全 文 ：参考文献:
[ 1 ]　韩　澍, 崔亚君, 郭洪祝, 等1 密蒙花化学成分及其活性研究1
[J ]1 中草药, 2004, 35 (10) : 1086210901
[ 2 ]　刘长山, 朱禧星 1 糖尿病患者红细胞醛糖还原酶活性初步考
察 [J ]1 中国糖尿病杂志, 1996, 4 (4) : 19822011
[ 3 ]　王　琦, 周玲仙, 罗晓东1 植物中醛糖还原酶抑制剂的研究进
展 [J ]1 中草药, 2005, 36 (2) : 29823031
[ 4 ]　韩　澍, 崔亚君, 郭洪祝, 等 1 中药密蒙花药材 RP2H PL C 指
纹图谱研究 [J ]1 中国中药杂志, 2004, 29 (10) : 93829401
[ 5 ]　张均田1 现代药理实验方法学 [M ]1 北京: 北京医科大学中
国协和医科大学联合出版社, 19981
[ 6 ]　Rack ietan N , Rack ietan M L , N adkarn iM R 1 Studies on di2 abetogen ic action of strep tozo tocin (N SC237917) [J ]1 CancerChem other R ep orts, 1993, 29: 912951[ 7 ]　孙子林, 葛祖恺1 糖尿病动物模型及其进展 [J ]1 中国糖尿病杂志, 1999, 7 (4) : 22722291[ 8 ]　于德民, 吴　锐, 尹　潍, 等 1 实验性链脲佐菌素糖尿病动物模型的研究 [J ]1 中国糖尿病杂志, 1995, 3 (2) : 10521091[ 9 ]　H amm es H P, M artin S, Federlin K, et a l. Am inoguan idinetreatm en t inh ib its the developm ent of experim en tal d iabeticretinopathy [J ]1 P roc N a tl A cad S ci U SA , 1991, 88 (24) :115552115581[ 10 ]　丁正华, 严　宏, 哈文静, 等 1 氨基胍滴眼液防治大鼠糖尿病性白内障的研究 [J ]1 眼科新进展, 2006, 26 (5) : 33623391
羟基红花黄色素A 对常氧ö低氧犬胸主动脉内皮细胞增殖的影响
张　岭1, 宋　艳1, 2, 李长龄2, 刘　珂3, 朱海波1Ξ
(11 中国医学科学院 中国协和医科大学药物研究所, 北京　100050; 21 北京大学药学院,
北京　100083; 31 烟台大学药学院, 山东 烟台　264003)
摘　要: 目的　探讨羟基红花黄色素A (H SYA ) 对常氧ö低氧两种条件下体外培养的犬胸主动脉内皮细胞增殖的
影响。方法　采用内膜消化刮取法获取犬胸主动脉内皮细胞; 在常氧 (21% ) ö低氧 (10% ) 两种条件下, 分别以噻唑
蓝 (M T T ) 法观察 H SYA 对血管内皮细胞 (V EC) 增殖的影响, 血管内皮生长因子 (V EGF) 作为阳性对照。结果
常氧条件下 H YSA 1、011 mmo löL 在 72、96、120 h 时对 V EC 有明显促增殖作用; 低氧条件下 H YSA 1、011、0101
mmo löL 在 24、48 h 时对 V EC 有明显促增殖作用, 且具有浓度和时间依赖性。H YSA 1 mmo löL 与 V EGF 216×
10- 7mo löL 在同样条件下对 V EC 的促增殖作用强度相当。结论　在常氧ö低氧两种条件下, H SYA 均具有明显促
V EC 增殖作用, 且在低氧条件更为明显。
关键词: 红花; 羟基红花黄色素A (H SYA ) ; 血管内皮细胞 (V EC) ; 血管新生; 常氧; 低氧; 血管内皮生长因子
(V EGF)
中图分类号: R 28612　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 025322670 (2008) 0120090204
　　心脑梗死性疾病的病理特征之一是慢性或持续
性组织供血不足, 导致组织代偿性血管再生, 逐渐建
立侧枝循环以适应缺血缺氧的需要。但是这种代偿
