全 文 ：·1242· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8月
另外，通过这3种成分及糖碱比的测定可以粗略估
计枸杞的总体品质，这可以大大简化检测工作，无疑
是对枸杞品质进行粗略检测时的科学、高效、经济的
方法。
4．2 土壤是生态系统中物质和能量交换的重要场
所，枸杞生命活动所需的水分和营养物质绝大部分
是通过根系从土壤中吸收的，土壤中各营养物质将
直接或间接影响枸杞的生长发育和品质表现，尤其
是变化较大的各种肥力因子。本研究通过枸杞各品
质指标与土壤中各肥力因子的两种相关性分析可以
看出，各品质指标大小分别受土壤中各种肥力因子
的共同影响，而非单一作用，只是作用大小与方向不
同。所以在做相关性分析时，应改变以往只做的简单
相关性分析，而采用控制土壤其他肥力因子的偏相
关分析，尤其是对于那些在两种分析下差异较大的
指标。因此在施肥时应该综合考虑各种肥力因子对
枸杞每一活性成分的协同作用，不要只片面考虑其
单一的相关性，尤其是对枸杞总糖、甜菜碱和类胡萝
卜素的综合作用。该研究可以为枸杞的合理施肥提
供参考。但枸杞品质除土壤肥力外还受其他环境因
素的影响，尤其是它们的综合作用，有关这一方面还
有待于进一步深入系统研究。
参考文献：
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红花cDNA—AFLP反应体系的优化研究
冯 娜，郭美丽’，张汉明
(第二军医大学药学院生药学教研室，上海200433)
摘要：目的为构建红花的遗传连锁图谱和功能基因的研究，探讨影响红花eDNA扩增片段长度多态性(eDNA
amplifiedragmentlengthpolymorphism，cDNA—AFLP)的各种因素，建立并优化红花cDNA—AFLP反应体系。
方法 以红花新鲜花瓣为材料，针对其内含物特殊性对Trizol法加以改进提取RNA，采用无RNaseH活性的鼠
源反转录酶(M—MLVRTase)结合置换合成法反转录双链eDNA；两步法酶切与连接，优化酶切时间；连接产物和
预扩产物分别设置不同稀释倍数扩增并对选扩反应体系略微调整后，用6％的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分
离，银染检测。结果改进Trizol法得到的红花总RNA样品较为完整，纯度较高，可直接用于双链的合成；经无
RNaseH活性反转录酶结合置换合成法得到高质量的eDNA模板。建立优化后的红花cDNA—AFLP体系为：250
ngeDNA37℃6h经限制性内切酶MseI和EcoRI完全酶切，16℃连接12h；连接产物最佳稀释倍数为10倍；预
扩产物稀释为150倍；PAGE电泳得到清晰、稳定、分辨率较高的多态性条带。结论本研究建立的反应体系适用
于红花功能基因的cDNA—AFLP研究。
关键词：红花；cDNA—AFLPI优化
中图分类号：R282．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)08—1242—05
OptimizationofcDNA—AFLPreactionsystemforCarthamustinctorius
FENGNa，GUOMei—li，ZHANGHan—ming
(DepartmentofPharmacognosy，CollegeofPharmacy，SecondMilitaryMe icalUniversity，Shanghai200433，China)
Abstract：ObjectiveTo onstructforthehereditylinkagemapandtostudythefunctionalgene
researchofCarthamustinctorius，thefac orsaffectingcDNAamplifiedragmentlengthpolymorphism
收稿日期：2007—12—03
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30772734)，上海市基础研究重点项目(043919313)
作者简介：冯 娜(1981一)，女．辽宁沈阳人，硕士，方向为药用植物功能基因研究。E—mail：fn1wf@hotmail．com
*通讯作者郭美丽Tel：(021)25074576E—mail：mlguo@smmu．edu．ca
—
万方数据
中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8月·1243·
(cDNA—AFLP)ofC．tinctoriuswereinvestigatedwi hd velopingandoptimizingtheDNA—AFLPreaction
system．MethodsImprovedTrizolmethodwasusedtoextractRNAfromcompoundsin ewpetals
