全 文 ：中草黄ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月·1359·
胞内钙离子的浓度进而影响T细胞活化和增殖。
Meng等[。3报道淫羊藿提取物在体外具有雌激素效
应，可以防止老年鼠和绝经期妇女的骨质疏松症。
Ye等Do]报道淫羊藿提取物或制剂在体内可以引起
类似雌激素效应，提示淫羊藿可能与Genistein作
用路径相似，即通过抑制PTK活性，阻断活化信号
的传递。
淫羊藿提取物对ConA刺激的小鼠T淋巴细
胞早期活化和增殖都是有抑制作用的，具有开发为
免疫调节剂的潜能，其抗肿瘤、抗氧化作用也十分显
著，但具体作用靶点和路径尚不清楚，有待于进一步
探索和研究。
参考文献：
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基因芯片技术分析青蒿琥酯抑癌作用机制
陈立军，姚 丽，靳秋月，谢 红，呼文亮。
(中国人民武装警察部队医学院生化教研室，天津 300162)
摘 要：目的利用基因芯片检测青蒿琥酯作用于K562细胞后的基因表达情况，从基因水平上探讨青蒿琥酯抑制
K562细胞增殖的作用机制。方法K562细胞经不同浓度青蒿琥酯处理24h，倒置光显微镜和荧光显微镜观察细
胞形态学变化，流式细胞仪检测细胞周期变化。提取总RNA。逆转录生成cDNA，cDNA与基因芯片杂交，扫描仪检
测杂交结果。结果倒置光显微镜观察到青蒿琥酯处理的K562：细胞出现不同程度的皱缩，核分裂相减少，细胞密
度下降，漂浮细胞增多。荧光显微镜观察到青蒿琥酯处理的K562：细胞染色质高度浓缩、边缘化，凝聚成明亮的团
块，即凋亡小体。流式细胞仪检测青蒿琥酯处理K562细胞Gz期细胞的比例明显增加。扫描信号，分析数据显示10
条基因表达有差异，p21、chkl表达上调，cyclinBl、cyclinEl、E2FI、DNA—PK、hTERT、bcl一2、jnk、VEGF表达下调。
结论 青蒿琥酯可以抑制K562细胞增殖，作用机制与改变细胞周期某些调控物质的基因表达、诱导K562细胞凋
亡有关。
关键词：基因芯片；青蒿琥酯}细胞周期I细胞凋亡
中图分类号：R286．91 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)09—1359—06
Analysisonmechanismrelatedoanti-cancereffectofartesunateusinggenechiptechnology
CHENLi—jun，YAOLi，jINQiu—yue，XIEHong，HUWen—liang
(DepartmentofBiochemistry，MedicalCollegeofChinesePeople’sArmedPoliceForces，Tianjin300162，China)
Abstract：ObjectiveInordertounderstandhowartesunateinhibitedleukaemiacelllineK562，onthe
molecularlevel。thegenechipwasusedtodetectthegeneexpressionofleukaemiaelllineK562treatedby
artesunate．MethodsK562Cellweretreatedwithartesunatefor24h，andthenmodalitychangesw re
收稿日期：2007—12—20
基金项目：天津市科委课题资助项目(05YFJMJC08200)
作者简介：陈立军(1967一)，女，副教授，研究方向为肿瘤相关基因表达。Tel：(022)60578076E—mail；chenlijun67@eyou．com
*通讯作者呼文亮
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万方数据
·1360· 中草黄 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月
studiedbyunderinvertmicroscope；Themorp ologychangesofthenucleonswereobservedby
Hoechst33342／PIstaining；Thecellcyclestatewasexaminedbyflowcytometry(FCM)analysis．Total
RNAsamplesw reobtainedbvTRIzolandwerer verselytranscribedtothecDNA．cDNASamplesw re
hybridizedtoourgenechips．Hybridizationsign lswerecollectedandanalyzedfollowingscanningbyGene
Pix4100A．ResultsThenumbersofdriftcellswereincreasedndthedensityofcellswasdecreasedby