过程缓慢, 而且往往不够充分, 应用外源性物质可刺
激缺血组织毛细血管生长及侧枝循环形成的治疗方
法称为“药物分子搭桥术”或称“治疗性血管新生”,
目前已成为缺血性心脑组织血运重建研究的热
点[1, 2 ]。
羟基红花黄色素A (hydroxysaff lo r yellow A ,
H SYA ) 是从传统的活血化瘀类中药红花中分离出
来的、具有抗心脑缺血性损伤和抗凝血[3 ]、抗氧化[4 ]
作用的有效单体成分。前期实验证实: H SYA 可通
过增强血管内皮生长因子 (V EGF) 表达而增加脑
组织缺血区半暗带内新生血管数目, 从而明显缩小
脑组织的梗死面积[5 ]。血管新生是一个多因素参与、
多环节相互作用的极其复杂的过程。由于血管内皮
细胞 (vascu lar endo thelia l cell, V EC) 的增殖是新
生血管形成的必要条件, 而 V EC 的增殖和分化也
一直被认为是血管新生的最重要环节, 是药物治疗
心脑梗死性疾病的重要靶区。故此 Garget t 等[6 ]认
为对 V EC 增殖的检测是研究体外血管新生合适的
模型[6 ]。
本实验采用体外培养的犬胸主动脉内皮细胞作
为模型材料, 观察在常氧ö低氧两种条件下, 不同浓
度的 H SYA 作用不同时间对 V EC 增殖的影响, 探
讨 H SYA 促血管新生作用的细胞生物学基础。
1　材料
111　药品与试剂: H SYA (质量分数 9917% ) , 山东
省天然药物工程技术研究中心提供, 为黄色疏松冻
干块状物, 易溶于水, 批号 20000525; 人V EGF, PE2
·09· 中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 1 期 2008 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2007202220
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30370720; 30572343)3 通讯作者　朱海波　T el: (010) 63188106　Fax: (010) 63017757　E2m ail: zhuhaibo@ imm. ac. cn
PRO 2T ECH 公司产品, 批号 030210; DM EM 细胞
培养基和低糖 DM EM 细胞培养基, Gibco 公司产
品; 小牛血清 (FBS) , 杭州四季青公司产品, 批号
031208; 胰蛋白酶, Sigm a 公司产品; 第Ð 因子鉴定
试剂, K irkegaard & Perry 实验室提供;M T T、二甲
基亚砜 (DM SO ) , 均为 Am resco 公司产品; H epes,
Roche 产品; 青霉素, 华北制药集团生产; D 2H ank s
液, 自制。
112　动物: 健康雄性杂种犬, 15～ 20 kg, 由北京方
元缘实验动物养殖场提供。
113　仪器: T hermo Fo rm a CO 2培养箱及三气培养
箱, 美国 Fo rm a 公司; XD S21B 型倒置显微镜, 重庆
光学仪器公司; FL C—3 型超净工作台, 哈尔滨市东
联公司; SPECTRA M A X 190 型酶标仪,M o lecu lar
D evices 公司。
2　方法
211　V EC 的分离培养: 采用内膜消化刮取法获取
犬胸主动脉V EC [7 ]。犬处死后, 取出胸主动脉, 放于
D 2H ank s 液中, 用眼科剪修剪血管的外膜, 去除脂
肪组织, 用眼科剪纵行剖开动脉, 内膜朝下放于含有
0125% 胰蛋白酶中, 37 ℃ 消化 20 m in, 轻轻刮取
V EC, 收集消化液, 离心 (1 000 röm in, 5 m in) , 去
上清, 收集细胞, 含 20% FBS DM EM 培养液洗 1
次, 再制备细胞悬液, 调整细胞数, 种植于培养瓶中。
24 h 后倾去含细胞碎片和未贴壁细胞的培养液, 换
入新鲜培养液培养。
212　V EC 的传代: V EC 接种于培养瓶中, 置于 37
℃、5% CO 2中静置培养, 约 2～ 3 d 换液 1 次, 弃去
原培养液, 每瓶中加入新鲜的含 20% FBS 的