specifictosafflower．WiththehelpofM—MLVRTasewithoutRNaseactivitycombinedwithreplacement
synthesismethod，double—strandedeDNAw synthesizedfromtotalRNA；eDNAwasdigestedby
restrictionenzymeMseI／EcoRIandligatedbytwosteps．Thent productswereprovidedforpre—
amplificationandselectedamplificationofdifferentconcentrationgradients．Aftertinymodificationsof
systemconcentration，finallyPAGEelectrophoresisandsilver—stainingwereperformed．ResultsHigh
purityandintegratedtotalRNAforlaterDNAsynthesiswereobtainedanhighqualitycDNAwas
synthesizedw ththehelpofM—MLVRTasewithoutRNaseactivitycombinedwithreplacementsynthesis
method．ThecDNA—AFLPreactionsysteminC．tinctoHuswasa follows：250ngintegritycDNAwas
digestedthoroughlyat37℃for6 h，andligated12h at16℃．Furthermore，’thesampledilution
multiplicationw s10foldforpre-amplificationand150f ldforselectedamplificationundertheproper
systemconcentration．Accordingtotheabover actionsystem，thepolymorphousstripswithigh
resolutionpowerinPAGEelectrophoresiswe eclearndstable．ConclusionThecDNA—AFLPreaction
systemestablishedandoptimizednthisexperimentissuitableforthefunctionalgeneanalysisofC．
tinctorius．
Keywords：CarthamustinctoriusL．；cDNA—AFLP；optimization
红花CarthamustinctoriusL．为菊科植物红花
的干燥管状花[1]，具有扩张冠状动脉、抗凝、降血压、
抗炎镇痛等多种药理作用[2]，临床应用广泛。长期的
自然、人工选择的结果，使红花有效成分量产生了明
显的变化[3]。有效成分的量是影响红花品质的主要
因素，因此对红花品质相关功能基因进行研究，对提
高红花的产量和质量具有重要意义。
cDNA—AFLP技术，是Bachem等[‘]将AFLP
技术应用于mRNA表达差异分析的mRNA指纹
图谱技术，其保留了AFLP技术的可靠性与高效
性，广泛应用于植物生长发育过程基因分离与表达
特性的研究[5一]。本研究建立并优化了红花eDNA—
AFLP体系，为从表达水平分离红花的功能基因并
为实现红花品质性状的定向调控奠定基础。
1材料与仪器
1．1材料：红花2个品种(No．0016、No．0025)的
鲜花采自第二军医大学药学院药圃；限制性内切酶
EcoRI、MseI购自NEB公司，T．DNA连接酶、Taq
酶购自MBI公司；丙烯酰胺、过硫酸胺、TEMED购
自上海华舜生物公司；尿素(Urea)购自Sigma公
司；硝酸银、剥离硅烷、亲和硅烷购自北京鼎国生物
工程公司；引物、接头由上海生工生物公司合成；其
余试剂均为国产分析纯。
1．2 仪器：DYCZ--20A型电泳槽、DYY一12型电
泳仪电源(北京六一仪器厂)，P270型摇床(中国科
学院武汉科学仪器厂)，DK—S12型电热恒温水浴
锅(上海华连医疗器械有限公司)，PL3002型电子
天平(MettlerToledo公司)。 ．
1．3接头与引物：由上海生工生物公司合成。
2方法
2．1模板RNA提取：以0．2g红花新鲜花瓣为材
料，参照Trizol方法[7]，针对红花叶片内含物特殊
性加入无RNase的DNasel和RNaseInhibitor，得
到总RNA存于一70℃超低温冰箱中待用。
2．2 eDNA双链合成：参照TaKaRaM—MLV
RTaseeDNASynthesisKit方法说明以20g总
RNA为材料，采用无RNaseH活性的鼠源反转录
酶(M—MLVRTase)结合置换合成法反转录双链
