全 文 ：藏药马尿泡离体快繁技术研究
徐文华1 ,陈桂琛1 3 ,周国英1 ,2 ,孙 菁1 ,卢学峰1 3
(11 中国科学院西北高原生物研究所 ,青海 西宁 810001 ; 21 中国科学院研究生院 ,北京 100049)
摘 要 :目的 通过对马尿泡组织培养技术的研究 ,为马尿泡的快速繁殖提供技术支撑。方法 以马尿泡野生植
株上的休眠芽为外植体 ,将它们接种到一系列含有不同激素的培养基中。结果 外植体野生芽不易进入正常萌发
生长阶段 ,一旦进入正常阶段 ,能迅速进入生长状态 ,诱导野生芽分化的最适培养基是 MS + 62BA 210 mg/ L +
NAA 110 mg/ L ,且侧芽要比主芽分化得快 ,增殖率明显高于主芽的增殖率。25 d 转接 1 次 ,增殖倍数在 5 倍以上。
最适生根培养基是 1/ 2 MS + IBA 015 mg/ L ,诱导生根率达 96 %。无菌苗幼叶诱导愈伤组织最适培养基是 MS + 62
BA 015 mg/ L + NAA 015 mg/ L + 2 ,42D 110 mg/ L ,诱导率达 100 %。结论 一方面建立了稳定高效的马尿泡再生
体系 ,另一方面通过组织培养达到了其种质资源的保存。
关键词 :马尿泡 ;休眠芽 ;离体快繁 ;愈伤组织
中图分类号 :R28211 文献标识码 :A 文章编号 :025322670 (2009) 0220297204
Rapid propagation in a Tibetan medicine ———Przewalskia ta ngutica
XU Wen2hua1 , CH EN Gui2chen1 , ZHOU Guo2ying1 ,2 , SUN Jing1 , L U Xue2feng1
(11 Northwest Institute of Plateau Biology , Chinese Academy of Sciences , Xining 810001 , China ;
21 Graduate School , Chinese Academy of Sciences , Beijing 100049 , China)
Abstract : Objective To provide scientific basis for rapid p ropagation of Przew alski a t ang utica by
means of p reliminary st udy of t he tissue culture technique1 Methods U sing t he dormant wild buds f rom
P1 t ang utica as explant s to inoculate t he buds on a series of media , which contained various hormone con2
cent ration1 Results It was difficult for t he dormant wild bud to get into germinating and growing periods1
Conversely , it would rapidly develop1 MS + 62BA 210 mg/ L + NAA 110 mg/ L was the optimum medium
for inducing differentiation of t he dormant wild bud , and t he lateral bud was more appropriate for differen2
tiation t han t he apical bud , and t he rate of p roliferation of t he lateral bud was higher than that of the apical
bud1 The multiple of t he p roliferation was above five times if it was t ransferred every twenty five days1
1/ 2 MS + IBA 015 mg/ L was t he optimum medium for root induction , and the rate of t he root induction
was highly up to 96 %1 MS + 62BA 015 mg/ L + NAA 015 mg/ L + 2 , 42D 110 mg/ L was t he optimum
