全 文 ：·经验交流·
田基黄 、冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞系
CNE细胞毒作用的研究
肖大江　朱国臣　王晓岚　张亚男　黄红宇
【摘要】　目的　观察田基黄 、冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞系 CNE细胞生长增殖的影响。方法　利
用 SRB 法显色和光镜观察不同浓度田基黄 、冬凌草甲素对 CNE 细胞的细胞毒作用。结果　田基黄 、冬
凌草甲素对 CNE 细胞生长有明显的抑制作用 ,且抑制率均随着浓度的增加而增加。结论　田基黄 、冬
凌草甲素可能对鼻咽癌有较好的治疗作用。
【关键词】　鼻咽癌　田基黄　冬凌草甲素　SRB 法显色
　　鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一 , 居耳鼻喉科恶性肿
瘤的首位。临床治疗以放疗为主 ,化疗为辅 , 而人鳞癌细胞对
放射线中度敏感 ,照射剂量达 40 ～ 60Gy 才能达到控制目的 ,
化疗也多采用大剂量毒性强的化学药物 ,对人体损伤较大。
因此 ,利用有效的抗肿瘤天然药物和放射治疗的协同作用 ,增
强疗效 ,降低毒副作用 , 在头颈部鳞癌的治疗中具有广阔的运
用前景。有研究表明 , 田基黄 、冬凌草甲素对人舌癌细胞株
TSCCa、结肠癌 HCT8 等有抑制生长作用[ 1-3] 。 我们以人鼻
咽癌细胞系 CNE为研究对象 , 通过 SRB法和光镜观察检测田
基黄 、冬凌草甲素对 CNE细胞生长增殖的影响 ,现报道如下。
1　材料和方法
1.1　肿瘤细胞系　人鼻咽癌细胞系 CNE 由中国科学院上海
细胞生物所提供。
1.2　主要试剂　田基黄注射液由江苏常熟制药厂提供(以 1
g/ ml计算),冬凌草甲素(纯度〉98%)由中国科学院昆明植物
研究所提供 , 实验时以培养液稀释成不同浓度备用。 Sul-
phorhodamine(S RB)由美国 Sigma公司提供。
1.3　细胞培养　将增殖良好并处于对数生长期的 CNE 细胞
经 0.25%胰酶及 EDTA 各半的消化液分散后计数 , 制成细胞
悬液 ,接种于 96 孔板内 , 100μl/孔。预培养 24 小时后 , 每孔
加入不同浓度的田基黄 、冬凌草甲素 100μl/孔。每个药物浓
度设 6个复孔 ,并设空白对照(RPM I 1640 培养液)和正常对
照(不加药物 , 加等量生理盐水)孔 , 置于 37 ℃、5%CO2 培养
箱在全湿条件下培养。
1.4　SRB 法显色　CNE 细胞在全湿条件下培养 48 小时 ,参
照 Skehan s 法 , 取出培养板 ,每孔加入 50%的三氯醋酸 50μl
固定细胞 ,轻柔地加在每孔液面上 ,然后在 4 ℃冰箱中放置 1
小时。培养板各孔用三蒸水洗涤 5 遍 , 以去除三氯醋酸。在
空气中干燥后 ,每孔加入 0.4%SRB100 μl , 室温下放置 30 分
钟 ,弃去各孔内液体后用 1%乙酸洗涤 5 遍 , 去除未结合的染
料 ,空气中干燥后用 pH10.5 , 10 mmol/ L 三羟甲基胺基甲烷
基金项目:江苏省高校自然科学研究基金指导性项目(04KJD320120)
作者单位:南京医科大学附属无锡第二医院耳鼻咽喉头颈外科(肖大
江 、朱国臣);中心实验室(黄红宇)
江南大学医学院药理学教研室(王晓岚)
苏州大学附属无锡第四医院科教科(张亚男)
邮　　编　214002　　收稿日期　2005-09-15
溶解 , 在平板振荡器上振荡 5 分钟 ,在酶联免疫检测仪上测定
OD值 , 用空白对照调零 ,所用波长 509 nm。计算出药物对细
胞生长抑制率(IR)。
IR=(对照组 OD值-实验组 OD值)/对照组 OD值×
100%
1.5　细胞形态学观察　CNE 细胞在全湿条件下培养 24 小
时 , 用倒置显微镜下观察细胞的形态变化。
2　结果
2.1　田基黄 、冬凌草甲素对 CNE 细胞的细胞毒作用　根据
测得的 OD值 , 计算出田基黄 、冬凌草甲素在不同浓度下对
CNE 细胞的抑制率。田基黄取 25 mg/ ml、50 mg/ ml、100 mg/
ml 、250 mg/ ml、500 mg/m ld 浓度时 , CNE 细胞的抑制率分别
为 3.58%、22.95%、53.86%、78.32%、90.43%。冬凌草甲