cDNA，并加入精制。测定质量浓度，保存于一20℃。
2．3限制性消化与接头连接：采用MseI和EcoRI
两种限制性内切酶对cDNA双酶切，酶切时间分别
为37℃3、4、6、8、10h5个处理；然后用T‘DNA连
接酶将MseI和EcoRI接头(表1)与酶切片断连接，
16℃12h。酶切连接体系(见表2)。
表1 eDNA—AFLP接头和引物核苷酸序列
Table1 eDNA—AFLPAdaptersandprimer
nucleotidesequences
名称 核苷酸序列
EcoRI接头
MseI接头
预扩增引物E00
预扩增引物Moo
选择性扩增引物E+z
选择性扩增引物M+2
5’一CTCGTAGACTGCGTACC．3’
3’一CTGACGCATGGTTAA一5’
5’一GACGATGAGTCCTGAG一3’
3-TACTCAGGACTCAT．5’
5’一GACTGCGTACCAATTC一37
5’一GATGAGTCCTGAGTAA一3’
5’·GACTGCGTACCAATTCNN’一3’
5’一GATGAGTCCTGAGTAANN’一3’
。N代表ACGT任意一种．E1～E16、M1～M16共16条引物
’NrepresentsanyoneofACGT。16primersaltogetherEl--
E16．M1一M16
万方数据
·1244· 中单黄 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8月
表2 cDNA—AFLP反应体系
Table2 cDNA—AFLPReactionsystem
2．4片段的预扩增：本研究用连接产物做模板，采
用预扩增引物组合E。。／眠。，序列见(表1)建立预扩
增反应体系(表2)。对连接产物设置不同的稀释倍数
(5、10、15、20倍)进行对比研究，在Biometra
PTC一200型PCR仪上按以下程序扩增：72℃、3
rain，94℃、30S，56℃、30S，72℃、1min，30个循
环；72℃、5min；4℃保温。预扩增产物在1．5％琼
脂糖凝胶上检测，一20℃保存备用。
2．5选择性扩增：将预扩增产物稀释150倍作模
板，采用选择性扩增引物组合E+。／M+：，序列见表
1，建立选择性扩增体系(表2)，对预扩增产物设置不
同稀释倍数(25、50、75、100、150、200倍)对比实
验，选扩反应体系根据Bachem等[2]体系作略微调
整。扩增程序：94℃、1min，94℃、30S，65℃、30S
每循环降低0．7℃，72℃、1min12个循环，94℃、
30S，56℃、30S，72℃、lmin25个循环，72℃、10
min；4℃保温。扩增产物在1．5％琼脂糖检测，
一20℃保存备用。
2．6 cDNA—AFLP扩增产物的电泳：按30V／cm
的电压进行30min预电泳。扩增产物：溴酚兰8：3
混合，95℃变性8min，立即冰浴。去除在预电泳时
扩散出来的尿素后加样，采用不同的电压(1500、
2000、2500V)进行电泳实验，并保持恒压状态。
2．7银染检测：①固定胶：将胶浸在固定液中振荡
20min至电泳染料颜色消失。②洗胶：用超纯水洗
胶3次，每次8min。⑧染色：将黏着胶的玻璃板移至
染色液中，在摇床上摇动30min。④洗胶：将胶浸入
超纯水中、取出沥水、立即放入盛有预冷显色液的塑
料盘中。从超纯水中取出胶到放入反应液中的时间
不能超过5--一10s。⑤显色：胶在摇床上摇动至出现
模板带或可见第1条带。将胶转至剩余的1升预冷的
显色液中，继续显色3---5min或至全部条带显现出
来。⑥终止显色反应：加入1L固定／终止溶液，在摇
床上反应2～3min，终止显色反应。⑦洗胶：用超纯
水漂洗聚丙烯酰胺凝胶两次，每次5min，室温放置
干胶。
3结果与分析
3．1模板的制备
3．1．1总RNA的提取：高纯度与浓度模板的制备
是AFLP成功的关键，本研究针对红花花瓣内含物
特殊性对Trizol法加以改进提取的RNA，根据
RNA极易降解而RNA酶却很稳定的情况，在加入
DNaseI消化残留植物DNA时，同时加入RNase
Inhibitor，可有效保证RNA不降解。条带清晰，可
见28S、18S、5SrRNA3条电泳条带，28S的亮度是
18S的2倍，没有拖带现象，基本无降解，图1所示；
紫外分光光度检测，4：。。／A：。。均在1．8～2．0，A：。。／
A：3。均在2．O～2．3，表明所提取的RNA样品较为
完整，纯度较高，可直接用于双链的合成。
图1红花新鲜花瓣总RNA
Fig．1TotalRNAfromfreshpetalsofC．tinctorius
3．1．2双链的合成：目前，商品化反转录酶有禽源
反转录酶(AMV)和鼠源反转录酶(M—MLV)两
种。AMV具有DNA内切活性和RNaseH活性，对
cDNA合成的长度和产量都有抑制，因此本研究采
用了无RNaseH活性的M—MLV酶。cDNA第2链
的合成有置换合成法和寡核苷酸引发合成法两种。
