全 文 ：#药理#
用嗜肝 ⁄病毒模型筛选抗病毒中草药
米志宝 陈鸿珊 3 张习坦 李壮 3 陈万荣 邵兴无 3
k军事医学科学院微生物流行病研究所 北京 tsssztl
摘要 对叶下珠等 ut种中草药进行抗乙肝病毒药物研究 o通过体外及体内逐步筛选发现 o叶下珠
和虎杖提取物对鸭乙型肝炎病毒k⁄
∂ l及乙型肝炎病毒k
∂ l均有较好的抑制效果 o旱莲草对
∂
⁄³有一定的抑制作用 ∀
关键词 ⁄
∂
∂ 筛选 抗病毒药 中草药
乙型肝炎病毒k
∂ l感染至今仍无稳定有
效的治疗药物 ∀鸭乙型肝炎病毒k⁄
∂ l和
∂ 同属嗜肝 ⁄病毒科 o它们在形态 !基因
组结构及复制机制上有共同之处 o因而可作为
∂ 模型≈t ∀鉴于合成化合物有许多毒副作
用 o本文通过对 ut种中草药抗 ⁄
∂ 和
∂
效果进行评价 o试图寻求天然药物作为抗
∂
的一条途径 ∀
1 材料与方法
1 q1 药物的制备
将市购药物洗净晾干 o切成短节或碎块 o用
药物粉碎机碾成粉状 ~usª药粉用 tsss °¯ ys h
乙醇浸泡 uw«o{s ε 回流提取 v«o反复两次 o用
尼龙网过滤 o减压分流乙醇 o获得药物 vsssµr
°¬±离心 x°¬±去杂质 o上清在 {s ε 水浴上浓
缩 o晾干研磨成粉状 o阴晾保存备用 ∀
1 q2 ⁄
∂ 和
∂ ⁄ 聚合酶 k ⁄
∂
⁄³l分析
试验参照 ¬¯¯ µ¨的方法进行≈u o⁄
∂ 未
成熟核心颗粒复制复合体k ≤¶l从感染鸭肝脏
中提取 ~
∂ 颗粒来自病人血清 o用日立超速
离心机制备 ∀沉淀 w ε 重悬于 ×∞缓冲液 ∀在
冰浴上取配制好的掺入液 wsΛ¯ o加到 t qx °¯ 的
∞³³¨ ±§²µ©管中 o再加入配制好的药液 {Λ¯ 于管
中 o最后加超离心制备的 ⁄
∂ ≤¶样品
vuΛ¯ ovz ε 水浴 o反应 w«oyx ε u°¬±终止反应 ∀
取 ysΛ¯ 点样于 • «¤·°¤± v号滤纸片上 o用 w ε
预冷好的 x h三氯乙酸洗片 ts°¬±ov次 ~用 w ε
预冷的无水乙醇浸泡 ts°¬±o自然晾干 o将滤片
置于闪烁液中ks qx h °° 和 s qstx h °°°
的二甲苯溶液l o用液烁仪k
tutx ¤¦®
¨ ·¤
µl测定其 ¦³°值 ∀
1 q3 检测鸭乙型肝炎病毒 ⁄k⁄
∂ ⁄l
克隆 ⁄
∂ ⁄基因组质粒 ³≤t{为郭
巨涛副研究员惠赠 o⁄
∂ ⁄ 探针用≈vu °
§≤ ×°÷ 标记 o参照 ° µ¨¶«¤°缺口翻译试剂盒
进行 ∀标记探针比活性为ks qx ∗ tl ≅ ts|§³°r
Λª⁄
∂ ⁄ ∀样本中 ⁄
∂ ⁄用核酸杂
交法检测≈v ∀
1 q4 检测
∂ 表面抗原r¨抗原 k
¶ªr
¨ ªl
用中国同位素公司北方免疫试剂研究所产
品 o固相放射免疫试剂盒测定 o用 Χ2计数器测定
每孔¦³°值 ∀
1 q5 2 qu qtx细胞培养
乙型肝炎病毒k
∂ l⁄ 克隆转染人肝
细胞k ³¨ ul的 u qu qtx细胞系 ∀美国 ²∏±·
≥¬±¤¬医学中心构建 ∀加 txsΛªr°¯ wt{ 亚克
隆 o常规培养 o细胞长成单层后进行实验≈w ∀
1 q6 鸭肝细胞原代培养k°⁄l
