全 文 ：的差异 ,也产生了峰数量的差异 ,它们反映了大黄各
种炮制品内在的质量差别。大黄经过炮制后 ,其醇
提物中的游离蒽醌类成分发生了变化。本实验建立
的 H PL C 指纹图谱方法可以为大黄不同炮制品的
鉴定提供依据 ,可以作为大黄不同炮制品的内在质
控方法和标准。该方法亦可进一步为大黄的成分和
疗效间建立联系 ,为大黄的安全性评价与临床合理
应用提供参考。
参考文献 :
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半枝莲酸性多糖 SBPs 的纯化、性质及抗氧化活性研究
王志远 ,戴 　玲 3 ,朱业云 ,廖洪梅 ,张 　凯
(安徽大学生命科学学院 ,安徽省中药研究与开发重点实验室 ,安徽 合肥 　230039)
摘 　要 :目的 　研究半枝莲酸性多糖 SBPs 的纯化、性质及抗氧化活性。方法 　半枝莲烘干粉碎 ,经热水浸提 ,醇
析 ,去蛋白 ,去单寡糖后依次经 DEA E2Cellulose252 和 Superdex 200 纯化 ,所得多糖 SBPs 经快速色谱纯化系统
( FPLC)和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度 ,并利用 FPLC 测定相对分子质量 ,苯酚2硫酸法测定总糖的量 ,间羟联苯
法测定酸性糖的量 , GC2MS、红外光谱等方法对其组成和性质进行研究。同时采用邻苯三酚法及 Fenton 体系测定
SBPs 对 O2
Η
和 ·O H 的清除作用。结果 　SBPs 为均一组分 ,总糖、酸性糖的量分别为 96102 %和 19190 % ,平均相
对分子质量约为 1111 ×104 , GC2MS 分析其单糖组成为 :鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖 ,
物质的量的比依次为 1100 ∶0113 ∶0180 ∶0110 ∶0134 ∶0156 ∶3104。SBPs 清除 O2 Η和 ·O H 作用明显 , IC50分别
为 8001 00、90142μg/ mL 。结论 　SBPs 为酸性杂多糖 ,表现出较好的体外抗氧化活性 ,提示其可能具有抗衰老
作用。
关键词 :半枝莲 ;酸性多糖 ;纯化 ;理化性质 ;抗氧化活性 ;自由基
中图分类号 :R28412 ;R286102 ;R28616 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2009) 05 0728 04
　　半枝莲来源于唇形科黄芩属植物半枝莲 S cute2
l l ari a barbata D. Don 的干燥全草 ,具有解热、抗癌、
免疫调节等药理作用 ,其主要化学成分为黄酮类、二
萜类、多糖类等[1 ] 。早期研究表明从半枝莲中提取
的多糖组分在体外可促进 Con A 诱导的小鼠脾细
胞淋巴细胞转化[2 ] ,另有报道从半枝莲中提取的多
糖组分 SPS4 对 S180 肉瘤细胞及腹水肝癌细胞均有
一定的抑制作用[ 3 ] 。本实验从半枝莲中分离纯化得
到一酸性多糖 SBPs ,并对其性质和抗氧化作用进行
了研究 ,以期为半枝莲资源的进一步开发利用提供
理论依据。
1 　材料与方法
111 　材料 :快速色谱纯化系统 ( FPL C) 为 A KTA
Purifier 10 (瑞典 Pharmacia Biotech) ;气质联用仪