DM EM 培养液进行培养, 约 4～ 7 d, 细胞长成致密
单层, 铺满培养瓶底, 进行传代; 弃去原培养液, 用
D 2H ank s 液冲洗2 遍, 每瓶加入 0125% 胰蛋白酶消
化, 相差显微镜下观察细胞, 约 1～ 3 m in 细胞成圆
形, 中止消化, 加入培养液, 吹打培养瓶底, 使 V EC
脱落, 计数, 用含 10% FBS 的 DM EM 培养液制成
细胞悬液 (细胞数 1×104～ 2×104ömL ) , 接种于新
的培养瓶中, 置于 37 ℃、5% CO 2中静置培养。
213　V EC 形态学鉴定[8 ]: 在加有盖玻片的6 孔板包
被明胶后接种胰酶消化的培养犬胸主动脉 V EC
(细胞数 1×105ö孔) , 待 V EC 长至近单层时取出 6
孔板内的盖玻片, 丙酮2甲醇 (1∶1) 固定 5 m in,
PBS 冲洗 5 m in, 3 次。加 1∶100 稀释的Ð 因子单
抗, 4 ℃ 下作用 4 h。PBS 洗涤后, 加1∶250 F ITC2
羊抗鼠 IgG, 室温下作用 1 h。PBS 洗涤后荧光显微
镜观察。
214　常氧条件下 V EC 增殖测定[9 ]: 取经 4 代细胞
经 0125% 胰酶消化后, 以 1×104ö孔接种于96 孔板
内, 每孔加入 100 ΛL 细胞悬液, 置于 37 ℃、5%
CO 2、21% O 2 (常氧) 条件下静置培养。24 h 后更换
为含 10% FBS 的不同剂量含药培养液 (包括对照
组, V EGF 216×10- 7mo löL 组, H SYA 1、011、0101
mmo löL 组, 每组6 个复孔。继续于 37 ℃、5% CO 2、
21% O 2 (常氧) 条件下分别培养 48、72、96、120 h
后, 采用M T T 比色法测定细胞增殖变化。每孔加入
M T T 溶液 (5 göL ) 20 ΛL , 继续孵育 4 h 终止培养,
吸弃上清液, 每孔加入 150 ΛL DM SO 振荡 10 m in,
然后在波长 490 nm 处, 于酶标仪上测定吸光度值。
同时设立空白对照孔, 与实验组平行, 不加细胞只加
培养液。比色时以空白对照孔调零。
215　低氧条件下 V EC 增殖测定[9 ]: 取第 4 代细胞
经 0125% 胰酶消化以后, 以 1×104ö孔接种于 96
孔板内, 每孔加入 100 ΛL 细胞悬液, 置于 37 ℃、
5% CO 2、21% O 2 (常氧) 条件下静置培养。24 h 后
更换为含 10% FBS 的不同剂量含药培养液 (分组
同214 项) , 每组6 个复孔。继续于 37 ℃、5% CO 2、
10% O 2 (低氧) 条件下分别培养 12、24、48、72 h 后,
采用M T T 比色法测定细胞增殖变化。
216　统计学处理: 数据用 x ±s 表示, 采用方差分析
方法 (ANOVA ) 进行组间比较。
3　结果
311　V EC 的鉴定: 光学显微镜下细胞主要呈小圆
形、多角形或长梭形, 边界清楚, 胞浆丰富, 有大且明
显的圆形或椭圆形的细胞核, 核内染色质稀疏, 核仁
1～ 2 个; 细胞呈单层生长, 互不重叠, 呈铺路石状镶
嵌排列。第Ð 因子单抗间接免疫荧光染色结果显示
所培养的细胞表达较高密度的Ð 因子, 可见 95%
以上的细胞膜、细胞浆内有棕黄色颗粒分布, 尤其是
核周边区染色较深, 证明所培养的细胞为犬胸主动
脉V EC。
312　常氧条件下 H SYA 对 V EC 增殖的影响: 由
图 1 可见, 加药培养 48 h 后, 各实验组和对照组犬
胸主动脉V EC 数量 (A ) 值都随时间延长而逐渐增
加, 细胞形态无明显差别。48 h 时, 各实验组与对照
组比较, 细胞增殖无统计学意义 (P > 0105) ; 72 h
时, 各实验组的细胞数均比对照组高, 尤其 H YSA
组、V EGF 216×10- 7mo löL 组与对照组比较, 差异
显著 (P < 0105) ; 作用 96、120 h 时, 各组细胞数量
继续增加, H SYA 1、011 mmo löL 和 V EGF 216×
·19·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 1 期 2008 年 1 月
