全 文 ：中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月·73·
丹参和山楂提取物含药血清对胆固醇代谢的影响
薛 洁，谢梅林+，顾振纶，张克平
(苏州大学医学院药理学教研室，江苏苏州 215123)
摘要：目的研究丹参和山楂提取物的调脂作用机制及其相互作用。方法 以正交设计L，。(2“)制备丹参和山
楂提取物的含药血清，采用两性霉素B细胞模型和RT—PCR方法，观察含药血清对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内
源性胆固醇合成和BRL肝细胞胆固醇7a一羟化酶(CYP7A)mRNA表达的影响。结果丹参75％乙醇提取物和
丹参氨水提取物在两性霉素B细胞模型实验中均能明显增加吸光度(A)值，同时亦能明显增加BRL肝细胞
CYP7AmRNA表达，而单独应用山楂各提取物对胆固醇代谢未见直接的作用，但对丹参各提取物有协同作用。结
论丹参提取物能够通过抑制内源性胆固醇合成和增加CYP7AmRNA表达发挥调血脂作用，而山楂提取物和丹
参提取物合用可产生有益的协同作用。
关键词：丹参；山楂；含药血清；胆固醇；胆固醇7a一羟化酶(CYP7A)
中图分类号：R286．26 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)01—0073一05
Effectsofserum—drugofRadixSalviaeMiltiorrhizaeandFructusCrataegi
extractsoncholesterolm tabolism
XUEJie，XIEMei—lin，GUZhen-lun，ZHANGKe—ping
(DepartmentofPharmacology，MedicalSchool，SuzhouUniversity，Suzhou215123，China)
Abstract：ObjectiveTostudythemechanismofblood—lipidregulationoftheffectivefractionsfrom
thextractsofRadixSalviae施Zf面砌izae(RSM)orFructusCrataegi(FC)，aswellastheirnteraction．
MethodsTheserum—drugofRSMandFCextractswerepreparedbyorthogonaldesignL16(215)．
AmphotercinBcellmodelandRT—PCRmethodwereusedtoexaminetheffectsoftheserum—drugof
RSMandFCextractsonendogenousch lesterolbiosynthesisinCh nesehamsterovary(CHo)cellsand
thexpressionsofcholester017u—hydroxylase(CYP7A)mRNAinBRLcells．ResultsEthanol(75％)
andammoniaextractsofRSMobviouslyincreasedthabsorbance(A)inthe xperimentofamphotercinB
cellmodelandthexpressionofCYP7AmRNAinBRLcelline．TheextractsofFChadnodirecteffect
oncholester01metabolismbythemselves。buttheywereinsynergismw ththeextractsofRSM．
ConclusionThextractsofRSMhavea blood—lipidregulationbyi hibitingendogenouscholesterol
biosynthesisandincreasingCYP7AmRNAexpression。andmaybehaveabettereffectwhenthextracts
ofFCareusedtogether．
Keywords：RadixSalviaeMiltiorrhizae(RSM)；FructusCrataegi(FC)；serum—drug；cholesterol；
cholesterol7a—hydroxylase(CYP7A)
消瘀片是由丹参水溶性提取物和山楂脂溶性提
取物按一定比例组成的具有调脂作用的纯中药复
方，经动物实验和临床研究证实其具有较好的降血
脂和抗动脉粥样硬化作用[1~3]。本课题组通过正交
设计确定了丹参75％乙醇提取物、丹参氨水提取
物和山楂丙酮提取物为调血脂的有效部位，而山楂
无水乙醇提取物为调血脂辅助部位[4]。在本研究中，
以丹参和山楂的这4个提取部位制备含药血清，在体
外观察对细胞内源性胆固醇合成和肝细胞胆固醇
7a一羟化酶(CYP7A)mRNA表达的影响，以进一步
阐明它们的调脂作用机制以及它们之间的相互关系。
1材料
1．1 药物：丹参75％乙醇提取物(含丹参素