medium for inducing callus using t he young leaves of sterile seedling1 Conclusion A stable potential re2
generation system is established and t he idioplansm resources would be preserved by means of t he tissue
cult ure technique1
Key words : Przew alski a t ang utica Maxim1 ; dormant buds ; i n vi t ro rapid p ropagation ; callus
马尿泡 Przew alskia tangutica Maxim1 属茄科
(Solanaceae)马尿泡属 ( Przew alskia Maxim1 ) 多年生
草本植物 ,为我国特有属[1 ] ,属珍稀濒危物种。主要
分布于西藏、青海、四川、甘肃南部等海拔3 400～
4 900 m 的高山砾石地及较干旱的草原、路旁[2 ,3 ] 。马
尿泡是藏医常用药 ,是血栓形成性疾病的有效抑制
剂[4 ] ,在藏药经典《晶珠本草》中早有记载。其根、种
子及全草均可做药用 ,味苦、性寒 ,有毒。根含莨菪
碱、东莨菪碱、山莨菪碱 ,具有镇惊、消肿止痛、解痉、
治毒疮等药效[1～3 ] 。有关马尿泡的研究 ,早期的工作
主要集中于其分布及分类等方面[5 ,6 ] ,对其化学成分
方面的研究亦有一些报道[7～9 ] 。由于马尿泡在自然
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3 收稿日期 :2008205205
基金项目 :国家科技攻关计划中西部专项 (2001BA901A47) ;中国科学院“西部之光”人才培养计划 2007 年项目“青海珍稀濒危药材羌活
的原产地引种驯化研究”和中国科学院“西部之光”人才培养计划 2008 年项目“珍稀藏药桃儿七的离体快繁与种苗繁育关键
技术研究”。
作者简介 :徐文华 (1974 —) ,女 ,青海乐都县人 ,助理研究员 ,硕士 ,从事植物细胞组织培养和青藏高原特有药用植物资源培育方面的研
究。 Tel : (0971) 6159630 13897221729 E2mail :whxu02 @1631com3 通讯作者 陈桂琛 Tel : (0971) 6143900 E2mail :gcchen @nwipb1 ac1cn
界的数量有限 ,且传统的获取方式又以采集和消耗大
量的野生资源为代价 ,造成马尿泡资源的短缺。另外
由于马尿泡种子具有坚韧且厚的种皮 ,在自然状态下
很难自然萌发、生长。因此 ,本实验通过组织培养方
法对其进行研究 ,一方面有利于其种质资源的保存 ,
另一方面可为马尿泡的人工快速繁殖体系的建立提
供理论依据和技术路线。
1 材料和方法
111 实验材料 :2005 年 9 月从青海省果洛州 (海拔
约3 900 m) 采挖野生马尿泡植株带回实验室 ,取植
株上马尿泡芽为实验材料。
112 无菌培养体系的建立 :从野生马尿泡植物上切
取马尿泡芽 ,用软毛刷洗去表面泥土 ,自来水流水冲
洗 5 h 后 ,在超净工作台上用 012 % HgCl2 溶液消
毒 5～8 min ,其间不断摇动消毒容器 ,无菌水冲洗
4～5 遍后 ,用消毒滤纸吸干表面水分 ,备用。
将灭菌后的材料接种到 MS 无激素固体培养基
上 ,在 (25 ±1) ℃条件下暗培养。2～3 d 后及时转
移到成分相同的新培养基上继续培养 ,获得有效数
量的实验材料后进行下一步的实验。
113 培养条件
11311 培养基 :以 MS 为基本培养基 ,附加不同的
激素 ,蔗糖 30 g/ L ,琼脂粉 610 g/ L ,p H 518。
11312 培养条件 :温度为 (25 ±1) ℃,光源为日光灯 ,
光照强度为1 500～2 000 lx ,光照时间为 12 h/ d。
2 结果与分析
211 无菌材料的获得 :在植物组织培养过程中 ,外
植体材料的表面灭菌消毒是极其关键的一步 ,不同
部位材料消毒的时间是有所不同的。从表 1 结果可
以看出 ,将马尿泡芽在 012 % HgCl2 溶液中消毒 5
min 是最佳的 ,没有芽的污染和褐化死亡 ,成活率达
100 %。而消毒 4 min ,芽都受细菌和霉菌的污染 ,
消毒 6 或 8 min ,芽几乎全部褐化死亡。
