全 文 ：巴戟天离体再生及农杆菌介导的遗传转化
贺 红 o徐鸿华
k广州中医药大学 中药学院 o广东 广州 xtswsxl
≈摘要  目的 }在巴戟天离体再生的基础上 o建立一套根癌农杆菌转化的有效方法 o为巴戟天新品种选育 !引
入外源目的基因奠定基础 ∀方法 }以巴戟天带节茎为材料 o农杆菌菌株为 ∞‹„tst o含有质粒载体 ³Š„w{uŠŠ o质粒
上插入了 Š˜≥ !‘°× µ基因 ∀结果 } × 基本培养基附加 …„ t °ª#p t o外植体出芽率最高k|z q{ h l o…„ 浓度升
高 o出芽率下降 ∀外植体在培养基上的接种方式 o以竖放为好 o出芽所需的时间短且出芽率高 ∀根的诱导 o以  ×
附加 s qu ∗ s qx °ª#p t‘„„效果较好 o生根率可达 {s qs h以上 ∀巴戟天带节茎进行遗传转化 o卡那霉素作为选择
试剂 o浓度为 xs °ª#p t ∀头孢霉素用作抑菌剂 o浓度为 vss °ª#p t ∀经感染的外植体 o在选择培养基上筛选 t qx
个月后 o抗性芽发生率为 tw q{ h oŠ˜≥基因表达检测结果 o抗性植株中 oŠ˜≥反应呈阳性所占比例为 uu qu h ∀结
论 }通过探讨巴戟天的离体培养及根癌农杆菌介导的遗传转化 o获得了较高的离体再生频率 o建立了有效的遗传转
化系统 ∀
≈关键词  巴戟天 ~离体培养 ~遗传转化
≈中图分类号  ≥ xyz ≈文献标识码  … ≈文章编号  tsst2xvsukussults2szvv2sv
巴戟天 Μορινδα οφφιχιναλισ ‹²º 为我国四大
南药之一 o具有补肾壮阳 !强筋骨 !祛风湿的功效 o为
重要的出口创汇药材≈t  ∀但巴戟天易感染枯萎病 o
严重影响其产量和质量 o迫切需要培育抗病 !质优的
新品种≈u ov  ∀近年来 o通过基因转移提高植物的抗
病性 o为植物抗病育种开辟了一条新途径 ∀但有关
巴戟天的遗传转化 o国内外还未见报道 ∀本文以巴
戟天无菌苗的带节茎为材料 o研究了离体再生的过
程 o并初步建立了一套根癌农杆菌介导的外源基因
转入方法 ∀
1 材料与方法
1 q1 植物材料
巴戟天 Μ. οφφιχιναλισ k徐鸿华鉴定l 外植体
取自广州中医药大学药圃 ∀采取巴戟天植株的顶芽
或侧芽 o消毒培养无菌苗 o当苗长至一定大小时 o切
取约 t ¦° 长的带节茎 o用于离体培养 ∀
1 q2 离体培养
以  × 为基本培养基 o根据试验要求附加不同
≈收稿日期  ussu2sv2us
≈基金项目  国家自然科学基金项目kvsszs|uwl及广东省自然
科学基金项目k|{wttzl
≈通讯作者   电话 }ksusl {yx|tuvv2uwv| 传真 }ksusl
{yx|wzvx ∞2°¤¬¯}«½¯ ¼§¬««ƒ ³∏¥qª∏¤±ª½«²∏qª§q¦±
浓度的 …„ o‘„„ o每天光照 tu «o培养温度为 uy ε
? t ε ∀
1 q3 细菌菌株及培养
农杆菌菌 株为 ∞‹„tst o含 有质 粒载 体
³Š„w{uŠŠ o质粒上插入了 Š˜≥ o‘°× µ基因 ∀农
杆菌划线培养在含有 xs °ª# pt卡那霉素的 ≠ ∞°
培养基上 ou{ ε 黑暗培养 o待长出菌落后 o挑取单菌
落接于 ≠ ∞°液体培养基中 ou{ ε 振荡 us ∗ ux «o达
到菌对数生长期 o’⁄€ s q{ ∗ t左右 o培养物即可用
于感染 ∀
1 q4 外植体的转化
将巴戟天带节茎切段浸入到准备好的菌液中
us °¬±o随后转到无菌滤纸上以吸掉多余的菌液 o将