15．6％)，棕色粉末；丹参氨水提取物(含丹参总酚
酸81．9％)，棕褐色晶体；山楂丙酮提取物(含山楂
总三萜酸69．4％)，棕黄色粉末；山楂无水乙醇提取
物(含山楂总黄酮10．3％)，淡黄色粉末，以上提取
物均由苏州中药研究所提供。舒降之(辛伐他汀
片)，规格每片20mg，由杭州默沙东制药有限公司
提供，批号02098。注射用两性霉素B，由华北制药
收稿日期：2006—05—09
基金项目：苏州大学医学发展基金资助项目(N0010721)
作者简介：薛洁(1976一)，女，江苏常熟人，助教，在读博士生，研究方向为心血管药理学。E—mail：xuejie@suda．edu．cn
*通讯作者谢梅林Tel：(0512)65880320E—mail：xiemeilin@suda．edu．ca
万方数据
·74· 中草喃 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月
集团新药研究开发有限责任公司提供，批号
030201。甲羟戊酸内酯(MVA)，由Sigma公司提
供，批号071K2617。
1．2 试剂与仪器：无脂蛋白血清(LPDS)，由
Sigma公司提供，批号062K9301，规格：蛋白29．7
mg／mL；Trizol总RNA提取液、M—MLV逆转录酶
(200U／uL)、Taq聚合酶(3U／uL)、dNTP(10
mmol／L)、琼脂糖等均购自上海生工生物工程有限
公司；MTT液，由上海华美生物工程公司提供，批
号0310，将MTT按5mg／mL溶于PBS中。5410
型CO：培养箱，NAPCO公司；XD一20型倒置显微
镜，重庆光学仪器厂；DG--3022型酶联免疫测定
仪，国营华东电子管厂；GeneAmp2400型PCR仪，
美国PerkinElmer公司；DYY一8B型稳压稳流电
泳仪，北京市六一仪器厂生产；DYY一11I31D型电
泳槽，北京市六彳仪器厂生产。
1．3 细胞株：中国仓鼠卵细胞(Chinesehamster
ovary，CHO)，由苏州大学医学院生化教研室惠赠；
大鼠BRL肝细胞购自中国科学院细胞生物研究所。
1．4动物：SD大鼠，雄性，体重22050g，苏卅
大学实验动物中心供应，清洁级，实验动物生产许可
证号：XCYK(苏)2002—0008，实验动物使用许可证
号：SYXK(苏)2002—0037，实验期间饲养室温度
(18土2)oC。
2方法
2．1 制备丹参和山楂各提取物的含药血清：以4
因素2水平(表1)经正交设计L。。(215)(表2)得到
的16个组方以及正常血清组和阳性药组(辛伐他
汀)共18个血清制备组，除正常血清组外，其余各
组按各自的给药剂量，以1mL／100g给大鼠ig，每
组大鼠3只。给药时间为上、下午各1次，连续给药
3d，于第4天给药1h后，无菌操作下腹主动脉取
血，静置数分钟，1700×g离心，取血清，各组血清
分别混合，56℃灭活30min，0．22肛m滤过除菌，
分装，一70℃保存。
表1因素水平
Table1 Factorsandlevels
2．2 丹参和山楂各提取物含药血清对CHO细胞
内源性胆固醇合成的影响
2．2．1实验准备：A液为RPMI一1640培养液(含
谷氨酰胺300弘g／mL及10％小牛血清)；B液为A
液中去除小牛血清加入10％LPDS；C为B液中分
别加入不同的含药血清(150牡L含药血清加入到
1．35mLB液中)以及0．025mol／LMVA；D液为
B液中加入两性霉素B(300btg／mL)。
2．2．2实验分组：丹参和山楂各提取物按正交设计
L。。(215)得到的16个组方的含药血清以及正常大鼠
血清组和阳性药(辛伐他汀片)含药血清组，每组
重复6次。
2．2．3实验步骤：采用CHO，使用A培养液，将细
胞先在37℃、5％CO。培养箱中培养，待细胞基本
铺满瓶底后消化制成细胞悬液，悬液直接用A培养
液调整细胞浓度为lx105／mL，接种于96孔板中，
每孔加100肛L，待细胞贴壁后换用B培养液每孔
100弘L，第2天换用C培养液，继续培养24h后，用
PBS洗涤2次，然后加入D培养液，4h后，每孔加
入5mg／mLMTT液10肛L，继续培养4h，加入
10％SDS—HCl100pL终止反应，镜下观察细胞并
用酶联免疫检测仪测定吸光度(A)值。
2．3丹参和山楂各提取物含药血清对BRL肝细
胞CYP7AmRNA表达的影响：采用大鼠BRL肝
细胞培养，用10％小牛血清RPMI一1640培养液，
使培养液中含肝细胞1×106／mL，接种于6孔培养
板中，每孔加2mL细胞悬液，待细胞贴壁后换用含
10％LPDS培养液，24h后加入不同的受试含药血
清，继续培养24h后收获，提取总RNA。RT—PCR
反应：本实验采用的引物根据文献报道[5]，均由上海
生工生物科技有限公司合成。CYP7A：上游引物57一
GCCGTCCAAGAAATCAAGCAGT一37，下游引物
5，_TGTGGGCAGCGAGAACAAAGT一37，扩增产
物长度为306bp；GAPDH：上游引物57一
GCCATCAACGACCCCTTCATT一37，下游引物5L