表 1 不同消毒时间对芽的成活率影响
Table 1 Effect of different sterile duration
on bud′s survival rates
外植体数 消毒时间/ min 成活率/ % 污染率/ % 死亡率/ %
20 4 0 100 100
20 5 100 0 0
20 6 61 5 0 9315
20 8 0 0 100
212 不同培养基上芽分化的比较 :将获得的有效数
量的芽转移到编号为 F1、F2 和 F3 分化增殖培养基
上 ,实验结果 (表 2) 表明 ,在 F3 培养基上芽的生长
和分化率最好 ,芽的分化率达 100 % ,而在 F1 和 F2
培养基上芽生长缓慢 ,几乎不易分化 ,难以进入正常
生长阶段。F1 培养基中的芽培养 2 个周期后 ,逐渐
褐化至坏死。F2 培养基中的芽大部分褐化坏死 ,少
部分芽周围的侧芽有生长现象 ,但无明显分化迹象。
F3 培养基中的芽生长都较好 ,主芽上的侧芽逐渐分
化出 3～5 个小芽 (图 12a) 。而且 ,主芽外围的芽鞘
包得太紧 ,不利于芽的正常生长 ,所以应适当剥取主
芽外围的芽鞘 ,以便芽能快速进入正常生长阶段。
表 2 不同激素组合培养基上主芽的分化率
Table 2 Differentiation rates of apical buds on media
added with different phytohormones
编号
62BA/
(mg ·L - 1)
NAA/
(mg ·L - 1)
外植体数
芽的分化
率/ %
死亡率
/ %
F1 110 01 2 8 0 100
F2 210 01 5 8 131 5 50
F3 210 11 0 7 100 0
a2主芽分化出 2～3 个侧芽 b2侧芽分化出丛生芽
c2生根分化 d2生长旺盛的愈伤组织
a22 —3 lateral buds devived f rom apical buds b2cluster buds
differentiation f rom lateral buds c2root differentiation
d2calluses of growing vigorously
图 1 马尿泡组织培养系列图
Fig11 P1 t angutica tissue culture
培养基 F3 中有些芽生长较好 ,主芽上的侧芽
有明显分化迹象 ,将 F3 中主芽上形成的侧芽切割
后转接到 F3 培养基中 ,侧芽分化率极高 ,平均每个
芽每代可增殖 30 个芽以上 ,相比较而言 ,主芽的分
化率没有侧芽的高。将 F3 中侧芽切取 ,再分别接
种到 F1、F2、F3 中 ,统计结果见表 3。
从主芽上切取侧芽进行培养 ,侧芽生长较主芽
生长良好 ,生长迅速 ,易进入正常分化生长阶段 (图
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表 3 不同激素组合培养基上侧芽的分化率
Table 3 Differentiation rates of lateral buds on media
added with different phytohormones
编号 外植体数 死亡数 分化率/ % 平均每个外植体分化芽数
F1 10 1 100 1115
F2 8 0 100 313
F3 14 0 100 30
12b) ,而且侧芽在 F1、F2、F3 培养基上分化率都为
100 % ,明显高于主芽的增殖率。但从增殖的平均芽
数来看 , F3 中芽的增殖倍数是 F1 的 216 倍 , F2 的
911 倍 ,F3 激素组合最佳 ,也可以看出 ,在马尿泡芽
分化的过程中 ,62BA 和 NAA 都起了重要的作用。
所以 ,可以选定马尿泡野生芽的最适分化培养基为
MS + 62BA 210 mg/ L + NAA 110 mg/ L ,最佳培养
材料为主芽周围的侧芽。
213 再生苗的生根培养 :生根预试验表明 ,在马尿
泡生根培养中加入激素 NAA ,易促进愈伤组织的形
成 ,起始长根时间较迟 ,形成根细小 ,数量少 ,一般只
有 1～2 条。加入 62BA 对发根有明显的抑制作用。
因此本实验在诱导生根时 ,只加不同质量浓度的
IBA 做对比。
将增殖形成的高约 315～810 cm 的苗 ,接种到
1/ 2 MS 的固体培养基上进行诱根培养 ,附加 IBA ,
结果见表 4。
IBA 有助于马尿泡无菌苗生根 (图12c) 。1周
表 4 IBA对试管苗生根的影响