外植体接种于不含卡那霉素kŽ¤±¤°¼¦¬±oŽ°l及头
孢霉素k≤ ©¨²·¤¬¬°¨o≤¬l的  × 培养基上共培养 v §
后 o再转到含 Ž° xs °ª#p t和 ≤¬ vss °ª#pt的
选择培养基上 o诱导抗性芽的产生 ∀
1 q5 组织化学法检测 Š˜≥活性
Š˜≥组织化学染色法参见5植物遗传转化技术
手册6≈w  ∀
2 结果与分析
2 q1 …„浓度对形成芽的影响
试验表明 o…„ 对巴戟天外植体出芽效果较好 ∀
#vvz#
第 uz卷第 ts期
ussu年 ts月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ quz o‘²qts
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现以带节茎为材料 o × 基本培养基加入不同浓度
的 …„进行试验 ∀表 t可见 o…„为 t °ª#p t时 o带
节茎出芽率最高 o达 |z q{ h o…„ 浓度继续升高 o出
芽率随之下降 ∀试验中也观察到 o …„ 浓度升高至
w °ª#pt时 o产生的芽短缩 o茎难以伸长 o说明高浓
度的 …„ 对芽的生长有抑制作用 ∀在未加 …„ 的
 × 培养基上 o亦能部分形成芽 o出芽率为 x{ qs h ∀
单个外植体诱导芽的数量与 …„ 浓度有关 o不加 …„
时 o主要形成单芽 o而附加 …„能增加单个外植体成
芽的数量k表 tl ∀
表 t 不同 …„浓度对形成芽的影响
…„浓度
r°ª#p t
外植体数
r块
出芽率
r h
单个外植体诱导芽的数量
r个
s wv x{ qs t ∗ u
s qx ws |s qs u ∗ v
t qs wx |z q{ v ∗ w
u qs v{ {| qx v ∗ x
w qs wu {x qz x个以上
2 q2 外植体在培养基中放置方式对形成芽的影响
以巴戟天带节茎为材料 o采用 v种接种方式 }竖
放k形态学下端朝下垂直插入l ~倒放k形态学上端朝
下垂直插入l ~平放k外植体水平放置l ∀培养基为
 × n …„ t °ª#pt ∀结果 o培养 ts §时 o平放及倒
放的外植体出芽率较低 o分别为 vz qx h及 vt qv h ∀
竖放外植体出芽率较高 o达 {t qv h ∀随着培养时间
的延长 o平放和倒放的外植体出芽率有较大提高 o培
养时间为 vs §时 ov种接种方式的外植体出芽率均
达 |s h以上 o尤以竖放为最高 tss h k表 ul ∀
表 u 外植体在培养基中放置方式对形成芽的影响
外植体
放置方式
出芽率r h
接种 ts § 接种 us § 接种 vs §
竖 放 {t qv tss tss
倒 放 vt qv zx qs |z qy
平 放 vz qx yu qx |w qw
2 q3 根的诱导
巴戟天组织培养诱导形成的芽 o生长至 u ¦°长
时 o切下转入含有生长素的生根培养基 o转瓶后一般
t个月左右开始形成根 o获得完整植株 ∀试验表明 o
以  × 基本培养基附加 s qu ∗ s qx °ª#pt ‘„„ 效
果较好 o生根率可达 {s qs h以上 ~‘„„ 浓度继续增
加 o则易于在根茎交接处形成愈伤组织 o影响试管苗
的移栽 ~在不含 ‘„„的  × 培养基上 o亦能诱导生
根 o但生根率较低 ∀
2 q4 选择培养基中卡那霉素浓度的确定
以卡那霉素kŽ°l作为选择试剂 o筛选抗性芽的
产生 ∀外植体在培养基中的放置方式分两种 ~平放 !