为 Shimadzu GC/ MS2010 , DB25 MS 毛细管柱 ;红 外光谱仪为 Nexus —870 (美国 Nicolet ) ;紫外/ 可见分光光度计为 Ult rospec 3100 pro (瑞典 PharmaciaBiotech) ; 电泳仪/ 槽为 Power/ PAC3000 和 MiniPRO TEAN3 Cell (美国 Bio2Rad) ; 凝胶成像系统Image MasterVDS(瑞典 Pharmacia Biotech) 。冻干燥机为 AL P HA 122 (德国 Christ ) 。半枝莲购自安徽合肥市皖健药房 ,由安徽大学生命科学学院何家庆教授鉴定为半枝莲 S . barbara D. Don ; Superdex200 10/ 300 GL 预装柱 , Pharmacia 公司产品 ;标准葡聚糖 (Dext ran) T500、T70、T40、T10 及蓝葡聚糖2000 均为 Sigma 公司产品 ; DEA E2Cellulose252 为Whatman 公司产品 ,其他试剂和标准单糖均为进口或国产分析纯。112 　方法11211 　半枝莲多糖的提取 :称取 40 ℃烘干粉碎的
·827· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
3 收稿日期 :2008209219　　　
基金项目 :安徽省自然科学基金资助项目 (03043301)
作者简介 :王志远 (1981 —) ,男 ,安徽人 ,硕士研究生 ,从事生化与分子生物学研究。E2mail : wangzhiyuan_810913 @126. com3 通讯作者　戴　玲　Tel : (0551) 5107341 　E2mail : dialing2 @ah163. com
半枝莲干粉 100 g ,用 2 000 mL 热水 (70 ℃)分别浸
提 3 次 ,合并提取液浓缩至 2 000 mL ,加 3 倍体积
的 95 %乙醇沉淀 ,静置 24 h ,离心。沉淀用无水乙
醇和丙酮各洗 2 次 ,用 Sevage 法去除蛋白、透析、干
燥得粗多糖。
11212 　半枝莲多糖的分离纯化 :将粗多糖溶于少量
蒸馏水 ,离心 ,上清液用 DEA E2Cellulose252 色谱柱
(216 cm ×50 cm) 分离 ,先用蒸馏水洗脱 ,再用 015
mol/ L NaCl 溶液洗脱 ,分管收集 (412 mL/ 管) 得水
洗和盐洗两种多糖组分。采用快速色谱纯化系统进
一步纯化盐洗组分 ,色谱柱 : Superdex 200 10/ 300
GL ,进样量 :1 mL (样品质量浓度为 15 mg/ mL) ,洗
脱液 : 含有 015 mol/ L NaCl 的 p H 712 ( 0102
mol/ L)磷酸缓冲液 ( PBS) ,体积流量 :115 mL/ min ,
检测波长 :205、260、280 nm ;分管收集 (012 mL/ 管)
洗脱液 ,并结合苯酚2硫酸法检测其吸收峰位 ,收集
管中的含糖部分 ,透析、浓缩、冷冻干燥得纯化多糖
SBPs。
11213 　SBPs 均一性鉴定 :聚丙烯酰胺凝胶电泳法
测定质量分数 ,分离胶浓度为 6 % ,电极液为 p H
819 的硼砂2硼酸缓冲液 ,先 10 mA 恒流 ,待溴酚蓝
指示剂进入分离胶后改为 150 V 恒压电泳 ,甲苯胺
蓝染色。FPL C 法测定质量分数 ,取 15 mg/ mL 纯
化多糖水溶液 ,过 Superdex 200 色谱柱 ,进样量为
011 mL ,水洗脱 (体积流量 110 mL/ min) ,检测波长
为 205、280 nm ,苯酚2硫酸法检测糖峰位。
11214 　SBPs 相对分子质量测定 :取 T 系列 Dex2
t ran 标准葡聚糖及蓝葡聚糖 2000 各 10 mg ,溶于 1
mL 、015 mol/ L NaCl 的 p H 712 (0102 mol/ L ) PBS
中 ,进样 011 mL ,采用 Superdex 200 色谱柱 ,体积
流量为 110 mL/ min ,每管收集 012 mL ,苯酚2硫酸
法显色 ,490 nm 处测其吸光度 ,测得洗脱体积 (V e)
和外水体积 (V 0 ) 。以相应的 V e/ V 0 为横坐标 ,各相
对分子质量 ( Mr)的对数值为纵坐标绘制标准曲线。
SBPs 溶解后 ,同法过柱 ,从标准曲线中查算相对分
子质量。
11215 　总糖及酸性糖的测定 :总糖测定采用苯酚2
硫酸法 ,以 Dext ran T40 作为标准。酸性糖测定采