笔者采用的是由Gubler[8]改进的置换合成法，此法
既不需要对第1链合成产物进行纯化处理，也不用
S1核酸酶切割双链cDNA的单链发夹环，合成效
率很高。另外实验发现，双链cDNA的合成试前，先
将RNA溶于65℃加热5min后迅速置于冰中，
万方数据
中草葫ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8,El·1245·
可减弱二级结构的影响，提高逆转录反应效率。精制
后cDNA无RNA残留，在琼脂糖上检测呈弥散状
分散均匀(图2)满足后续试验的需要。
图2红花双链cDNA
Fig．2Double-strandedcDNAofC．tinctorius
3．2 限制性消化与接头连接：酶切是否充分直接影
响试验的成败，为建立适合红花的酶切时间和酶切
体系，本试验做了不同酶切时间的处理。结果发现：
在6～10h，酶切时间对结果影响不大，但是时间过
短酶切不充分，时间过长又会降低效率，因此选择
37℃6h。对比试验发现酶切连接分开的“两步法”
要比“一步法”扩增的后续效果好，“一步法”效率不
及“两步法”。
3．3预扩增反应：预扩增反应起着承上启下的作
用，既反映酶切和连接效果的好坏，又直接影响着选
择性扩增的电泳结果。电泳结果表明，稀释倍数为10
倍的相对分子质量区域未见条带，说明消化完全，连
接效率较高，可进行后续实验。
3．4选择性扩增反应：选择性扩增的条带，是从扩
增产物中筛选出能被合适引物组合选择性碱基识别
的片段，其结果需要用高分辨的聚丙烯酰胺凝胶电
泳检测，引物中选择性碱基的数目影响着反应的特
异性，一般DNA—AFLP选择性碱基数为P+。[9]，在
红花的cDNA—AFLP中，根据红花功能基因组的特
点，本实验选择在2条引物的37末端分别加上2个选
择性碱基E+。／M+。的引物组合，每对引物平均可扩
增出50---70条清晰稳定的多态性条带。对预扩产
物设置不同稀释倍数对比实验，发现稀释150倍的
扩增效果最好，cDNA—AFLP扩增反应体系经略微
调整优化后如表2所示。
3．5电泳及银染：银染的操作方便、灵敏度高、具有
无须使用放射性元素的优势。银染后胶板经干燥可
长期保存，对于特异性条带可直接从胶板上准确切
出，有利于后续的研究和分析。实验用6．o0A的聚
丙烯酰胺胶2kV恒压电泳，玻璃板无气泡，不撕
胶，分辨率高。显影溶液在温度低的环境中进行以减
小背景杂色。红花2个品种(No．0016、No．0025)的
圹增结果见图3。
1～9一红花品种No．0016l，-9’红花品种No．0025引物组合：
1．1’一E+AA／M+AG2，2F-E+AT／M+TC3，3t_E+TG／
M+GA4，4’一E+AT／^f+TT5，51_E+TA／^f+TC6，6’一
E+CAIM+GA1．’一E+TTfM+TC8．8I-E+GC／M+TC
9，9-E+TT／M+ATM—DL2 000DNA相对分子标记
l一9一individualsofNo．00161’一97individualsofNo．0025
Primercombinations：1，1-E+AA／M+AG2；27一E+AT／
肘+TC3，3t-E+TG／M+GA4，4’一￡+AT／M+TT5，5’一
E+1氏}M+TC6。6’一E+CAfM+GK1。’一E+TI}M+TC
8，8-E+GC／M+TC9，9t-E+TT／^f+ATM—DL2 000
DNAmarker
图3 9对不同引物组合扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶
银染后电泳图
Fig．3Silver—stainedeDNA—AFLPPAGEgel
byninedifferentprimercombinations
4讨论
到目前为止，有关药用植物红花功能基因组的
研究尚未见报道，笔者曾研究了红花品种结构基因
组的随机扩增多态DNA(randomamplifiedpoly—
morphicDNA，RAPD)和AFLP分子鉴定技
术[10,11]，但研究与红花重要性状的功能基因，一定要
从基因表达水平人手。本研究建立的eDNA—AFLP
体系，可快速筛选出与目的基因相连锁的标记。
eDNA—AFLP操作步骤复杂，流程长，影响因素
多，需要针对不同植物品种进行系统研究，并优化每
一步反应条件，建立相应的反应体系。模板的质量直
接影响eDNA—AFLP成功，本研究建立的RNA提
取方法适用于红花叶片内含物特殊性，提取的
RNA纯度在1．8---2．0，采用无RNaseH活性的鼠
万方数据
·1246· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8,El
源反转录酶(M—MLVRTase)并应用高效置换合
成法反转录双链cDNA，预先将RNA溶于65℃
加热5min，有效地提高了逆转录的反应效率，得到
的完整cDNA满足红花eDNA—AFLP的需要。根据