竖放 o设置不同浓度的 Ž° 进行试验 ∀在无 Ž°的
对照中 o出芽率高 ∀ Ž°处理中 o接种 ts §左右 o外
植体开始萌发出小芽 o随着选择培养时间的延长 o大
多数芽难以生长 o萎缩死亡 o少数芽保持一定的生
长 ∀接种 vs §后统计结果k表 vl o平放时 oŽ°ux °ª
# pt时 o外植体出芽率为 vt qv h o当 Ž°增加至 xs
°ª# p t以上时 o所有外植体均无芽形成 o外植体两
端变褐死亡 ∀外植体竖放时 oŽ° xs °ª# p t时 o仍
有 v{ qs h的出芽率 o随着 Ž°浓度升高 o白芽数增
加 oŽ°升至 tss °ª# pt时 o仍有部分出芽 ∀说明
竖放外植体对 Ž°的抗性增加 ∀因此下面的转化试
验 o外植体选择培养均采用平放方式 o以 Ž° xs °ª
# pt作为常用的选择水平 ∀
表 v 不同浓度的卡那霉素对出芽的影响
外植体放置方式

卡那霉素浓度
r°ª# p t
出芽率
r h
平放 s |v qw
ux vt qv
xs s
zx s
tss s
竖放 s |{ qy
ux xs qs
xs v{ qs
zx ux qs
tss tu qx
2 q5 抑菌剂的选择
在用农杆菌转化植物细胞时 o常用头孢霉素
k≤¬l抑制农杆菌的过量生长 ∀试验结果表明 o≤¬
浓度为 vss °ª#pt时 o对外植体出芽无明显影响 ~
≤¬浓度升高至 xss °ª#pt以上时 o对芽的形成和
生长有一定的抑制作用 o长出的芽短缩 o且单个外植
体出芽的数量少 ∀抑菌试验中 ovss °ª#pt的 ≤¬
能完全抑制农杆菌的生长 o以下的转化试验 o ≤¬浓
度采用 vss °ª#pt ∀
2 q6 根癌农杆菌感染和抗性植株再生
巴戟天带节茎与农杆菌共培养 v §后 o转至附
加 vss °ª# p t头孢霉素和 xs °ª# pt卡那霉素的
选择培养基中进行培养 ot个多月后可看到抗性芽
的产生 ∀未经感染的外植体k对照l未分化出芽 o经
#wvz#
第 uz卷第 ts期
ussu年 ts月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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感染后 otw q{ h 的外植体分化出芽 ∀以上是感染
t qx个月的统计结果 ∀随后 o每过两周更换一次培
养基 o随着选择次数增加 o部分再生芽变白 !死亡 ∀
待芽长至 u ¦°左右 o从外植体上切下诱导生根 ∀
2 q7 Š˜≥基因表达检测
外植体与农杆菌共培养 v §后进行 Š˜≥基因
瞬时表达活性的检测 o取部分外植体进行 Š˜≥ 检
测 o发现 zs qx h的外植体 o在切口处细胞中可测到
Š˜≥活性 o显蓝色 o没有经转化处理的对照无任何
蓝色反应 ∀
Š˜≥基因稳定表达的活性检测于 x个月后进
行 ∀转化处理获得的抗性植株检测结果 ouu qu h的
植株呈阳性反应 ∀
3 讨论
建立高效稳定的组织培养再生体系是利用遗传
转化技术获得转基因植株的重要前提之一 ∀巴戟天
的组织培养 o已有的报道是通过外植体诱导愈伤组
织 o再经愈伤组织的器官发生再生植株≈x  o但诱导
成芽的比率不是很高 o且再生时间长 ∀本试验用巴
戟天带节茎诱导直接出芽 o获得了较高的不定芽分
化频率 o且出芽速度快 o为遗传转化工作的开展及转
化效率的提高创造了条件 ∀
现有的成功转化报道中 o卡那霉素是利用最多
的一种选择性试剂 o本试验观察到 o外植体平放时 o
Ž° xs °ª#p t时 o所有外植体均无芽形成 ~外植体
竖放时 oŽ° tss °ª#pt时 o仍有部分出芽 ∀这可
能因为竖放时 o外植体只一端接触培养基 ~而平放
时 o外植体与培养基充分接触 o低浓度的 Ž°就表现
强的抑制作用 o因此转化试验 o外植体采用平放方
式 o可减少假抗性芽的产生 ∀
≈参考文献 