用间羟联苯法 ,以葡萄糖醛酸作为标准。
11216 　紫外光谱和红外光谱检测 : 取精品多糖
SBPs 115 mg ,以适量蒸馏水溶解 ,用波长 200～400
nm 进行紫外扫描 ,以蒸馏水为对照。红外光谱检
测采用样品与 KBr 混合压片法 ,4000～400 cm - 1红
外光谱仪扫描。
11217 　糖组分分析 :取 3～5 mg 样品 ,放入 10 mL
试管中 ,加入 2 mol/ L 三氟醋酸 ( TFA) 2 mL ,充 N2
后封管 ,110 ℃下水解 3 h。水解液减压蒸干 ( < 40
℃) ,除尽 TFA。完全酸水解产物 NaB H4 还原 ,加
入数滴醋酸分解过剩的 NaB H4 ,减压浓缩还原液至
小体积 ,加入 013 mL 甲基咪唑和 2 mL 醋酐 ,进行
乙酰化。反应 30 min 后 ,加入 5 mL 水终止反应。
加入 2 mL CHCl3 萃取 ,萃取液减压浓缩进行 GC2
MS 分析。GC2MS 测定条件 : 载气及流量 : He ,
1 mL/ min ;进样口温度 : 280 ℃,气化室温度 : 280
℃,离子源温度 :200 ℃。柱温采用程序升温 :50 ℃
→(30 ℃/ min) →170 ℃→(3 ℃/ min) →220 ℃→
(10 ℃/ min) →280 ℃(保持 5 min) 。进样体积 :011
μL ,分流比为 100 ∶1。
11218 　SBPs 对 O2 Η自由基的清除试验[4 ] :取 415
mL 50 mmoL/ L p H 812 Tris2HCl 溶液于试管中 ,
加入不同浓度的多糖试样液 011 mL ,置于 25 ℃水
浴中预热 20 min ;加入经 25 ℃水浴锅中预热的 215
mmol/ L 邻苯三酚溶液 20μL ,以蒸馏水为空白 ,混
匀 ,准确反应 4 min ,立即用 10 mol/ L HCl 1 滴终止
反应 ,在 320 nm 测其吸光度 ( A i ) , 并计算清除率
( I) [ I = ( A 0 - A i ) / A 0 ×100 % , A 0 为空白吸光度 ]
11219 　SBPs 对 ·O H 自由基的清除试验 :按照
Smirnoff (1989)的方法[5 ] (有改动) 。反应体系中含
0103 %的 H2 O2 015 mL 、8 mmol/ L Fe2 + 的 ED TA
溶液 015 mL 、10 mmol/ L 水杨酸 015 mL 、不同浓度
的多糖试样液 011 mL ,最后加 H2 O2 启动反应 ,25
℃恒温水浴中反应 90 min 后向各管中加入 10
mol/ L HCl 112 mL 结束反应 ,再加入 015 g NaCl ,
补水至 6 mL 刻度处 ,混匀后加入冷乙醚 4 mL ,充
分混匀 ,静置分层后移取乙醚层 3 mL 于 10 mL 刻
度离心管中 40 ℃恒温水浴蒸干乙醚。依次滴加
10 %三氯乙酸 0115 mL , 10 %钨酸钠 0125 mL ,
015 %亚硝酸钠 (新鲜配制) 0125 mL ,放置 5 min 后
再加入 1 mol/ L KO H 0125 mL ,最后滴加去离子水
至 4 mL 处 ,混匀 ,空白用 011 mL 蒸馏水代替样液
于 510 nm 处测定吸光度 ( A i ) ,并计算清除率 ( I)
[ I = ( A 0 - A i ) / A 0 ×100 % , A 0 为空白吸光度 ]。
2 　结果
211 　半枝莲多糖 SBPs 的分离纯化 :半枝莲粗多糖
经 D EA E2Cellulose252 柱色谱和 Superdex 200 进一
步纯化 ,结果见图 1 ,可见 SBPs 为单一峰 ,峰形基本
对称。不同浓度样品缓冲液处理的 SBPs 在聚丙烯
酰胺凝胶电泳呈单一谱带 ,见图 2 ,证明 SBPs 为较
·927·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
