全 文 ：血两虚心律失常具有保护作用[ 10] ,深入研究炙甘草
汤对血流动力学的影响可进一步解释炙甘草汤诸药
合用而使气血充实, 阴阳调和, 则/脉结代、心动悸0
皆得其平的作用机制。
参考文献:
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曼宋酮 E对白血病 K562 细胞增殖和凋亡的影响
王 一1 ,张 玎1 ,连小云1 , 苗玉迪1 , 王 晖1 ,黄世亮2*
( 11 陕西省人民医院 血液科 ,陕西 西安 710068; 21 中山大学药学院,广东 广州 510052)
摘 要:目的 观察曼宋酮 E 对 K562 细胞增殖的影响, 探讨其诱导凋亡作用及可能机制。方法 台盼蓝拒染实
验检测曼宋酮 E 对 K562 细胞的生长抑制作用; 荧光显微镜观察细胞核形态的变化; 流式细胞仪测定细胞凋亡率;
免疫印迹法测定 caspase-3、caspase-8、caspase-9 及 PARP 的活性及 Bc-l 2、Bax 和 Bc-l XL 的表达。结果 曼宋酮 E
抑制 K562 细胞增殖呈时间和浓度相关性; 121 5 Lg / mL 的曼宋酮 E 处理 K562 细胞 0、12、24、48 h 细胞凋亡率分
别为 ( 21 1? 01 8)%、( 31 2 ? 11 6)%、( 151 3 ? 81 9)%、( 251 1 ? 111 4) % ; 在曼宋酮 E 诱导 K562 细胞凋亡过程中,
caspase-3 和 caspase-8 以及 PARP 出现活化断裂, casepase-9 表达无明显变化; Bc-l 2 家族蛋白 Bc-l 2、Bax 和 Bc-l L
表达无显著改变。结论 曼宋酮 E 可抑制诱导 K562 细胞增殖, 并通过 caspase-8 途径介导凋亡。
关键词:曼宋酮; 白血病 K562 细胞; 增殖; 凋亡
中图分类号: R2851 91 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2009) 09-1440-04
曼宋酮类化合物 ( mansonones) 是一类具有醌
类结构或其前体的天然产物, 曼宋酮类化合物自
1965年至今,已发现近 20种, 主要是从梧酮科植物
曼宋梧桐及榆科无毛榆的心材中提取分离得
到[ 1~ 4]。近期的研究结果提示 8种从榉树心材中提
取的曼宋酮类化合物有明显抗枯草杆菌、抗金黄色
葡萄球菌以及抗粪肠球菌功能、并且对多种肿瘤细
胞具有明显抗肿瘤作用[ 5]。在 20多种化合物中曼
宋酮 E 具有较明显的抗肿瘤作用 [ 5~ 7]。本研究以天
然的曼宋酮 E 作为研究对象, 观察其对白血病
K562 细胞增殖及凋亡的影响, 初步研究曼宋酮 E
抗白血病作用及可能机制。
1 材料
11 1 肿瘤细胞株: K562 白血病细胞 (陕西省人民
医院血液病研究室保存) , 从液氮中复苏后, 培养至
对数生长期后备用。
11 2 药品与试剂: 曼宋酮 E 由中山大学药学院提
取纯化,质量分数 99% 以上。RPM I 1640 培养基
和小牛血清购于 Gibcobr l公司;台盼蓝购于 Sigma
公司;碘化丙啶 ( PI) 和 RnaseA 购于 Angus公司;
鼠抗人 caspase-3 抗体、兔抗人 PARP 抗体、
caspase-3、鼠抗人 caspase-8 抗体、兔抗人 caspasec-
9 抗体、鼠抗人 bc-l 2 抗体、兔抗人 bc-l XL 抗体、鼠
抗人 BAX 抗体、抗鼠-HRP 抗体和抗兔-HRP 抗体
均购于美国 Santa cruz 公司; B-act in 抗体为 Sigma
公司产品;其余均为国产试剂。
2 方法
21 1 细胞增殖抑制实验: 将处于对数生长期的
K562细胞以 1 @ 105 / mL 加入 24 孔板中, 每孔 1
mL,加入不同质量浓度的曼宋酮 E, 于 12、24、36、
#1440# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 9 期 2009 年 9 月