CGCCTGCTTCACCACCTTCTT一37，扩增产物长
度702bp。PCR扩增反应过程：预变性95℃、5
min，变性95℃、30S，退火60℃、30S，延伸72℃、
40S，经30个循环，72℃、7min终止反应。PCR产
物(10弘L)于1．5％琼脂糖凝胶，加入溴化乙锭
(终质量浓度1ug／mL)，78V电泳1．5h，置紫外灯
下观察，用凝胶成像仪扫描图像。实验平行3份进
行，凝胶扫描图像采用BandLeader软件分析，以
GAPDH条带为内参照，实验数据以CYP7A／
GAPDH的值表示。
2．4统计学处理：实验数据以z土S表示，显著性检
验采用t检验和方差分析。
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月·75·
3 结果
3．1 丹参和山楂各提取物含药血清对CHO细胞
内源性胆固醇合成的影响：与正常血清组(o．793土
0．190)相比，两性霉素B损伤组(O．305士0．108)
的A值非常显著地降低(P
较，能明显增加A值(P<0．05)。丹参和山楂各提
取物按正交设计L。。(215)制备的16个组方含药血
清组的A值与两性霉素B损伤组相比，均有不同程
度的增加(P
他各提取物高剂量组合的组方其A值较高(表2
和图1)。方差分析结果表明，丹参75％乙醇提取物
和丹参氨水提取物对抑制内源性胆固醇合成有明显
表2丹参和山楂各提取物对CHO细胞内源性胆固醇生物合成抑制作用的正交及交互作用分析表(辟一6)
Table2 Analysesoforthogonalityandin eractionson nhibitionofeachextractofRSMorFC
onendogenousch lesterolbiosynthesisinCHOcells(一=6)
Fo．05(1，80)=3．96；Fo．01(1，80)一6．96+P
1．0
O8
趔O．6
弋
O4
0．2
O0
NMS 1 23 45 6 7 8 910111213141516
与正常血清组比较：△△P
N一正常血清组M一两性霉素B损伤组s一辛伐他汀含药
血清组 1～16一丹参和山楂提取物不同组合的含药血清组
△△P
N—normalserumgroupM—amphoterinBcellmodelgroup
S—serum—durgofSimvastatin1—16-serum—druggroup
ofRSMandFCextracts，respectively．
图1丹参和山楂提取物不同组合的舍药血清组对CHO
细胞内源性胆固醇生物合成的影响(工土s，n一6)
Fig．1Effectsofserum—drugofRSMandFCextracts
invariouscombinationsonendogenous
cholesterolbiosynthesisinCHOcells
(工士s，n一6)
作用(P
氨水提取物高剂量(44mg／kg)的作用最为明显。
山楂丙酮提取物与山楂无水乙醇提取物在单独应用
时未见有明显的抑制内源性胆固醇合成的作用，但
与丹参75％乙醇提取物和丹参氨水提取物合用均
有明显的协同作用(表2)。
3．2 丹参和山楂各提取物含药血清对BRL肝细
胞CYP7AmRNA表达的影响：各项PCR实验结
果中，GAPDH均有稳定的表达，因而可作为内参
照。BRL细胞经正交设计的含药血清16个组方处
理后，与正常血清组(0．975±0．380)相比较，
CYP7AmRNA表达不同程度的增加(P<0．05或
P<0．01)。方差分析结果显示：丹参75％乙醇提取
物和丹参氨水提取物呈明显上调作用(P<0．05)，
而单独使用山楂丙酮提取物和山楂无水乙醇提取物
未见有明显影响，但其与丹参75％乙醇提取物和
丹参氨水提取物合用有明显的交互作用(P<
万方数据
·76· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月
0．05)。本实验结果显示以丹参75％乙醇提取物、提取物高剂量的组合(相当于正交表中16号试验
丹参氨水提取物、山楂丙酮提取物和山楂无水乙醇 组)呈最明显的上调作用(表3和图2)。
表3丹参和山楂各提取物对BRL肝细胞CYPTAmRNA表达的正交及交互作用分析表“一3)
Table3 Analysesoforthogonalityandin eractionsoneffectofeachextractofRSMorFC
onCYP7AmRNAexpressioninBRLcells(H一3)
Fo05(1，32)一4．15’P<0．05
A一电泳图B—CYP7A／GAPDH值直方图与正常血清组比较：’P
A—agarosegelelectrophoretogramB—histogramofGYP7A／GAPDHratio’P<0．05’‘P
图2丹参和山楂提取物不同组合的含药血清组对BRLCYP7AmRNA表达的影响血一3)
Fig．2Efleetsofserum—drugofRSMandFCextractsinvariouscombinations