underinvertmicroscopeafterK562cellsweretreatedwithartesunatefor24h．Morphologychangesofcell
apoptosissuchaskaryopyknosisa dconglomerationwereobservedbyHoechst33342／PIstaining．FCM
AnalysishowedthatceilswerearrestedinG2phase．Thereweret ndifferentiallyexpressedgenes
identified．Hybridizationanalysisshowedup—regulationofp21andchkl，anddown—regulationofcycli Bl，
cyclinEl，E2F1，DNA—PK，hTERT，blc一2，jnk，andVEGFintheartesun te—treatedK562cells．
ConclusionTheinhibitionofleukaemiaellineK562byartesunateiScl ar：Artesunatexertsitanti—
cancereffectbyalteringthexpressionoftheseg nesinvolvedincellcycleandinducingapoptosis．
Keywords：genechip；artesunate；cellcycle；apoptosis
基因芯片是近年来涌现出来的一种生物学技
术，正广泛应用于基因表达分析、基因型和多态性分
析，疾病诊断与治疗和药物开发等研究中[1]。用基因
芯片作大规模的药物筛选研究可以省略大量的动物
实验，缩短药物筛选所用时间。中药多成分和作用的
多位点特点，决定了基因芯片在重要筛选和作用机
制研究中的优势地位[2]。青蒿琥酯是青蒿素重要的
衍生物之一，是目前常用的抗疟特效药，研究发现青
蒿琥酯还有抗肿瘤的活性口“]。如青蒿琥酯可以抑制
鼠艾氏腹水瘤经胞、人淋巴细胞白血病细胞(Molt一
4)、人宫颈癌细胞(HeLa)和人鼻咽癌细胞
(SUNE一1和CNE一1)的生长。在前期研究中发现，
青蒿琥酯可以诱导肿瘤细胞发生凋亡，对肿瘤细胞
生长具有明显的抑制作用Es]，并且被处理的肿瘤细
胞多被阻抑在G。／M期，和其他药物比较有明显的
差异。因此，本研究拟用细胞周期调控相关的基因表
达谱芯片，从基因水平探讨青蒿琥酯抑制肿瘤细胞
周期作用的分子机制。
1材料
1．1 细胞：人红白血病细胞株K562培养于含
10％胎牛血清、80U／L庆大霉素的RPMI一1640
(pH7．o)培养基中，37℃、5％CO。恒温培养箱中
孵育生长。取对数生长期细胞用于实验。
1．2药物：青蒿琥酯购自四川维康植化有限公司
(批号050326，质量分数：99．8％)。
1．3 主要仪器：二氧化碳培养箱(Forma)，倒置相
差显微镜(Olympus)，超纯水器(Millipore)，核酸
定量仪(Biochro)，SpotArrayASP7201点样仪
(PerKinElmer)，GenePix4100A扫描仪(Axon)，
CL一1000M紫外交联仪(UVP)，HB一1000杂交炉
(UVP)。
2 方法
2．1 青蒿琥酯处理K562细胞：配制青蒿琥酯溶
液，浓度分别为1×10一、4×10～、1．6×10一、6．4X
10一、2．56×10～mol／L。常规培养细胞，调整细胞
数为1×105／mL，体积为4．5mL／瓶，加入以上各
浓度药物0．5mL。使其终浓度为1×10一、4×
10—6、1．6×10—5、6．4×10—5、2．56×10一‘mol／L。将
细胞置于37℃、5％CO：培养箱中孵育。实验分组
遵循随机原则，分为对照组和青蒿琥酯组，每组重复
两瓶。
2．2 细胞形态学观察：经青蒿琥酯处理的各瓶细胞
置于37℃、5％CO：培养箱中孵育24h后，倒置光
显微镜观察细胞形态变化。每个标本分别收集细胞
后用Hoechst33342／PI双荧光染色，荧光显微镜观
察K562细胞变化。用100mg／L5一氟尿嘧啶处理细
胞做阳性对照。
2．3流式细胞仪检测细胞周期变化：收集细胞，预
冷的无水乙醇固定细胞，PBS洗1次，加入PI终质
量浓度20／19／mL和RnaseA终质量浓度50pg／
mL，37℃避光染色30min，流式细胞仪进行检测。
2．4总RNA提取及质控：药物作用24h后分别
收集细胞至一离心管中，弃培养液，细胞依次用
TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇处理后得到总
RNA，无RNA酶水20pL溶解RNA沉淀，
一80℃保存备用。总RNA纯化后，核酸定量仪测
定和A。。。／A：8。；变性胶电泳质检总RNA。
2．5 cDNA的生成：总RNA反转录生成cDNA，
同时标记，用纯化柱纯化标记的cDNA。
2．6构建基因芯片：查找相关文献，找到与青蒿琥
酯抗肿瘤密切相关基因及管家基因，在GeneBank
中查找这些基因的mRNA序列，用软件处理这些
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月·1361·
序列，利用Nucleotideblast数据库，从中找出符合