给一日龄北京鸭静脉注射 ussΛ¯ 2zy
⁄
∂ 毒株悬液 oz 日后检测 ⁄
∂ ⁄
3 中国医学科学院医药生物技术研究所 北京 tsssxs
#vw# 中国中药杂志 t||z年第 uu卷第 t期
和 ⁄
∂ ⁄³o对感染动物行手术灌流制备
肝细胞悬液 oxsµr°¬±离心细胞悬液 x°¬±o沉淀
用 ∞ 洗 v次 o重悬于 us °¯ tx生长液 o血
球计数器计数肝细胞 o台盼蓝染色排除死细胞 ∀
肝细胞种于 uw孔培养板 o用含胰岛素 !氢化可
的松 !青霉素和链霉素的 tx n t qx h ⁄ ≥ 培
养液 ovz ε ox h ≤ u条件下培养≈x ∀
1 q7 实验动物
一日龄北京鸭购自北京南苑鸭场 o实验工
作按照中国医学科学院医药生物技术研究所操
作程序进行 ∀实验动物均采用 ⁄
∂ 阴性雏
鸭 o实验攻毒前采血检测 ⁄
∂ ⁄ ∀
1 q8 实验程序
1 q8 q1 药物对 ⁄
∂ 和
∂ ⁄ 聚合酶抑
制试验
将中草药提取物稀释成各个不同浓度 o取
药液 {Λ¯ 加入反应体系 o进行药物对 ⁄
∂
⁄³的抑制试验 o同时与体外
∂ ⁄³抑
制剂磷甲酸kƒ²¶¦¤±¨ ·o• ¨¯ ¦¯²°¨公司产品l做
对比 ∀
1 q8 q2 细胞培养评价药物对嗜肝 ⁄病毒的
抑制效果
鸭肝细胞原代培养评价药物对鸭乙型肝炎
病毒 ⁄抑制效果 }对叶下珠提取物及抗病毒
药物无环鸟苷k≤ ∂ o• ¨¯ ¦¯²°¨公司产品l和磷
甲酸进行药物在鸭肝细胞原代培养中对 ⁄
∂
⁄的抑制效果评价 o同时进行药物对细胞的
毒性试验 o在培养单层细胞上加入含药培养液 o
vz ε x h ≤ u培养 uw«o每天换新液并镜检观察
细胞形态及数量 o持续观察 y天 o对无细胞毒性
药物剂量测定其对 ⁄
∂ ⁄的抑制效果 ∀
u qu qtx细胞培养评价药物对乙型肝炎病
毒抑制效果 }采用噻唑蓝k × ×l比色分析法测
定药物对细胞的毒性 ∀tsxr °¯ u qu qtx细胞接
种 uw孔细胞培养板 o每板 t °¯ ovz ε ox h ≤ u培
养 uw«o加无毒浓度以下 u倍稀释试验药液 o每
w天换含不同浓度药液的培养液 o将收集的培
养液 p us ε 冰冻保存 ~第 tu天时收集培养液测
定
¨ ª和
¶ª∀计算细胞对照及每个浓
度的抑制百分率 ∀
1 q8 q3 体内治疗实验
给一日龄北京鸭静脉注射 ussΛ¯ 2
zy⁄
∂ 悬液k大约 | ≅ ts{ 病毒颗粒r °¯ l ∀受
感染的雏鸭分别采用口服和腹腔两种给药方
式 }口服叶下珠和虎杖提取物 o一日两次 o剂量
分为 usss otsss oxss°ªr®ªo用生理盐水k≥l
和 ≤ ∂ 分别做阴阳性对照 ∀在治疗开始前一
天k×sl o给药 z天k×zl o给药 tx天k×txl和停
药 z天k°zl采血检测 ⁄
∂ ⁄ ∀
2 结果
2 q1 药物对 ⁄
∂ 和
∂ ⁄聚合酶体外抑
制试验
对 ut 种中草药提取物进行了 ⁄
∂
⁄³和
∂ ⁄³体外抑制试验 o结果在进
行试验的 ut 种中草药k叶下珠 !金钱草 !大青
叶 !大黄 !海藻 !猫爪草 !龙胆草 !茜草 !蒲公英 !
半枝莲 !虎杖 !昆布 !紫草 !青蒿 !金银花 !竹叶 !