10- 7 mo löL 组的细胞数均比对照组明显增加 (P <
0105、0101)。结果表明, H SYA 1、011 mmo löL 对体
外培养的犬胸主动脉 V EC 有明显促增殖作用, 且
具有浓度依赖性和时间依赖性。H YSA 1 mmo löL
与V EGF 216×10- 7mo löL 在各时间点对 V EC 的
促增殖作用强度相当 (P > 0105)。
与对照组比较: 3 P < 0105　3 3 P < 01013 P < 0105　3 3 P < 0101 vs con tro l group
图 1　常氧条件下 HSYA 对犬胸主动脉 VEC 增殖的影响
(x±s, n= 6)
F ig. 1　Effect of HSYA on prol iferation of can ine
aortic endothel ia l cells in normox ic culture
(x±s, n= 6)
313　低氧条件下 H SYA 对 V EC 增殖的影响: 由
图2 可见, 低氧条件下, 加药培养 12 h 时, 各组V EC
均无明显变化, H YSA 组细胞数与对照组比较无明
显差异 (P > 0105)。24 h 后, 实验组和对照组V EC
数量都随时间延长而逐渐增加, 细胞形态无明显差
别。24 h 时, 各给药组的细胞数均比对照组增多, 尤
其 V EGF 组与对照组比较, 有明显差异 ( P <
0105) ; 48 h 时, 各组细胞数量继续增加, H SYA 1、
01001 mmo löL 和 V EGF 216×10- 7mo löL 各组的
细胞数均比对照组明显增加, 差异显著 (P < 0101) ;
72 h 时, 各组细胞数量继续增加, 但增殖速度渐缓,
这可能是由于细胞数量趋于饱和引起的, V EGF
216×10- 7mo löL 组与对照组比较, 仍有显著性差异
(P < 0101)。结果表明, H SYA 1、011、0101 mmo löL
对低氧体外培养的犬胸主动脉V EC 有明显促增殖
作用, 且具有浓度依赖性和时间依赖性。
4　讨论
　　血管的发生主要有两种形式, 即血管新生和血
管生长。在成熟动物新生血管形成的过程中, 两种机
制都起作用, 一般认为作用较大的是血管新生。血管
新生是一个复杂的过程, 在某些刺激因素 (如缺氧、
缺血或炎症等) 作用下, 细胞外基质降解及V EC 增
殖、迁移、黏附和连接, 由已有的血管网的内皮细胞
分化增殖而形成新的毛细血管[10 ]。正因为构成血管
与对照组比较: 3 P < 0105　3 3 P < 01013 P < 0105　3 3 P < 0101 vs con tro l group
图 2　缺氧条件下 HSYA 对犬胸主动脉 VEC 增殖的影响
(x±s, n= 6)
F ig. 2　Effect of HSYA on prol iferation of can ine
aortic endothel ia l cells in hypox ic culture
(x±s, n= 6)
内壁的内皮功能与新生血管的关系密切, 所以20 年
来有关新生血管研究的体外实验多集中在V EC 的
相关研究上, 故 V EC 的增殖和分化也一直被认为
是血管新生的最重要环节之一, 也是药物治疗心脑
梗死性疾病的重要靶区。前期实验结果[5 ] 表明,
H SYA 可明显增加缺血脑组织内的微血管密度
(M VD ) , 且M VD 与脑梗死区的面积比成负相关,
提示 H SYA 抗脑缺血作用与其促血管新生有关。
由于 V EC 的增殖是新生血管形成的必要条
件, 因此 H SYA 促新生血管形成作用机制可能与其
促进 V EC 增殖有关。故研究采用体外常氧ö低氧
V EC 增殖两种模型, 观察到尽管 H SYA 均能促进
V EC 增殖, 但在作用时间方面有较大的差异。在常
氧条件下, 对照组与各给药组之间的 V EC 增值速
率相当, 在 96 h 时间点才见明显差异; 但在低氧的
条件下, 给药组 V EC 增值速率与对照组出现差异,
比在常氧条件下提前了 48 h, 说明体外低氧低糖这
种模拟体内缺血缺氧的人为条件, 的确可以作为一
个较好的体外促进 V EC 增殖的刺激因素; 同时本