纯且均一的组分。
212 　SBPs 的糖质量分数、组成和相对分子质量 :苯
酚2硫酸法测得 SBPs 的总糖质量分数为 96102 % ,
间羟联苯法测得其酸性糖的质量分数为 19190 %。
SBPs 的水解产物经 GC2MS 分析 ,主要由鼠李糖、
岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组
成 ,其物质的量比分别为 1100 ∶0113 ∶0180 ∶
0110 ∶0134 ∶0156 ∶3104。以 Dext ran 系列相对分
子质量对数 (lgMr) 对其在 Superdex 200 柱上的洗
脱体积与外水体积之比 (V e / V 0 ) 作图 ,得到标准曲
线 ,标准方程为 lgMr = - 11472 3 V e / V 0 + 71277 8 ,
r = 01991 8。从而计算得到 SBPs 的相对分子质量
为 1111 ×104 。
213 　紫外光谱和红外光谱 :精多糖 SBPs 在 200～
400 nm 紫外扫描图谱均显示为末端吸收 ,280、260
nm 处无紫外吸收 ,表明多糖中无蛋白、多肽及核
酸。SBPs 的红外光谱具有多糖的特征吸收峰 ,见图
3。3 423 cm - 1处有强的2O H 伸缩振动 ,2 927 cm - 1
处有强的2CH3 伸缩振动 ,1 620 cm - 1处有 C = O 非
对称伸缩振动峰 ,1 072 cm - 1 处有 O2H 变角振动
峰 ,760～740 cm - 1和 1 150～1 060 cm - 1有吸收峰 ,
为吡喃糖特征 ,在 877 cm - 1 处有吸收峰 ,证明存在
吡喃糖苷键。
214 　SBPs 对 O2 Η自由基的清除作用 :分别测定了
不同质量浓度的 SBPs、Vc 对 O2
Η
自由基的清除作
用 ,结果见图 4。以对 O2
Η
自由基有较强清除作用的
Vc 作阳性对照 ,从图 4 中可以看出 ,对 O2
Η
产生
　　　
50 %清除效应所需的 Vc 的质量浓度即 IC50 为
306118μg/ mL ,而 SBPs 的 IC50 为 800100μg/ mL ,
这说明该多糖在体外可以清除 O2
Η
自由基 ,具有清
除超氧阴离子自由基的抗氧化活性。
215 　SBPs 对·O H 自由基的清除作用 :测定不同质
量浓度的 SBPs 对·O H 的清除率 ,并与同质量浓度
的 Vc 进行比较 ,结果见图 5。由图 5 可知 ,SBPs 和
Vc 在该体系中均有很强的清除能力 , Vc 和 SBPs
的 IC50分别为 162110μg/ mL 和 90142μg/ mL 。在
低质量浓度范围内 ( < 0135 mg/ mL ) , SBPs 清除
·O H 能力优于 Vc ,随质量浓度增高 ,清除能力有
所下降 ,但仍保持在 50 %左右的清除率。
图 5 　SBPs 对羟自由基的清除作用
Fig. 5 　Scavenging effect of SBPs on ·OH
3 　讨论
用 015 mol/ L NaCl 从 DEA E2Cellulose252 柱
上洗脱的半枝莲酸性多糖 SBPs 用间羟联苯法测定
其酸性糖质量分数为 19190 % ,区别于孟延发等[3 ]
报道的半枝莲多糖 SPS4 和许益民等[6 ] 报道的半枝
·037· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
莲多糖 SBP ,后两者均为中性杂多糖 ,三者在单糖组
成中基本相同 ,但单糖的物质的量比以及相对分子
质量大小均存在一定的差异。据此推测 SBPs 为半
枝莲中又一多糖组分。
已发现大量不同来源的多糖在各种体内、体外
实验体系中均表现出良好的抗氧化作用[7 ] ,还可对
已有多糖化合物的结构修饰提高其抗氧化活
性[8 ,9 ] ,因此多糖是极具开发潜力的一类天然抗氧
化剂。在研究抗氧化多糖的过程中 ,不少研究提示 ,
多糖的抗氧化性可能是多糖抗衰老、降血糖、抗肿