探针条件的mRNA序列，用Oligo6．0设计探针，
奥科生物有限公司合成。探针溶解与定量后，加入点
样板的相应位置，运行程序，点制芯片。过夜静置
晾干。
2．7 芯片杂交：标记的eDNA产物放于65℃烘
干，加入18弘L杂交液溶解，混匀；与芯片于杂交舱
中杂交，42℃、16h；取出芯片，洗液A中洗涤
3min，洗液B中洗涤3min，洗液C中洗涤1．5min。
自然晾干，芯片放人Genepix4100A扫描仪中扫
描，所得图像用GenepixPro6．0进行数据分析，计
算每个探针点的信号值；根据内参照基因的信号值，
对各个杂交阵进行数据归一化处理，根据归一化后
的结果，计算出各个基因的差异表达情况。
3结果
3．1倒置光显微镜观察K562细胞形态学改变：对
照组K562细胞为悬浮生长，胞体圆形，细胞核居
中，细胞膜完整，折光性强，可见大量分裂相。5一氟尿
嘧啶和青蒿琥酯处理的K562细胞出现不同程度的
皱缩，核分裂相减少，细胞密度下降，漂浮细胞增多，
细胞膜完整但出现发泡现象，细胞内可见多个折光
性较强的圆形小泡样结构和细胞出芽样改变。青蒿
琥酯处理的细胞形态变化有剂量依赖性，随药物浓
度增加，死亡细胞增加。见图1。
3．2 荧光显微镜观察K562细胞变化：对照组
K562细胞被染成蓝色，胞膜完整，细胞核结构正
常；5一氟尿嘧啶和青蒿琥酯处理的K562细胞一部
分被染成蓝色，染色质高度浓缩、边缘化，凝集成明
亮的团块，即凋亡小体。一部分细胞被染成红色，并
可见染色质凝集，即凋亡后继发死亡的细胞。还有一
部分染成红色，而细胞核结构正常，即非凋亡而死亡
的细胞。见图2。
图1 青蒿琥醋处理24h后K562细胞形态变化(光学显微镜)
Fig．1MorphologicalchangesofK562cellstreatedwithartesunatefor24h(opticalmicroscope)
图2青蒿琥酯处理24h后K562细胞形态变化(荧光显微镜)
Fig．2MorphologicalChangesofK562cellstreatedwithartesunatefor24h(fluorescencemicroscope)
3．3 流式细胞仪检测细胞周期：1．6×10-5mol／L 光度计检测RNA的量，均达到实验要求，测定
青蒿琥酯处理K562细胞24h后的细胞周期分布： RNAA。。。／A：。。值均在1．9～2．1，纯度较高，基本上
G。期为22．97％、S期为62．1％、G：期为15．o％；对没有蛋白质和DNA的污染。电泳分析总RNA的
照组的细胞周期分布：G。期为24．9％、S期为完整性，电泳图上可见清楚的28S和18S条带，且
71．o％、G：期为4．1％。经青蒿琥酯处理的K562细28S与18S比值大约为2：1，表明没有发生降解，
胞的G：期细胞数量增多。见图3。 总RNA质量较好。见图4。
3．4 TRlzol试剂提取总RNA质控：用紫外分光3．5基因芯片的构建：找到目的基因34条，细胞周
万方数据
·1362· 中草黄ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月
图3青蒿琥酯处理K562细胞的细胞周期分布
Fig．3CellcyclephasedistributionofK562
cellstreatedwithartesunate
A～E一1×10一o、4×10—o、1．6×10一，、6．4X10一，、
2．56×10-4mol／L青蒿琥酯F一对照组
A—E—l×10—6，4×10—6，1．6×10—5，6．4×10—5。
2．56×10一‘mol／LartesunateF—controlgroup
图4青蒿琥酯处理K562细胞提取的总RNA电泳图
Fig．4ElectrophoretogramoftotalRNAextracted
fromK562cellstreatedwithartesunate
期主要相关基因：PCNA、cyclinAl、cyclinBl、
cyclinC，cyclinDl，cyclinDl，cyclinEl，cyclinGl，
cdk4，cdk2，cdc2，p16，p21，p53，E2F1，chkl、chk2，
参与DNA损伤修复的主要基因：atm、DNA-PK、
DNA—TopoI、hTERT；与细胞凋亡主要相关基因：
bcl一2、trail、mcl一1、bax、bakl、brcal、caspase3；参与
信号转导的主要基因：erk、jnk、p38、cdc25A、fgdl、
rac；与血管生成相关的主要基因：VEGF；管家基因
一条／3-actin。每条基因设计两条探针，合成探针后每
个探针在芯片点制3个点，即每条基因有6个探针位
点，相当于每条探针与样品重复杂交6次。
3．6细胞周期相关基因芯片的检测结果
3．6．1 细胞周期相关基因芯片的检测特异性与均一
性测定结果：从样品中任选一个总RNA，按标准的操
作流程，重复转录标记、杂交两次(图5)。从图中可
见，阳性对照和定位基因荧光强度均较高，说明均一
图5基因芯片的特异性与均一性测定杂交图
Fig．5Specificityandhomogenicity
ofhybridizationbygenechip