实验结果也可以初步说明, 在正常动物体内观察到
H SYA 促血管新生所需的用药剂量比在缺血缺氧
模型动物达到同样效果的实验用药量大得多。但是,
血管新生并不是简单的 V EC 的生长, 它还包括
V EC 的迁移、分化、排列以及周围细胞的生长等一
系列复杂过程, 更何况 V EC 的迁移、分化、排列以
及周围细胞的生长等一系列复杂过程, 更何况V EC
的增殖和迁移是同步发生的, 新生血管正是依靠这
两个过程来增加发育过程中血管的长度, 增殖的
V EC 随即整合到新血管的中间部分。由于本研究只
发现 H SYA 具有促进 V EC 增殖作用, 但尚未进行
·29· 中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 1 期 2008 年 1 月
有关 H SYA 对新生血管生成过程中其他环节如
V EC 迁移、黏附等方面的作用, 因此对于 H SYA 是
如何通过促进V EC 增殖途径导致新血管生成的具
体机制仍不清楚, 需要在今后的实验中进一步阐明。
V EGF 已被证实具有强大促 V EC 增殖作用,
其可由内皮细胞释放, 特异性作用于V EC, 是当今
发现的最强的内源性 V EC 分裂原[11 ]。H SYA 在
1×10- 3 mo löL 浓度下与 V EGF 216×10- 7 mo löL
在各时间点对 V EC 的促增殖作用强度相当, 表明
H SYA 作为天然化合物, 对 V EC 增殖有着较强的
活性, 这可能是其促新血管生成的细胞学基础。从本
实验结果可以进一步考虑, 在当今从天然药物中寻
找高效低毒的治疗心脑梗死性疾病药物的国际呼声
日趋高涨的形势下, 与国外运用的高通量活性筛选
方法相比, 以传统的活血化瘀类中药作为切入点, 则
不失为寻找开发促血管新生药物的一条捷径。
致谢: 山东省天然药物工程技术研究中心马成
俊博士提供 H SYA。
参考文献:
[ 1 ]　GibaldiM 1 Regulating angiogenesis: a new therapeu tic strat2
egy [J ]1 J C lin P harm acol, 1998, 38: 89829031
[ 2 ]　H endel R C, H enry T D , Rocha2Singh K, et a l. Effect of in2
traco ronary recom binan t hum an vascu lar endo thelial grow th
facto r on m yocardial perfusion: evidence fo r do se2dependen t
effect [J ]1 C ircu la tion , 2000, 101: 11821211
[ 3 ]　臧宝霞, 金　鸣, 李金荣1 羟基红花黄色素A 抗凝作用的研究
[J ]1 中草药, 2007, 38 (5) : 74127431
[ 4 ]　金　鸣, 李金荣, 吴　伟1 羟基红花黄色素A 抗氧化作用的
研究 [J ]1 中草药, 2004, 35 (6) : 66526661
[ 5 ]　Zhu H B, W ang Z H , M a C J , et a l. N europ ro tective effects
of hydroxysafflo r yellow A : in v ivo and in v itro studies [J ]1
P lan ta M ed , 2003, 69: 42924331
[ 6 ]　Gargett C E, Bucak K, Roger P A 1 Iso lation, characteriza2
t ion and long2term cu ltu re of hum an m yom etrial m icrovascu2
lar endo thelial cells [J ]1 H um R ep rod , 2000, 15 (2) : 2932
3011
[ 7 ]　徐叔云, 卞如濂, 陈　修1 药理实验方法学 [M ]1 第3 版1 北
京: 人民卫生出版社, 20021
[ 8 ]　陈丽华, 金伯泉, 贾　卫, 等 1 一种新的人内皮细胞可诱变性