素取 12.5、25 、50 、100 、200 μmo l/ L 浓度时 , CNE 细胞的抑制
率分别为 13.78%、53.51%、68.92%、77.84%、91.26%。可
以看出田基黄 、冬凌草甲素对 CNE 细胞生长抑制率均随着浓
度的增加而增加 , 田基黄 、冬凌草甲素的半数抑制率 IR50 分
别约为 100 mg/ml 、25μmo l/ L。
2.2　形态学变化　倒置显微镜下观察 , 对照组 CNE 细胞胞
质均匀 , 核仁清楚 ,伸展性好 , 生长良好 ,形成致密贴壁的多角
形细胞。用药组 CNE 细胞胞质混浊 , 细胞呈圆形 ,体积缩小 ,
折光性差 , 细胞悬浮 、脱落而死亡 。
3　讨论
近年来 , 寻找有效的抗肿瘤天然药物成为研究的热点之
一。田基黄是金丝桃属植物地耳草的全草提取物 , 临床上广
泛应用于急性黄疸型和非黄疸型肝炎的消炎解毒[ 4] 。而关于
田基黄抗癌作用的报道鲜见 ,仅见 1997 年金辉喜等用 M TT
法研究发现田基黄对人舌癌细胞株 TSCCa 抑制细胞生长 , 推
测作用机制可能是药物通过干扰肿瘤细胞内线粒体和粗面内
质网而导致细胞死亡[ 1] 。冬凌草甲素是从冬凌草中提取出来
的有效抗癌成分 , 其主要化学结构是一种四环二萜类化合物 ,
有研究表明对白血病 ,以及食管癌 、肝癌 、结肠癌等有一定的
疗效 , 作用机制可能为:通过多种途径抑制肿瘤细胞的增殖 ,
诱导细胞凋亡[ 5] 。本研究结果显示田基黄 、冬凌草甲素两种
药物对体外培养的人鼻咽癌 CNE 细胞的生长明显的杀伤作
用 , 并且随着药物浓度的增加其杀伤能力增强 , 当药物浓度分
别达到 500 mg/ml和 200μmol/ L ,对癌细胞的生长抑制率超
·1396· Journal of Q iqihar Medical Co llege , 2005 , Vol.26 , No.12
支气管内膜结核 32例临床诊断方法的比较
郑桂林
【摘要】　本文对 32 例经纤维支气管镜(纤支镜 ,简称 FB)确诊支气管内膜结核(EBTB)患者的临床
表现 ,胸部 X 线(CT)、痰菌检查 , 纤支镜结果等诊断方法作了比较。 32 例中主要症状包括:咳嗽 27 例 、
发热 8例 、咯血 2 例 、胸痛 10 例 、气促 8例 、消瘦 6 例。 8例 X 线表现正常 , 3 例 C T 提示 EBTB ,纤支镜
检查示:炎症浸润型 12 例(37.50%),溃疡型 8 例(25.00%), 增殖型 10 例(31.25%), 狭窄闭塞型 2 例
(6.25%)。 32例均行 3次痰涂片抗酸杆菌检查 , 仅 2 例阳性 , 但经 FB 刷片行抗酸杆菌检查阳性达 28
例 ,病理活组织检查 16 例证实为结核的 10 例。结论 , EBTB缺乏特异性临床表现 , 胸部 X线表现正常
不能排除 EBTB , CT 诊断价值不高 ,确诊主要依靠纤支镜检查。对不明原因低热和呼吸道症状经积极
治疗无效者 ,应怀疑 EBTB 而及时行纤支镜检查。行镜下常规刷检找抗酸杆菌和(或)组织活检阳性率
高 ,且简便快捷 , 值得推广使用。
【关键词】　结核　支气管　支气管镜检查
　　对我院自 1995 年 3月～ 2004 年12 月有337 人次行纤维
支气管镜检查 ,确诊支气管内膜结核 32 例 , 约占 9.50%。现
整理分析报道如下。
1　临床资料
1.1　一般资料　本组 32 例均经 FB 活检病理和(或)FB刷检
涂片找到抗酸杆菌确诊为结核者。其中男性 19 例 , 女性 13
例 ,男女之比:1.46:1 ,年龄20～ 70岁 ,平均年龄 43岁 , 45岁以上
24 例,占 75.00%,其中男性 18例 ,提示老年患者男性多见。
1.2　临床表现　就诊时病程在 3 个月以下 18 例 , 3 个月以
上 14 例。主要症状依次为咳嗽 27 例(其中干咳 24 例 , 刺激
性干咳 3例),发热 8例 , 咯血或咳血丝痰 2 例 ,胸痛 10 例 ,气
促 8 例 ,消瘦 6 例。
1.3　胸部 X 线(或 CT)检查结果　提示肺炎 8 例 , 局限性肺
不张和肺结核 7 例 ,慢性支气管炎 3 例 , 胸片大致正常 7 例。
尚有不能明确诊断的肺部阴影 7 例。仅 3例 C T 提示 EBTB。
2　结果
32 例行纤支镜检查均经刷检找到抗酸杆菌确诊或活检
病理证实。 炎症浸润型 12 例(37.50%)溃疡型 8 例(25.