性较好，阴性对照均无明显信号，说明特异性较好。
3．6．2细胞周期相关基因芯片的检测重复性的比
较：从样品中任选一个总RNA，按标准的操作流
程，重复转录标记、杂交两次，计算两次杂交结果的
相关度。相关度为0．9871，结果稳定可靠，重复性
较好，已达到芯片分析的要求。
3．6．3差异表达基因的检测：用p-actin作为管家
基因对结果扫描后的信号值进行了归一化处理，每
条基因对应的6个探针位点的归一化值取均值后，
其均值同对照信号值比值大于2．0或小于0．5作
为差异的标准，统计显示上调和下调的基因共10
个。见图6和表1。
表1青蒿琥酯处理的K562细胞差异表达基因
Table1 DifferenceexpressiongenesofK562
cellstreatedwithartesunate
青蒿琥酝／(Ⅱd·L—o) 下调基因 上诲基因
4讨论
基因芯片又称DNA微阵列、DNA芯片，通过
微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建成的
微型生物化学分析系统，能够检测基因的丰度来确
定基因的表达模式和表达水平。基因芯片在研究基
因差异表达上与传统方法相比具有无法比拟的优
势c6J]：(1)高通量同步分析；(2)全自动快速分析；
(3)高灵敏度精确分析。基于其诸多优势，本实验设
计、构建基因芯片，利用该芯片分析青蒿琥酯的抗肿
瘤作用机制。青蒿琥酯是青蒿素的重要衍生物之一，
是常用的抗疟特效药。近年来发现青蒿琥酯具有较
强的抗肿瘤作用[8]。有研究者[93发现，青蒿琥酯作用
MCF一7细胞24h后，细胞的生长被抑制。本实验
万方数据
中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月·1363·
围6青篙琥酯处理K562细胞的cDNA与芯片杂交图
Fig．6Hybridizationbe weencDNAandchipofK562cellstreatedwithartesunate
中，K562细胞经青蒿琥酯处理24h后，细胞生长受
到抑制。倒置光显微镜可见死亡细胞明显增多，并有
剂量依赖性，荧光显微镜也可见大量的死亡细胞。说
明青蒿琥酯能抑制K562细胞的增殖。
采用Hoechst33342／PI荧光双染，观察到部分
K562细胞出现凋亡小体。说明青蒿琥酯可以诱导
K562细胞凋亡，这与芯片检测中bel一2的表达下调
相符，也与文献报道相一致[1引，说明青蒿琥酯可以
影响Bcl一2与其他蛋白(如Bax、Bad等)相互结
合、相互作用而促进了细胞凋亡。
Efferth等[11]用青蒿琥酯作用于55种肿瘤细
胞，发现有一部分细胞被抑制于G。／G。期，还一部分
细胞被抑制于S期。在实验中通过流式细胞仪的检
测，发现被处理的K562细胞多被阻抑在G：／M期。
说明青蒿琥酯能通过阻滞K562细胞的细胞周期而
抑制其增殖。并且芯片筛选发现与细胞周期相关基
因有表达变化：cyclinBl、cyclinEl、E2FI表达下调，
p21和chkl表达上调。CyclinBl蛋白是G。／M期转
换的重要调节物质，青蒿琥酯可以降低CyclinBl的
表达，可能会使CyclinBl蛋白的合成量减少，不足
够与Cdc2形成成熟促进因子，而成熟促进因子是
驱动细胞Gz／M期转换的重要因素。所以K562细
胞表现出G：期向M期运行受抑制。E2F1表达下
调，抑制了其对一系列编码DNA复制所需蛋白质
的基因(如c—myc和B—myb等)的转录激活，进而
影响了细胞周期的进展。青蒿琥酯上调chkl
(Checkpointkinase1)的表达，促进chkl引起
CDC25的Ser216磷酸化，通过抑制CDC25的活性，
抑制M期CDK的活性，使细胞周期中断。通过以上
析发现流式细胞仪的检测结果与芯片检测结果基
本一致，可以推断，青蒿酯是通过综合调控这些细胞
周期相关基因的表达来阻滞K562细胞周期的，从
而表现出对肿瘤细胞生长的抑制。
此外，通过芯片检测还发现一些对细胞增殖具
有重要作用的基因表达下调，如VEGF、DNA—PK、
jnk等。青蒿琥酯使这些基因下调，也会表现出抑制
细胞增殖。如VEGF表达下调，抑制了VEGF与内
皮细胞跨膜酪氨酸激酶特异受体KDR／FIK一1相互
作用，从而抑制了血管内皮细胞有丝分裂，降低了血
管通透性，使肿瘤细胞得不到充分的营养，表现出生
长受到抑制。说明青蒿素还可以通过细胞凋亡和抑
制细胞周期之外的途径抑制K562细胞生长。
本实验中，利用基因芯片分析青蒿琥酯抗肿瘤
作用机制，发现该药物可以调节很多与细胞增殖、细
胞周期、细胞凋亡、血管生成密切相关的基因的表
达，这很可能就是青蒿琥酯可以抑制肿瘤生长的重
要原因。由于青蒿琥酯作用的复杂性，很多具体的作
用机制还需要进一步研究。
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野西瓜多糖诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的实验研究
季宇彬1’2，东 方h2，高世勇1’2，邹翔1’2