Table 4 Effect of IBA on rooting of tube2plantlets
编号 IBA/ (mg ·L - 1) 外植体个数 起始长根时间 7 d 时生根率/ % 28 d 时生根率/ % 平均根数 平均根长/ cm
G1 0 26 第 15 天 0 8 310 110
G2 015 33 第 7 天 15 96 515 510
G3 110 29 第 11 天 0 52 513 413
后马尿泡单芽基部膨大 ,膨大部位表面有颗粒状的
小突起 ,发白 ,为根原基突起。在 015 mg/ L IBA 作
用下 ,起始长根时间最早 ,7 d 时部分芽有 011～012
cm 的根长出 ,生根率为 15 %。而在 0、110 mg/ L
IBA 作用下 ,起始长根时间都较 015 mg/ L 的迟 ,且
1 周时的生根率都为 0。从 4 周后的生根率、平均每
个苗长根数及平均根长综合考虑 ,可以选定培养基
G2 为马尿泡诱导生根最适培养条件 ,其 IBA 条件
下 ,生根率达 96 % ,虽然在 G2 和 G3 培养条件下 ,
平均长根数和平均根长没有太大区别 ,但 G3 培养
基中的生根率却只有约 50 % ,明显不及 G2 的生根
率高。因此 ,通过马尿泡生根培养试验可以看出 ,激
素 IBA 有利于苗的生根 ,但控制其剂量是最重
要的。
214 愈伤组织的诱导和继代培养 :将野生芽增殖形
成的幼苗的幼叶切成 015 cm ×015 cm 大小的块 ,接
种于编号为 Ⅰ和 Ⅱ两种培养基上进行愈伤组织的诱
导 ,实验结果见表 5。
表 5 不同激素组合培养基上幼叶愈伤组织诱导
Table 5 Callus inducing of young leaf on media added with different phytohormones
编号
激素/ (mg ·L - 1)
2 ,42D NAA 62BA 接种的外植体数 10 d 时形成愈伤组织的外植体数 10 d 时诱导率/ % 3 周时诱导率/ %
Ⅰ 11 0 01 5 01 5 16 8 50 100
Ⅱ 21 0 01 2 01 2 23 11 4718 951 65
1 周后有小颗粒状的愈伤组织在外植体的切口
处或表面形成 ,颜色浅乳白色 ,且观察到叶基和叶柄
上形成愈伤组织要比叶尖上形成愈伤组织提前 5 d
左右。从 10 d 时愈伤组织的诱导率来看 ,诱导率分
别为 50 %和 4718 % , Ⅰ培养基好于 Ⅱ培养基 ,但差
异不明显。3 周后 ,2 种培养基上愈伤组织的诱导率
分别为 100 %和 95165 % ,颜色浅乳白色 ,呈疏松小
颗粒状 (图 12d) ,质地较硬 ,这种愈伤组织有利于芽
的分化。因此 ,可以得出 ,马尿泡愈伤组织的诱导对
所加激素的要求不是很严格 ,附加有激素 2 ,42D ,都
容易诱导出愈伤组织 ,而且愈伤组织的诱导率都很
高。而 62BA 和 NAA 对愈伤组织的诱导作用不是 很明显 ,但对促进愈伤组织的生长是很明显的。愈伤组织可在 Ⅰ培养基上连续继代培养 ,生长良好 ,增殖也快 ;而在 Ⅱ培养基上生长缓慢 ,逐渐有褐化发生 ,因此进一步证实 ,加入 NAA 对促进愈伤组织的快速生长是有利的。3 结论311 对我国特有单属单种、且仅分布于青藏高原的马尿泡的离体快繁技术进行了探讨 ,获得了马尿泡愈伤组织诱导、生长的最佳条件 ,并分析了影响马尿泡不定芽分化的主要因素 ,不同生长素对马尿泡愈伤组织诱导和不定芽分化的效果不同。312 降低无机盐的浓度有利于马尿泡无菌苗的生
·992·中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
根。选择适宜的生长素 ( IBA) 种类 ,且控制其剂量 ,
是进一步提高生根质量的关键。光照条件下马尿泡
的生根效果较好。
313 马尿泡野生植株上的休眠芽可以作为离体培
养的良好外植体。主芽周围基部的侧芽是适宜诱导
分化的最适外植体 ;无菌苗的幼叶、叶基和叶柄是适
宜愈伤组织诱导的最适外植体。马尿泡芽的最适分
化培养基是 :MS + 62BA 210 mg/ L + NAA 110 mg/
L 。最适生根培养基是 :1/ 2 MS + IBA 015 mg/ L +
蔗糖 3 %。愈伤组织诱导培养基 :MS + 2 ,42D 110～
210 mg/ L + NAA 012～015 mg/ L + 62BA 012～