瘤、抗辐射、增强免疫等功效的药理基础之一。多糖
的抗氧化作用与其组成和化学结构有关 ,也与药物
的质量分数、剂量有关 ,虽然目前对多糖的抗氧化机
制已有一些解释 ,但仍不是很清楚。本实验提取得
到的 SBPs 为一水溶性酸性杂多糖 ,具较好抗氧化
活性 ,含糖量达 96 % ,不含蛋白 ,Superdex 200 凝胶
过滤柱色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳均表明 SBPs 组
成均一且质量分数较高。这为进一步抗氧化机制和
构效关系的研究打下了基础。
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HPLC法测定丹皮酚制剂在犬体内血药浓度及生物利用度
智红英1 ,孙丽芳1 ,宋吉伦1 ,李桂生1 ,2 3 ,刘 　珂1 ,2
(1.山东绿叶天然药物研究开发有限公司 ,山东 烟台 　264003 ; 2. 烟台大学药学院 ,山东 烟台 　264003)
摘 　要 :目的 　研究丹皮酚 3 种制剂在犬体内的药动学及生物利用度。方法 　6 条犬采用三制剂三周期随机交叉
试验设计 ,分别单剂量口服对照制剂丹皮酚片 (R) 40 mg ;被试制剂丹皮酚软胶囊 ( T1 ) ;被试制剂丹皮酚滴丸 ( T2 ) ;
HPLC 测定血药浓度。结果 　T1 、T2 与 R 的主要药动学参数 : tmax分别为 (1142 ±0138) 、(0196 ±0110) 、(1108 ±
0120) h ; Cmax分别为 (2123 ±0150) 、(2156 ±0158) 、(1194 ±0140) μg/ mL ; t1/ 2 (ke) 分别为 (3109 ±0140) 、(2188 ±
0151) 、(2162 ±0152) h ; AUC0～12分别为 (11162 ±1107) 、(12157 ±1180) 、(10132 ±1163) h ·μg/ mL ; AUC0～∞分
别为 (14156 ±11 41) 、(15141 ±1170) 、(12170 ±2112) h ·μg/ mL 。相对生物利用度为 : T1 (11411 ±1413) %和
(11613 ±1511) % , T2 (12216 ±1214) %和 (12218 ±1319) %。结论 　药动学参数经多因素方差分析显示 AUC0～12 、
AUC0～∞、Cmax和 tmax在药物间有显著的统计学差异 ( P < 0105) ,双单侧 t 检验表明 ,两种被试制剂与参比制剂不
等效。
关键词 :丹皮酚 ;生物利用度 ;高效液相色谱法
中图分类号 :R286. 02 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2009) 05 0731 04
　　丹皮酚是牡丹根皮和徐长卿全草的有效成分 ,
具有镇静、催眠、镇痛、解热、抗炎、抗过敏、抗菌、降
压、止血、抑制血小板聚集等多种药理作用[1 ,2 ] 。其
在小鼠、大鼠、家兔、人体内的药动学研究文献已有
报道[ 3～6 ] 。为了探讨药物剂型对丹皮酚体内代谢过
程的影响 ,本实验采用反相高效液相色谱法测定了
丹皮酚片、丹皮酚软胶囊以及滴丸在犬体内的药2时
曲线 ,据此了解三者在犬体内的药动学特征和差异 ,
测算丹皮酚软胶囊和滴丸的相对生物利用度。
1 　仪器与材料
·137·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
3 收稿日期 :2008211222　　　
作者简介 :智红英 (1973 —) ,女 ,山东郓城人 ,主管药师 ,硕士 ,从事药代和毒代方面工作。
Tel : (0535) 2128672 　E2mail : zhihongying @126. com3 通讯作者　李桂生　Tel : (0535) 2108899 　E2mail : guisheng @luye2pharm. com