，每孔加入200pL二甲基亚砜
(DMSO)，微量振荡仪振荡3min，待沉淀完全溶解
后，用酶联免疫检测仪(Bio—Rad，美国)测A。。。值。
弃掉96孔板中的培养液，每TLJJH入培养基180
弘L及不同质量浓度的提取液(用DMEM稀释)20
肛L，使最终每孑L水煎液的质量浓度为10、5．0、2．5、
1．2、0．6、0．3mg／mL。每个药物浓度及对照组均作
平行孔6孔。其余操作步骤同上。
2．5 ALP活性测定：96孔板每孔接种1．0×104／
mL成骨样细胞ROSl7／2．8，分别加入不同质量浓
度塞隆骨脂提液、水提液，使其终质量浓度为100、
10、1．0、0．1mg／mL，每个药物组均作平行孔6孔。
分别培养1、3、6d后，用PBS冲洗3次，每孔加入
0．25mI．0．1％TritonX一100裂解液。10min后，收
集每孔溶液，按试剂盒要求测定ALP活性。
2．6统计学处理：数据均以z±S表示；组间差异用
t检验。
3结果与分析
3．1筛选药物质量浓度的确定：从表1得知，塞隆
骨水煎液对大鼠成骨样细胞ROSl7／2．8的生长没
有抑制作用。各组之间对成骨样细胞的增殖作用差
异显著(P
作用。而塞隆骨水煎液含有骨粉脂、醇、水提取物的
全成分，因此选用塞隆骨水煎液作为药物质量浓度
筛选物是可行的。本实验选用10mg／mL作为筛选
药效成分的样品质量浓度。
3．2塞隆骨脂、醇、水提物及水煎液对大鼠成骨样
细胞ROSl7／2．8增殖的影响：从图1可以看出：与
对照组比，在培养2d时10mg／mL塞隆骨脂提液
对大鼠成骨样细胞RoSl7／2．8有极显著的增殖作
用(P
表1 塞隆骨水煎液对成骨细胞增殖的影响(x士s，n一6)
Table1 EffectofSailongboneaqueousdecoctiononproli-
ferationof steobIastoidcells(卫±S，n一6)
组问比较：’P
sideredascontr01)
万方数据
·884· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第6期2005年6月
1～4—100、10、1．0、0·1mg／mL脂提液
5～8一i00、10、1．O、0．1mg／mL水提液
1--4—100，10，1．0，0．1mg／mLfat—solubleextract
5--8—100，10，1．0，0．1mg／mLaqueousextract
图2脂提液和水提液对成骨样细胞ALP
活性的影响(；±s，n一6)
Fig．2Effectoffat—solubleandaqueousextratsonALP
activityofosteoblastoidcells(；±s，n一6)
0．05)；水提物各浓度组与对照组相比，均无促进
ALP活性的作用。
4讨论
近年来的动物实验、细胞培养和流行病学研究
都显示了多聚不饱和脂肪酸以及镁、锌、锰、铜、氟、
锶等多种微量元素在骨质疏松症的治疗和预防中的
价值。根据文献报道塞隆骨含有铜、锌、铁、锰、镁、硒
等生命活动必需微量元素[7’8]，而且塞隆骨脂肪油含
有多种不饱和脂肪酸，可见从塞隆骨中分离促成骨
样细胞增殖和分化的生物活性物质，有其I|缶床实践
及生物学理论基础。
ALP为成骨细胞所分泌的一种酶蛋白，特异性
很高，它主要分布于细胞膜的钙结合转运蛋白，促进
细胞成熟、钙化[9]。结合细胞增殖率可有效反映成骨
细胞的代谢功能[10。。研究证明，ALP活性是成骨细
胞功能及分化程度的指标，其活性的高低可反映成
骨细胞的成熟状态[1“。目前，有关塞隆骨的研究集
中在治疗风湿性关节炎的方面，海平等艮1的研究表
明，塞隆骨对大鼠佐剂性关节炎原发病变和继发性
病变尾结节有明显的预防和治疗作用，同剂量的塞
隆骨相当虎骨作用强度。徐立等n23观察中华鼢鼠骨
提取物对多种炎症模型的影响，结果表明其具有抗
炎镇痛作用。但对塞隆骨在治疗骨质疏松方面的研
究还不够深入。本实验从细胞水平上对其作用机制
进行了探讨，选用大鼠ROSl7／2．8成骨样细胞与
塞隆骨不同提取物进行复合培养后，发现塞隆骨的
脂、水提液具有促进成骨样细胞增殖与分化的作用。
细胞培养2d后，其脂提液促增殖的最佳质量浓度
为10mg／mL，细胞培养6d促分化的最佳质量浓
度亦为10mg／mL，2d后水提液促增殖的最佳质量
浓度为10mg／mL；3d促分化的最佳质量浓度亦为
10mg／mL。提示在塞隆骨水相和脂相提取物中分
别存在较高活性的促成骨细胞增殖、分化的物质，它
们可能与塞隆骨中的微量元素和不饱和脂肪酸有
关，具有进一步研发成抗骨质疏松或骨质吸收新药
的前景，也从细胞水平上为塞隆骨作为虎骨替代品
提供了理论依据，证实了塞隆骨可作为虎骨治疗骨
质疏松的替代品；同时，本实验也为塞隆骨下一步进
行治疗骨质疏松药物的有效成分分离、纯化提供了
依据，以及进一步探讨骨相关基因表达打下了基础。
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万方数据
塞隆骨提取物对体外大鼠成骨样细胞ROS17/2.8的影响
作者： 潘明， 谭言飞， 杨志荣， PAN Ming， TAN Yan-fei， YANG Zhi-rong
作者单位： 潘明,PAN Ming(四川大学生命科学学院,四川,成都,610064;四川理工学院,生物工程系,四川
,自贡,643000)， 谭言飞,TAN Yan-fei(四川大学生物材料工程研究中心,四川,成都
,610064)， 杨志荣,YANG Zhi-rong(四川大学生命科学学院,四川,成都,610064)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(6)
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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200506034.aspx