(1．哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心药物研究所博士后科研工作站，黑龙江哈尔滨150076}
2．国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，黑龙江哈尔滨 150076)
摘 要：目的 观察野西瓜多糖诱导人肺癌HepG2细胞凋亡作用。方法通过MTT法测定野西瓜多糖对HepG2
细胞的细胞毒作用；倒置显微镜观察野西瓜多糖对HepG2细胞形态的影响；AO／EB双染，激光共聚焦扫描显微镜
观察野西瓜多糖对HepG2细胞形态的影响,PI染色法，流式细胞术检测细胞凋亡率。结果MTT结果显示野西
瓜多糖对HepG2细胞有抑制作用，IC50为471．53mg／L；倒置显微镜、激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞形态，表
现为细胞皱缩、碎裂、甚至出现凋亡小体；流式细胞术检测到野西瓜高剂量组凋亡率为74．926％。结论野西瓜多
糖具有诱导HepG2细胞凋亡的作用。
关键词：野西瓜多糖；HepG2细胞；凋亡
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)09—1364—04
ApoptosisinducedbyCapparisspionosapoIysaccharideinhumanHepG2
JIYu—binl”，DONGFan91”，GAOShi—yon91”，ZOUXian91’2
(1．PostdoctoralRese rchStationofInstituteofMateriaMediea，ResearchCenterofLifeScienceandEnvironmentSci ce，
HarbinUniversityofCommerce，Harbin150076，China，2．EngineeringResearchC nter
ofNaturalAnticancerDrugs，MinistryofEducation，Harbin150076，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheapoptosisfCappaHsspionosapolysaccharide(CSPS)on
humanHeDG2．MethodsMTTwasadoptedodetermineifCSPShadcytotoxiceffecttoHepG2．The
alterationofHepG2
7
smorphologywasobservedbyinvertmicroscope．MorphologyofHepG2changed
withdosageofCSPSwasdetectedbyAO／EBandlaserconfocalscanningmicroscope．Flowcytometry
(FCM)wasusedtodetecttheapoptosisindexwithPIlabelingmethod．ResultsTheresultofMTT
showedthatCSPScouldinhibitthegrowthofHepG2，IC50was471．53mg／L；Themorphologyofeellwas
observedbyinvertmicroscopeandlaserconfocalscanningmicroscopeincellcollapsed，breaktopieces，
evenappearanceofapoptosisbody．Theapoptosisrateinhighdosegroupwas74。926oA，detectedby
FCM．ConclusionThisc nsequenceindi atesthatCSPScouldinducehumanHepG2apoptosis．
Keywords：Cappariss ionosaL．polysaccharide(CSPS)；HepG2；apoptosis
收稿日期：2008—04—25
基金项目：黑龙江省研究生创新科研项目(YJSCX2008—185HLJ)，黑龙江省自然科学基金项目(D200610)
作者简介：季字彬(1956一)，男．博士，教授，博士生导师，研究方向为肿瘤药理学。
刁
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万方数据
基因芯片技术分析青蒿琥酯抑癌作用机制
作者： 陈立军， 姚丽， 靳秋月， 谢红， 呼文亮， CHEN Li-jun， YAO Li， JIN Qiu-yue，
XIE Hong， HU Wen-liang
作者单位： 中国人民武装警察部队医学院生化教研室,天津,300162
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(9)
被引用次数： 6次

参考文献(11条)
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引证文献(6条)
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