夏枯草 !五味子 !茵陈 !黄柏 !旱莲草l中仅叶下
珠提取物对 ⁄
∂ ⁄°和
∂ ⁄°显示
出较强的抑制效果kuxs ovxxΛªr°¯ l 虎杖和旱
莲草对
∂ ⁄³有较好的抑制作用 o分别为
t{x oxtsΛªr°¯ o而其它药物的抑制作用弱或无
抑制作用 ∀叶下珠 !虎杖和旱莲草的抑制作用
与磷甲酸相比半数抑制浓度高于后者 ∀
2 q2 细胞培养评价药物对嗜肝 ⁄病毒的抑
制效果
2 q2 q1 鸭肝细胞原代培养评价药物对鸭乙型
肝炎病毒 ⁄的抑制效果
在药物对 ⁄
∂ ⁄³体外抑制试验的基
础上 o对筛选出的有效药物叶下珠及抗病毒药
物磷钾酸和无环鸟苷进行 °⁄ 培养试验 o评价
药物对 ⁄
∂ ⁄的抑制效果 o给药 y天检测
其 ⁄
∂ ⁄水平 o结果显示出这些药物均有
不同程度的 ⁄复制抑制作用k图 tl ∀
2 q2 q2 2 qu qtx细胞培养评价药物对乙型肝炎
病毒抑制效果
在药物对
∂ ⁄³体外抑制试验的基
础上 o对叶下珠进行 u qu qtx 细胞培养试验 o评
价药物对
∂ 的抑制效果 o给药 tu天检测其
对
¨ ª和
¶ª表达的抑制作用 ∀
#ww# 中国中药杂志 t||z年第 uu卷第 t期
图 t 药物在 °⁄¶培养细胞内
对 ⁄
∂ ⁄抑制效果
q≤ ∂
qƒ²¶¦¤µ±¨ · ≤ q° q∏√¬±¤√¬¤
为观察药物对 u qu qtx细胞的毒性 o在接种 u qu q
tx细胞后 uw«o加 u倍稀释的 x个稀释度药液 o
w天换一次药液 o维持 tu天 o显微镜观察细胞
病变 o另加入 wssΛªr°¯ × × 培养 o测得其
× ≤xs为 tsxssΛªr°¯ ∀二倍稀释叶下珠 wsss ∗
uxsΛªr°¯ 加入 u qu qtx细胞培养 o第 tu天药物
对
¨ ª及
¶ª表达抑制效果见图 u o均
显示出较好的抑制作用并有剂量反应关系 ∀
图 u 叶下珠在 u qu qtx细胞培养内
对
¨ ª和
¶ª表达的作用
q
¶ª
q
¨ ª
2 q3 体内治疗实验
在 °⁄¶培养评价药物对 ⁄
∂ ⁄ 抑
制试验的基础上 o我们用叶下珠进行了 ⁄
∂
感染动物治疗实验 o用无环鸟苷做药物对比 ∀
附表显示了治疗后血循环中 ⁄
∂ ⁄水平 o
在实验结束时 o口服叶下珠及虎杖减少动物的
病毒血症 o与对照相比有显著差异k Π s .st和
Π s .sx) ∀显示有剂量反应趋势 ,无环鸟苷组
与生理盐水组均起到很好对照作用 ,见附表 ∀
3 讨论
我们用嗜肝 ∆ΝΑ病毒模型从体外到体内
进行了抗病毒药物筛选 ,发现叶下珠和虎杖为
有潜力的抗乙肝病毒药物 ∀嗜肝 ∆ΝΑ病毒都
具有与病毒核心有关的 ∆ΝΑ聚合酶 ∀由于它
附表 口服给药对动物血循环 ⁄
∂ ⁄的影响
药物
剂量
ªr®ª
给药时间
×s ×z ×tx °z
无环鸟苷 s qt tsrts |rts zrts wrts
叶下珠 u tsrts {rts yrts wrts
t tsrts |rts yrts zrts
s qx tsrts tsrts tsrts tsrts
生理盐水 tsrts tsrts tsrts tsrts
s qsxtl s qsxtl s qsttl
虎 杖 u tsrts yrts yrts yrts
t tsrts {rts yrts zrts
s qx tsrts {rts {rts zrts
生理盐水 tsrts |rts tsrts |rts
s qsxtl s qsxtl s qsxtl
注 }表内数据为 ⁄
∂ ⁄ 阳性动物r实验动物 tl Π值
们参与病毒复制的逆转录过程 o对这种酶的抑
制是抗病毒药物的一个理想靶点 o也是快速药
物筛选的好方法 o一些化合物象苏拉明≈y !胸腺
嘧啶类似物≈z 和一些药用植物都显示出对
⁄³有抑制作用≈{ o| ∀我们实验中 o叶下珠提
取物对 ⁄
∂ ⁄³的抑制效果和其种属的其
它药相类似≈{ o°⁄ 培养实验结果显示 o叶下
珠对 ⁄
∂ ⁄复制的抑制效果和 ≤ ∂ 相类
似 o但其毒性小 o且有效浓度大于 ≤ ∂ ∀u qu q
tx细胞培养试验发现其对
¶ª和
¨ ª的
表达有抑制作用 o具有抗
∂ 潜力 ∀细胞培养
试验在抗病毒药物筛选中起重要作用 o它有节
省实验时间 !易于控制试验条件及揭示药物作
用机理等特点 ∀但体外实验结果均需体内实验
来评价 o因为体外的条件不能完全代表体内的
环境 ∀本文体内实验结果显示 o口服叶下珠和
虎杖均对 ⁄
∂ 血症有效 ∀提示其中含有抗
病毒因子 o但对其作用机理尚不清楚 ∀
4 参考文献
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