* 收稿日期: 2009- 02-25 作者简介:王 一( 1971 ) ) ,女,博士,副主任医师,主要从事血液病及肿瘤的基础和临床研究。
T el : 13571936193 E- mail : w angyi5182003@ yah oo. com . cn
48 h 后记数, 用台盼蓝拒染实验记数活细胞, 实验
重复 3次,取平均值,描绘生长曲线。
21 2 Hoechst 33258 染色: 121 5 Lg/ mL 曼宋酮 E
处理 K562 细胞 12、24 h 后, 收集细胞,用 PBS 洗
涤 1次,再加入固定液 (甲醇-醋酸 3 B 1) 4 e 10
min, PBS 洗涤后加入 Hoechst 33258,避光室温孵
育 20 min 后, 荧光显微镜观察照相。
21 3 流式细胞仪分析曼宋酮 E 对人白血病 K562
细胞周期分布和凋亡的影响: 取对数生长期的
K562 细胞, 离心, 用含 10% 胎牛血清的 RPMI
1640 培养基制备成浓度为 3 @ 105 / mL 的细胞悬
液,于 6 孔板中每孔接种 1 mL,将平板置于 37 e 、
5% CO2培养箱。加入 121 5 Lg / mL 的曼宋酮 E, 分
别在给药后 0、12、24、48 h 后,离心收集细胞, 细胞
沉淀用 70% 乙醇悬浮,在 4 e 冰箱固定 24 h 以
上。固定后的细胞用 PBS 洗两遍并悬浮, 加入 PI
染液 (终质量浓度为 50 Lg/ mL) , 37 e 避光温育
30 min, 300 目尼龙网滤过后, 在流式细胞仪上计数
10 000 个细胞, 测定细胞各期 DNA 量, 办件分析
SubG1期细胞为凋亡细胞, 测定细胞凋亡率。
21 4 Western blot ting 测定蛋白的表达: 取对数生
长期的 K562 细胞, 离心, 用含 10% 胎牛血清的
RPM I 1640 培养基制备成浓度为 3 @ 105 / mL 的细
胞悬液, 于 6 孔板中每孔接种 1 mL, 将平板置于
37 e 、5% CO 2培养箱。加入 121 5 Lg/ mL 曼宋酮
E, 分别在给药后 0、12、24、48 h 后, 离心收集细胞,
用蛋白裂解液裂解细胞后, 离心去细胞碎片, 95 e
煮 10 min 后, 蛋白定量, 40 Lg/孔, 上样于 10%
SDS-聚丙烯凝胶电泳。将胶上蛋白转移到 PVDF
膜后, 5% 脱脂奶中封闭过夜,按抗体稀释比例加入
一抗室温孵育 3 h, TBST 洗涤 2次, 每次 10 min。
加入相应二抗,室温孵育 30 min, TBST 洗涤 3次,每
次 10 min。用 ECL 发光试剂盒发光,冲片,照相。
215 统计学处理:采用 SPSS 软件进行统计学处理。
3 结果
31 1 曼宋酮 E对 K562 细胞增殖活性的影响:微克
级质量浓度的曼宋酮 E 对 K562细胞的增殖起明显
抑制作用,其对 K562 细胞的增殖抑制作用呈时间
与剂量依赖性, 结果见图 1。
31 2 荧光显微镜下观察曼宋酮 E 对 K562 细胞形
态的影响:用 121 5 Lg/ mL 曼宋酮 E 处理 K562 细
胞 24 h, Hoest 3258 染色后, 在荧光显微镜下观察
到 K562 细胞出现细胞核的浓集, 核固缩和出现核
小体,结果见图 2。
31 3 流式细胞仪测定曼宋酮 E 诱导 K562 细胞凋
亡; 121 5 Lg/ mL 曼宋酮 E 处理 K562 细胞 0、12、
24、48 h 后,用流式细胞仪测定 Sub G 1期细胞的比
例,即凋亡细胞,可见处理 12 h 仅有少量 Sub G 1期
细胞, 24、48 h 可见到 Sub G 1期细胞明显增多, 实验
重复 3次。121 5 Lg/ mL 曼宋酮 E 处理 K562 细胞
0、12、24、48 h 细胞凋亡率分别为 ( 21 1 ? 01 8) %、
( 31 2 ? 11 6) %、( 151 3 ? 81 9) %、( 251 1 ? 111 4) %。
31 4 曼宋酮 E 诱导 K562 细胞凋亡过程中