粘附分子 PTAL 的表达、调变及粘附功能 [J ]1 细胞与分子
免疫学杂志, 2000, 16 (1) : 232261
[ 9 ]　司徒镇强, 吴军正 1 细胞培养 [M ]1 西安: 世界图书出版公
司, 19961
[ 10 ]　Schum acher B, Pecher P, von Spech t B U , et a l. Induction
of neoangiogenesis in ischem ic m yocardium by hum an grow th
facto rs [J ]1 C ircu la tion, 1998, 97 (7) : 64526501
[ 11 ]　Ferrara N , Gerber H P, L eCouter J1 T he b io logy of V EGF
and its recep to rs [J ]1 N at M ed , 2003, 9: 66926761
鼠尾藻多酚的抗肿瘤活性研究
魏玉西1, 孙　峋2, 王长云3, 王春波1Ξ
(11 青岛大学医学院, 山东 青岛　266071; 21 青岛大学 科研处, 山东 青岛　266071;
31 中国海洋大学医药学院 海洋药物研究所 海洋药物教育部重点实验室, 山东 青岛　266003)
摘　要: 目的　研究鼠尾藻 S arg assum thunberg ii 多酚对肺癌 A 2549 细胞和肝癌 BEL 27402 细胞体外增殖的抑制
作用。方法　采用有机溶剂提取、透析法获得鼠尾藻多酚 ST K1 (相对分子质量> 1×104) 和 ST K2 (相对分子质
量< 1×104) , 采用磺酰罗丹明 B (SRB ) 蛋白染色法检测体外细胞增殖抑制率。结果　ST K1 在质量浓度为 8715ΛgömL 时, 对 A 2549 和BEL 27402 细胞增殖的抑制率分别为 9017% 和 8913% ; ST K2 在质量浓度为 340 ΛgömL
时, 对A 2549 和BEL 27402 细胞增殖的抑制率分别为 8919% 和 9011%。在相同质量浓度下 ST K1 比 ST K2 活性
强。结论　鼠尾藻多酚化合物 (ST K1 和ST K2) 对人肺腺癌A 549 细胞、人肝癌BEL 27402 细胞均有较强的抑制作
用, 相对分子质量高的 ST K1 具有更强的抑制活性。
关键词: 鼠尾藻; 多酚; 肺癌 A 2549 细胞; 肝癌BEL 27402 细胞; 增殖
中图分类号: R 286191　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 025322670 (2008) 0120093203
　　鼠尾藻 S a rg assum thunberg ii (M ert. ) O.
Kun tze 是一种广布于我国沿海的一种褐藻, 系统分
类上隶属于马尾藻科、马尾藻属。该藻集生于中潮带
和低潮带岩石, 或在高、中潮带的水陆或石沼中。研
究表明, 鼠尾藻中除富含胶质、甘露醇、碘、钾、锌、铜
等有效成分外, 尚含有由间苯三酚作为单体组成的
褐藻多酚类物质, 它们作为次级代谢产物具有许多
生物活性, 如抗氧化[1, 2 ]、抑菌[3 ]、拒食等[4 ]。因此, 鼠
尾藻除在海洋生态系统中占有重要地位外, 在医药、
保健、水产养殖及化学工业等行业中也具有许多可
开发的潜力[5, 6 ]。到目前为止, 对鼠尾藻的抗肿瘤活
性研究多以多糖成分或粗提物为研究对象, 如鼠尾
·39·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 1 期 2008 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2007203201
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30572314) ; 山东省优秀中青年科学家科研奖励基金资助项目 (BS07002)
作者简介: 魏玉西 (1964—) , 男, 山东青岛人, 博士, 教授, 研究方向为海藻化学与海洋药物。
T el: (0532) 85953227　E2m ail: yux iw 729@ 163. com