onCYP7AmRNAexpressioninBRLcells(拧一3)
4讨论
中药复方中，尤其是较粗的制剂中含有较多的
杂质，如直接加入体外反应体系，其酸碱度、渗透压、
鞣质和无机盐等非特异性理化因素将严重干扰实
验，导致实验的假阳性或假阴性结果，使实验结果的
可靠性和科学性受到很大的限制。在本实验中，采用
血清药理学方法，以中药复方的含药血清进行体外
的作用机制研究，为科学地阐明中药复方的作用及
其机制提供了新的研究方法。
两性霉素B细胞模型法为筛选内源性胆固醇
合成抑制剂提供了一种有效、简便的实验方法。两性
霉素B可与动物细胞膜上胆固醇形成复合物后出
现微孔，从而导致细胞膜破裂，胞浆内容物外溢。在
缺乏外源性胆固醇供给的条件下，若同时应用内源
性胆固醇合成抑制剂，内源性的胆固醇合成受到抑
制，则可阻止上述复合物的形成，使细胞免受两性霉
素B的杀伤[6]。在两性霉素B细胞模型中，A值越
高表明活细胞数量越多，两性霉素B对细胞的损伤
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月·77·
越少，说明在没有外源性脂质提供的条件下，细胞内
源性胆固醇合成受抑制。本实验结果显示，丹参提取
物能明显抑制内源性胆固醇合成，这可能是其调血
脂的作用机制之一。
降低血浆中的胆固醇，一方面可以通过减少胆
固醇的合成，另一方面也可以促进胆固醇转化为胆
汁酸。胆汁酸是胆固醇主要的代谢去路，胆固醇与胆
汁酸形成的乳糜微团又是其排出的主要方式，正常
人每天合成胆固醇的总量40％左右在肝内转化为
胆汁酸。在这一酶促过程中，胆固醇7a一羟化酶
(CYP7A)是其限速酶。
CYP7A属于细胞色素P450酶系，存在于细胞
内质网膜上，参与内源性化合物的氧化代谢。主要受
氧化类固醇和胆汁酸的调控，从而诱导或抑制其表
达，调控机制发生在CYP7A的转录水平，主要涉及
到一些核受体，如肝X受体[-liverXreceptor，LXR
(alpha)]和类法尼酯受体(farnesoidXrec pt r，
FXR)等，CYP7A在维持胆固醇代谢内环境中发挥
着重要作用[7”]。本实验结果显示，丹参提取物对增
加CYP7AmRNA的表达有明显作用，提示通过增
加CYP7AmRNA的表达，促进胆固醇转化为胆汁
酸，从而降低血浆中的胆固醇，这可能也是其调血脂
机制之一。
消瘀片具有良好的调血脂作用，尤其是丹参提
取物，对调节胆固醇代谢十分重要，它可抑制内源性
胆固醇的合成和增加胆固醇转化为胆汁酸。
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人参总皂苷体外定向诱导CD34+细胞分化为粒系血细胞的研究
王建伟，王亚平，王莎莉，姜 蓉
(重庆医科大学基础医学院重庆市生物化学与分子药理学重点实验室，重庆400016)
摘 要：目的 研究人参总皂苷(TSPG)协同造血生长因子对CD34+细胞体外定向诱导分化为粒系血细胞的影
响。方法 应用阴性磁性分选策略，以Stemsepl”系统从正常人骨髓细胞中分离CD34+造血干／7祖细胞(HSC／
HPC)，通过甲基纤维素半固体培养法检测TSPG诱导CD34+HSC／HPc向粒系祖细胞集落(CFU—GM)增殖与
分化的能力；在SCF+IL一3+GM—CSF+G—CSF(SIGG)液体培养体系中加入不同剂量的TSPG，检测对CD34+
HSC／HPC增殖形成CFU—GM的影响以及CD33+细胞比例的变化。结果TSPG(10～50ug／mL)均能提高
CD34+细胞形成CFU—GM的集落产率，以TSPG20ug／mL效果最为明显；不同质量浓度的TSPG协同造血生长
因子在液体培养体系中诱导CD34+细胞2周，观察粒系血细胞的分化，TSPG10～70ug／mL均可不同程度地提高
细胞总数、CFU—GM扩增倍数及CD33+细胞比例，TSPG20ug／mL是液体培养诱导CD34+细胞向粒系分化的最
佳质量浓度。结论TSPG协同造血生长因子能促进CD34+细胞定向诱导分化为粒系血细胞。
收稿日期：2006—05—22
基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号38670880，30472253)
作者简介：王建伟(1968一)，女，副教授，博士，硕士生导师，重庆市科技项目与科技成果评审专家，主要研究方向为天然中药对造血的调
控。Tel：(023)68485087E—mail：wangjianwei88@sohu．corn
万方数据
丹参和山楂提取物含药血清对胆固醇代谢的影响
作者： 薛洁， 谢梅林， 顾振纶， 张克平， XUE Jie， XIE Mei-lin， GU Zhen-lun， ZHANG
Ke-ping
作者单位： 苏州大学医学院,药理学教研室,江苏,苏州,215123
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(1)
被引用次数： 8次
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