≈t  徐鸿华 o林 励 o邓沛峰 o等 q巴戟天高产优质途径的研究 q广
州中医学院学报 ot||u o| kvl }txx q
≈u  时雪荣 q巴戟枯萎病的病原菌鉴定 q植物病理学报 ot|{{ ot{
kvl }tvz q
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成分的影响 q中国中药杂志 ot||v ot{ kzl }wst q
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科学技术出版社 ot||w oty{ q
≈x  徐鸿华 o邓沛峰 o林 励 o等 q巴戟天良种选育快繁技术研究 q
中药材 ot||v oty kwl }ty q
Ιν ςιτρο Χυλτυρε ανδ τηε Αγροβαχτεριυµ 2µεδιατεδ
Γενετιχ Τρανσφορµ ατιον οφ Μορινδα οφφιχιναλισ
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ναλισo©²µ¯ ¤¼¬±ª¤©²∏±§¤·¬²± ©²µ·«¨ ¬°³µ²√¨° ±¨·²©¥µ¨ §¨¶¤±§¬±·µ²§∏¦·¬²± ²©©²µ¨¬ª± ²¥­¨¦·¬√¨ ª¨ ±¨ ¶q Μετηοδ : × «¨ ¬¨³¯¤±·¶∏¶¨§
©²µ¦∏¯·∏µ¨ º µ¨¨ ·«¨ ±²§∏¯¤µ¶·¨° ¶¨ª° ±¨·¶©µ²° Μ. οφφιχιναλισ . Αγροβαχτεριυ µ τυ µεφαχιενσ¶·µ¤¬± º¤¶∞‹„tst o¦²±·¤¬±¬±ª√ ¦¨·²µ
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°²µ¨ ¶«²²·¶·«¤± º«¨ ±·«¨ ¼ º µ¨¨ ³¯¤¦¨§ º¬·«·«¨¬µ¥¤¶¤¯ ±¨§∏³µ¬ª«·²µº µ¨¨ ³¯¤¦¨§«²µ¬½²±·¤¯ ¼¯ q× «¨ ²³·¬°¤¯ µ²²·¬±ª ° §¨¬∏° ©²µµ¨2
ª¨ ±¨ µ¤·¬±ª¶«²²·¶º¤¶  × ¥¤¶¤¯ ° §¨¬∏° ¶∏³³¯¨° ±¨·¨§ º¬·«s qu·²s qx °ª#p t ‘„„ o¤±§¤µ²²·¬±§∏¦·¬²±µ¤·¨ ²√ µ¨{s qs h º¤¶²¥2
¶¨µ√ §¨q× «¨ ¶¨¯¨ ¦·¬²± ³µ¨¶¶∏µ¨ ©²µ®¤±¤°¼¦¬± º¤¶xs °ª#p t q≤ ©¨²·¤¬¬°¨º¤¶∏¶¨§¤¶¤±·¬¥¬²·¬¦¶o¤±§·«¨ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²± º¤¶vss °ª
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·«¨ µ¨¶¬¶·¤±·³¯¤±·¶º µ¨¨ Š˜≥2³²¶¬·¬√¨q Χονχλυσιον : °¯ ¤±·µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¬²± ¶¼¶·¨° ¤±§ Αγροβαχτεριυ µ2° §¨¬¤·¨§ ª¨ ±¨ ·¬¦·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±
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[ Κεψ ωορδσ] Μορινδα οφφιχιναλισ ~ ιν ϖιτρο ¦∏¯·∏µ¨ ~ª¨ ±¨ ·¬¦·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±
≈责任编辑 袁桂京 
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