实验结果，“两步法”在连接时可不用担心酶的过度
消化，提高了连接效率，分别在限制性内切酶和T。
连接酶的最佳温度下，完成酶切和连接反应。采用
E+：／M+。的引物组合，在cDNA—AFLP两次的扩增
中，产物稀释10倍进行预扩增，再稀释150倍进行选
择性扩增，扩增效果较好。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
是非常关键的一步，也是较难操作的步骤，染色后的
洗涤时间需要根据不同的物种摸索合适的洗涤时
间，如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA，
产生很少或没有序列信号，如果洗涤时间过长，染色
步骤需要重新进行。本研究的银染检测系统一次可
扩增约分辨出50～70条扩增带。在建立cDNA-
AFLP体系的PCR扩增中，除扩增程序相对稳定不
需要对其进行较大变动外，聚合酶的特异性，M92+
引物的浓度对结果的影响都很大，某一个试剂用量
的偏差都有可能导致整个实验的失败，因此保证每
一个试剂的质量和工作液浓度的准确也至关重要。
本研究获得了高质量的红花cDNA模板，建立
了红花的cDNA—AFLP特异性反应体系，为筛选与
红花重要性状相关的功能基因乃至直接的调控基因
奠定了基础。
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菝葜药材脂溶性成分指纹图谱研究
周艳林·一，严 海2，钟小清2，王力生2，邹节明Ⅵ。
(1．北京中医药大学中药学院，北京 100102I2．桂林三金药业股份有限公司，广西桂林541004)
摘要：目的 建立菝葜药材的脂溶性成分的HPLC指纹图谱分析方法。方法采用PhenomenexC。。柱
(250mm×4．6mm，5Urn)，以甲醇一0．1％的磷酸溶液梯度洗脱，体积流量1．0mL／min，柱温35℃，检测波长303
nm。结果不同产地菝葜药材的指纹图谱有较好的相似度，通过比较对应了山龙眼苷A、落新妇苷、白藜芦醇及黄
杞苷4个对照品。结论建立的方法能较好地反映了菝葜中二氢黄酮醇苷及二苯乙烯两类主要成分。
关键词：菝葜；脂溶性成分；指纹图谱；梯度洗脱
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)08—1246一03
Fingerprintofhydropholicc mponentsinSmilaxchina
ZHOUYan—linl2，YANHai2，ZHONGXiao—qin92，WANGLi—shen92，ZOUJie—min91t2
(1．InstituteofChineseMateriaMedica，BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Beijing100102，China；
2．GuilinSa jinPharmaceuticalCo．，Ltd．，Guilin541004，China)
收稿日期：2008—01—06
基金项目：广西优势中草药产业化资助项目(桂科产0444002—1)
作者简介：周艳林(1972一)，男，江西资溪人，在读博士，研究方向为中药化学与质量控制。E—mail：zhouyanlinzhou@yahoo．corn．ca
*通讯作者邹节明，男，教授级高工，博士生导师。Tel：(0773)5842588E—mail：Sanjin@91．gx．cninfo．net
万方数据
红花cDNA-AFLP反应体系的优化研究
作者： 冯娜， 郭美丽， 张汉明
作者单位： 第二军医大学药学院生药学教研室,上海,200433
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(8)
被引用次数： 2次

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11.张阵阵;郭美丽;张军东 红花基因组扩增片段长度多态性反应体系的建立和优化[期刊论文]-第二军医大学学报
2006(03)

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10. 文亚峰.何钢.WEN Ya-feng.HE Gang 枣叶片DNA的提取以及AFLP反应体系的建立[期刊论文]-中南林业科技大学
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引证文献(2条)
1.李剑峰.张跃强.樊哲儒.王岩军.王浩.曲延英.范玲 小麦叶片cDNA-AFLP扩增反应体系的优化[期刊论文]-新疆农
业科学 2010(3)
2.邢磊.刘雪梅.宋福南 白桦cDNA-AFLP体系的优化和建立[期刊论文]-东北林业大学学报 2010(10)


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