015 mg/ L 。 参考文献 :[ 1 ] 中国科学院西北高原生物研究所1 藏药志 [ M ]1 西宁 : 青海人民出版社 , 19911[ 2 ] 刘尚武1 青海植物志 [ M ]1 西宁 : 青海人民出版社 , 19961[ 3 ] 黄玉清 , 杨琳琳1 药用植物资源研究成果集萃 [J ]1 植物杂志 , 1993 , 20 (2) : 82101[ 4 ] 王荷生 , 张镱锂1 中国种子植物特有科属的分布型 [J ]1 地理学报 , 1994 , 49 (5) : 40324171[ 5 ] 倪志诚 , 李 晖1 青藏高原及毗邻地区种子植物特有属中的重要经济植物 [J ]1 西藏科技 , 1995 , 3 : 47253 , 401[ 6 ] 郝日明1 试论中国种子植物特有属的分布区类型 [J ]1 植物分类学报 , 1997 , 35 (6) : 50025101[ 7 ] 王 环 , 潘 莉 , 张晓峰1 HPLC 法测定天仙子和马尿泡中3 中托烷类生物碱的含量 [J ]1 西北药学杂志 , 2002 , 17 (1) :92101[ 8 ] 沈 进1 两种药用植物化学成分及多肽二硫键形成方法的研究 [ D]1 成都 : 中国科学院成都生物研究所 , 20041[ 9 ] 胡尚连1 植物生物技术 [ M]1 成都 : 西南交通大学出版社 , 20041
桔梗种子的成熟生理动态研究
刘自刚 3
(商洛学院 生物医药工程系 ,陕西 商洛 726000)
摘 要 :目的 揭示桔梗种子成熟过程的生理动态变化 ,为桔梗良种的生产提供理论依据。方法 采用统一挂牌
分期取样 ,测定不同成熟度种子的千粒质量、发芽率、电导率、POD 活性和 MDA 的量。结果 桔梗开花后 55 d 千
粒质量达到最大为 11214 g ,但此时种子发芽率仅为 5310 % ,开花后 55～61 d 千粒质量开始逐渐下降 ,但发芽率却
迅速上升 ,61 d 时达到最大为 9313 % ,此时种子细胞膜结构完整性高 , POD 活性也最高 ,种子性能达到最佳状态。
结论 开花后 61 d ,桔梗种子可完全成熟 ,种子成熟过程中存在生理后熟现象 ,后熟期约为 6 d。
关键词 :桔梗 ;种子 ;成熟生理
中图分类号 :R28212 文献标识码 :A 文章编号 :025322670 (2009) 0220300204
桔梗 Pl at ycodon g randi f lorum (J acq1 ) A1
DC1 属于桔梗科桔梗属 ,多年生双子叶草本 ,是一
种药、食、赏兼用植物[1 ] 。近年来 ,桔梗抗衰老、抑
癌、抗虫杀菌和气味掩饰剂等功效相继被发现 ,使社
会对桔梗原材料的需求迅速增加 ,单靠野生桔梗资
源已不能满足需求。在此情况下 ,各地开展了桔梗
野生种驯化和桔梗规模化栽培技术的研究 ,但制约
桔梗生产发展的一个重要因素是其种源短缺问题 ,
目前 ,桔梗种子生产处于半原始的传统生产状态 ,种
子往往是药材生产的副品[1 ] ,或者从野生桔梗中直
接采集获得 ,所得的种子质量普遍较差 ,其千粒质量
平均仅 0183 g ,田间出苗率仅为 1 %左右 ,严重影响
了桔梗生产的发展[2 ] 。本实验针对桔梗生产中存在
的上述问题 ,研究桔梗开花后种子成熟的动态 ,探讨
桔梗开花后的天数与种子成熟度之间的关系 ,旨在
为桔梗的良种生产提供试验依据。
1 材料与方法
111 材料 :研究材料为陕西省商洛市境内 2 年生桔
梗地方种居群 ,2005 年 3 月播种 ,2006 年 4 月移栽。
试验地位于北纬 33154′,东经 109153′,地处秦岭南
坡受东南季风影响 ,年平均降水量 72515 mm ,平均
海拔 722 m ,砂壤土。最热为 7 月 ,平均气温 24 ℃,
最冷为 1 月 ,平均 013 ℃,年平均气温 1218 ℃。绝
对无霜期为 180 d 左右。
112 方法
11211 取样方法 :于 2007 年 7 月 23 日 ,在多年生
桔梗群体中选取当日开放花朵1 000朵 ,挂牌标记 ,
从开花后第 25 天开始取果实 ,之后每隔 3 d 取样 1
次 ,直到 9 月 28 日为止 ,共取样 15 次 ,每次取果实
60 个并分为两份 ,1 份测定种子千粒质量、发芽率、
·003· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
3 收稿日期 :2008204229
基金项目 :陕西省科学技术研究发展计划项目[ 2008 K16202 (01) ]。
作者简介 :刘自刚 (1975 —) ,男 ,汉 ,甘肃天水人 ,讲师 ,硕士 ,从事中草药种质资源及育种研究工作。
Tel :13991463731 E2mail :lzgworking @1631com