caspase-3、caspase-8、caspase-9 和 PARP 蛋白表达
的变化:用 121 5 Lg/ mL 曼宋酮 E 处理 562 细胞,
可见从处理 12 h 开始长为 35 kb的 caspase-3 逐渐
断裂为 17 kb 长的 caspase-3 活性片段; 原长度为
118 kb 的 PARP 分子,也逐渐形成断裂为有活性的
85 kb的断裂带,且随时间的延长,断裂越明显; 121 5
Lg/ mL 曼宋酮E处理 K562细胞 12 h 起可见原长为
57 kb 的 caspase-8 断裂为 43 kb 和 41 kb 的活化片
段,时间越长, 断裂带含量越多; 而 K562 细胞中
caspase 家族分子中的 caspase-9 在曼宋酮 E 处理的
整个过程中无活性断裂带出现,结果见图 3。
31 5 曼宋酮诱导 K562 细胞凋亡过程中 Bc-l 2、Bc-l
#1441#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 9 期 2009 年 9 月
XL 和 BAX 的变化:用 121 5 Lg/ mL 曼宋酮 E处理
K562 细胞后观察不同时间发现, Bc-l 2、Bc-l XL 和
Bax 的表达无变化,结果见图 4。
4 讨论
急性白血病主要的治疗方式为联合化疗, 而白
血病化疗失败的重要原因为白血病细胞产生原发或
继发耐药,导致本病的复发,要克服白血病治疗中的
耐药问题,主要通过化疗过程中使用不同作用机制
的化疗药物来克服[ 8] 。而要使白血病化疗中不断换
用不同作用机制的抗白血病药物,需要不断寻找新
的有效的抗白血病药物。凋亡是许多体细胞的正常
归宿,尤其在造血系统,它是造血细胞终末分化的一
个组成部分,细胞凋亡明显受抑是造成白血病细胞
大量积聚的主要原因, 研究表明凋亡的明显减弱与
白血病的发生, 治疗耐药、预后等密切相关[ 9]。而抗
白血病药物治疗白血病的机制与诱导凋亡有关。
从植物的有效抗肿瘤成分中开发新的抗白血病
药物是药理学家和临床研究者的研究方向之一。天
然曼宋酮有 20多种,研究发现其中不少化合物具有
明显抗肿瘤作用。
Wang 等 [ 4]研究表明曼宋酮 E和 F 在体外可诱
导多种肿瘤细胞凋亡, L iu 等[ 10] 近期的研究结果显
示,曼宋酮 F 可以通过抑制 H eLa 细胞内硫氧蛋白
还原酶的活性来诱导细胞凋亡。本实验研究显示曼
宋酮 E对 K562细胞具有明显抗增殖作用,进一步
的研究显示, 一定质量浓度的曼宋酮 E 作用于人
K562细胞后,可以逐渐出现细胞核的聚集、浓缩,
甚至形成凋亡小体;利用流式细胞仪测定可见到 G1
期细胞的亚二倍体, 这些结果提示, 曼宋酮 E 可诱
导 K562细胞凋亡。在药物作用下通过 caspases信
号途径诱导细胞凋亡是凋亡途径之一, 本研究发现
曼宋酮 E 作用于 K562 细胞后, 出现 caspase-3 和
caspase-8 的活化断裂, 无 caspase-9 活性的变
化[ 1 1, 12]。通常凋亡信号先活化 caspase-8 或/和
caspase-9,通过信号级联反应再活化凋亡的执行者
caspase-3和 PARP 分子,使细胞中 DNA 分子出现
不可逆的损伤,细胞核出现浓集, 出现细胞凋亡[ 12]。
本研究发现曼宋酮 E作用 K562 细胞 12 h 后可使
caspase-8分子逐渐断裂, 活化, 同时可以观察到有
caspase-3和 PARP 的断裂和活化, 表明曼宋酮 E
可以通过活化 caspase-8 信号途径诱导 K562 细胞
凋亡[ 13]。细胞凋亡过程中 Bc-l 2家族蛋白在凋亡的
调节过程中起非常重要的作用, caspase-9 活化状态
可影响包括 Bax , Bc-l XL 等 Bc-l 2 家族蛋白的表达
发生变化,调节细胞浆内细胞色素 C内流到线粒体
中[ 1 4~ 16]。本研究结果显示, 曼宋酮 E 可通过活化
caspase-8、caspase-3途径诱导 K562 细胞凋亡; Bc-l
2 家族蛋白不参与凋亡的调节。