00%),增殖型 10 例(31.25%), 狭窄闭塞型 2 例(6.25%)。
细菌及组织学检查:32例均行 3次痰涂片抗酸杆菌检查 ,仅 2
例阳性。但经 FB 刷片行抗酸杆菌检查阳性达 28 例 , 病理活
组织检查 16 例 , 证实为结核的 10 例。
作者单位:福建省莆田学院附属医院呼吸内科
邮　　编　351100　　收稿日期　2005-08-11
3　讨论
近年来 EBTB 发病率逐渐增高 , 其临床误诊或漏诊率也
很高。 EBTB延误治疗可致性支气管狭窄甚至严重的呼吸困
难 , 肺不张和继发性肺炎 , 早期抗结核化疗可以有效治疗
EBTB 并有可能预防上述并发症的发生 ,因此 EBTB 重在早
期诊断和早期治疗。由于目前 EBTB 尚缺乏特异性的临床特
征 , 且常规多次痰涂片找抗酸杆菌阳性率低 , 这可能是支气管
粘膜下浸润 , 粘膜仅有充血 、水肿 、增殖性病灶趋向静止 , 或肉
芽组织及坏死组织覆盖 , 阻塞近端支气管致引流不畅 , 痰菌不
易排出之故 , 从而给 EBTB 早期诊断带来一定困难。 X线对
EBTB 的诊断往往通过合并肺结核而得到线索 , X 线表现正
常不能排除 EBTB ,怀疑 EBTB 行 C T 检查 , 也难以确诊 , TB
检查:刷片行抗酸杆菌检查阳性率达 87.50%。病理活组织
检查阳性率达 62.50%。因此 EBTB 经纤支镜检查确诊率
高 , 便以早期诊断及治疗 , 预防其严重的并发症 ,对临床怀疑
EBTB者 , 胸部 X 线正常不能排除 EBTB , CT 诊断价值不高 ,
确诊主要依靠纤支镜检查。对不明原因低热和呼吸道症状经
积极治疗无效者 , 应怀疑 EBTB 而及时行纤支镜检查。行镜
下常规刷检找抗酸杆菌和(或)组织活检阳性率高 , 且简便快
捷 , 值得推广使用。
参　考　文　献
[ 1] 　中华结核和呼吸杂志编辑委员会.第一届全国纤维支气管镜学
术会议纪要[ J] .中华结核和呼吸杂志 , 1994 , 17:326-328
[ 2] 　林耀广 ,赵文理 ,姚红 ,等.支气管内膜结核在纤维支气镜下的特
征[ J] .中华结核和呼吸杂志 , 1989 , 12:329-332
过 90%。而田基黄 、冬凌草甲素具有价格低廉 、毒副作用小 ,
能长期使用等优点。若与放射治疗联合用于鼻咽癌的治疗 ,
可望提高疗效 ,缩短疗程 ,减少放射治疗的并发症 , 有一定的
临床应用前景。本研究对其作用机制拟行进一步探讨。
SRB显色法是 NCI 近年来推荐的一种较新的筛选抗癌
药物的方法 ,其作用原理是:S RB 是一种蛋白结合染料 , 可与
经三氯醋酸固定后细胞蛋白质的碱性氨基酸结合而显色 , 呈
现一种明亮的粉红色 ,用酶联免疫检测仪测定吸光度 , 可提供
一个敏感的细胞蛋白含量的数值 ,以此来计算细胞的抑制率。
作者认为 , SRB 法与传统的 MT T 法相比 , 具有操作简便 , 没
有严格的时间限制性 ,灵敏度较高 ,稳定性和重复性好 ,无同位
素污染等优点 ,在体外抗癌药物敏感性研究中值得推广应用。
参　考　文　献
[ 1] 　金辉喜 ,李金荣.田基黄对人舌癌细胞株 TSCCa 细胞毒作用的
研究[ J] .临床口腔医学杂志 , 1997 , 13(1):19-20
[ 2] 　刘明月 ,范魁生 ,樊青霞 ,等.冬凌草甲素诱导结肠癌细胞凋亡的
实验研究[ J] .河南肿瘤学杂志 , 2004 , 17(3):167-8
[ 3] 　冯长伟 , 潘祥林 , 邹俊晖 , 等.冬凌草甲素对人白血病细胞系
K562细胞生长的抑制作用[ J] .山东中医药大学学报 , 2000, 24
(3):225-6
[ 4] 　傅蓬 ,田红丽 ,张卫东.田基黄的研究进展[ J] .药学实践杂志 ,
2004 , 22(2):98-101
[ 5] 　张典瑞 ,任天池.冬凌草甲素的药学研究进展[ J] .中国药学杂
志 , 2003 , 38(11):817-20
·1397·齐齐哈尔医学院学报 2005 年第 26 卷第 12 期