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金振口服液抗甲型 H1N1 流感病毒作用实验研究
萧 伟1 ,郑丽舒2 ,尚 强1 ,刘 涛1 , 孙 兰1 ,王振中1*
( 11 江苏康缘药业股份有限公司, 江苏 连云港 222001; 21 中国疾病预防控制中心病毒病研究所,北京 100052)
摘 要:目的 观察金振口服液对甲型 H 1N1 流感病毒抑制作用。方法 采用体外抗病毒实验, 观察金振口服液
对流感病毒的抑制作用; 采用体内实验, 以流感病毒感染小鼠, 观察小鼠生存时间、死亡率及肺组织病变程度。
结果 金振口服液体外对甲型 H1N1 流感病毒有一定抑制作用,体内则能明显延长感染小鼠的生存时间, 显著降
低肺湿质量 (P< 01 05、01 01) , 减轻肺组织病变程度。结论 金振口服液体内外均有一定的抗甲型 H 1N1 流感病
毒作用。
关键词:金振口服液; 甲型 H1N1 流感病毒; MDCK 细胞
中图分类号: R2851 5 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2009) 09-1443-04
流感是一种传染性强、传播速度快的疾病。流
感所引起的并发症和死亡非常严重。据世界卫生组
织 ( WHO) 发布的公告, 全球每年流感病例为 6~
12亿例, 死亡 50~ 100万人[ 1]。目前市场上的抗流
感药物主要以化学药为主, 但化学药通常有不同程
度的不良反应, 在临床应用上受到一定限制。而中
医药临床防治流感具有独特效果, 不良反应少,药源
丰富,价格低廉,通过调节整体免疫功能抑制病毒复
制,阻止病毒致细胞病变, 改善临床症状快等, 在治
疗流感方面显示了了独特的优势[ 2]。本实验观察金
振口服液对流感病毒 A/ PR/ 8/ 34 (甲型 H1N1 流
感病毒) 抑制作用,为临床应用提供理论依据。
1 实验材料
11 1 细胞与病毒: MDCK 细胞 (犬肾细胞) , 流感
病毒 A/ PR/ 8/ 34 (甲型 H1N1 流感病毒) , 均由病
毒生物技术国家工程研究中心北京金迪克生物技术
研究所提供。
11 2 药物与试剂: 金振口服液, 江苏康缘药业股份
有限公司,规格: 生药 11 84 g / 10 mL (用蒸馏水稀
释 50 倍用于体外试验,生药 31 68 mg/ mL) , 批号:
080115;病毒唑注射液,天津药业集团新郑股份有限
公司,规格: 10 mg/ mL,批号: 080219;达菲,上海罗
氏制药有限公司,规格: 75 mg, 批号: 080121; DMEM
培养基,北京清大天一生物技术有限公司;小牛血清,
杭州四季青药物试剂有限公司; 胰酶、MTT 均购自
Amresco 公司; DMSO购自 Sigma 公司。
11 3 受试动物: BALB/ c 小鼠, 清洁级, 体质量:
14~ 16 g, 购自北京维通利华实验动物技术有限公
司,质量合格证: SCXK (京) 2007-0001。
11 4 仪器: 96孔细胞培养板, Cor ning 公司;超净工
作台,北京瑞泽康生物科技有限公司; CO2恒温培养
箱,日本 Sanyo 公司; 倒置显微镜,日本 Olympus公
司;酶标仪, 美国伯乐公司。
2 方法
21 1 药物对 MDCK 细胞毒性实验: 96孔细胞板中
每孔接种约 5 @ 104个 MDCK 细胞, 于 37 e 、5%
CO 2培养箱中培养过夜,弃去细胞培养液, 加入金振
口服液 20 LL (生药 31 68 mg/ mL) 于 37 e 、5%
#1443#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 9 期 2009 年 9 月
* 收稿日期: 2009- 05-14 作者简介:萧 伟( 1959 ) ) ,男,山东昌乐人,高级工程师,博士,研究方向为中药新型制剂的研究与开发。
* 通讯作者 王振中 T el: ( 0518) 85521956 E-mail: wzhzh-nj@ tom. com