全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月·419·
药材与资源
红景天属植物DALP反应体系的建立
李永谊1，虞 泓1’孙，朱荣勋1，和锐1，倪念春1
(1．云南英茂生物技术实验室，云南昆明650106；2．云南大学生命科学学院生态遗传学实验室，云南昆明650091)
摘 要：目的 利用直接扩增片段长度多态性(DALP)这一新分子标记技术建立一套稳定的红景天属植物的
DALP反应体系。方法以红景天基因组DNA为模板，对DALP反应程序的一些重要参数进行摸索和优化试验。
结果建立了一套稳定性强、可靠性高的DALP应用反应体系；经过大量重复性实验，反应体系为20“L，M92+浓
度为2．5mmol／L，dNTPs浓度为1．25mmol／L，模板DNA的量为60ng，5pmol／L选择性引物1扯L，5pmol／L反
向引物3／*L，引物浓度比为1：3，Taq酶2U。反应过程为：95℃预变性5rain、94℃变性30S、50℃退火30S、72℃
延伸1rain；30个循环，再72℃延伸10rain，完成整个PCR反应。结论该体系可有效地应用于红景天属药材的分
类鉴定和地道性鉴定。
关键词：红景天属；直接扩增片段长度多态性；分子标记；反应体系
中图分类号：R282．710．3文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)03—0419—05
EstablishmentofDALPreactionsystemforplantsofRhodiolaL．
LIYong—yil，YUHon91～，ZHURong—xunl，HERuil，NINian—chunl
(1．InmolLaboratoryofBiotechnology，Kunming650106，China；2．LaboratoryofEcologicalGenetics。
CollegeofLifeScience，YunnanUniversity，Kunming650091，China)
Abstract：ObjectiveDirectamplificationoflengthpolymorphism(DALP)asanewmolecularmark—
erwasusedtoestablishasetofstableDALPreactionsystemfortheplantsofRhodiolaL． Methods
SomesignificantparametersofDALPreactionprocedurewe einvestigatedandoptimizedbytakingthe
DNAgenomefortheplantsofRhodiolaL．astemplate．ResultsThereactionsystemwas：20“Lreaction
systemcontaining2．5mmol／LM92+，1．25mmol／LdNTPs，60ngDNAtemplate，1址L5pmol／Lselec—
tiveprimer，3弘L5pmol／Lreverseprimer，selectiveprimer：reverseprimeri 1：3，and2UTaqDNA
polymerase．Amplificationrogramis95℃pre—denaturedfor5min，94℃denaturedfor30S，50℃3n—
nealedfor30S，72℃extendingfor1min；after30cycles，andthen72℃extendingagaifor10minto
thendofPCRreaction．ConclusionThisDALPreactionsystemisefficienttoidentifythespeciesandlO—
calpopulationsfortheplantsofRhodiolaL．repeatedlywiththestrongerstabilityandreliability．
Keywords：RhodiolaL．；directamplificationoflengthpolymorphism(DALP)；molecularmarker；
reactionsystem
红景天RhodiolaroseaL．为景天科红景天属
多年生草本或亚灌木植物，多生长在海拔3000～
5000m雪域高原的干旱、低温、缺氧、紫外线照射
强、风大、积雪的石灰岩和砾岩的恶劣环境[1]。红景
天属植物在全世界有90多种，分布于欧、亚和北美
的高寒山区。我国有70种分布于东北、华北、西北、
西南等地，云南有24种，主要分布于横断山区[2]。有
效成分是红景天苷，它是继人参、刺五加、绞股蓝之
后，抗衰老、抗辐射、抗疲劳、抗高温、抗病毒、补益强
壮，可供防治神经系统、心血管系统疾病的又一值得
重视研究的药用植物群体[3]。
直接扩增片段长度多态性(directamplification
oflengthpolymorphism，DALP)是1998年法国科
学家Desmarsis、Lannelucl和Langel发展起来的基
收稿日期：2004—06—06
基金项目：中药现代化科技产业(云南)基地专项资助项目(2002ZY一18)
作者简介：李永谊(1978一)，女，昆明宜良人，实习研究员，现从事药用植物分子遗传学及其药材分子鉴定研究。
Tel：(0871)7392577Fax：(0871)7392576E—mail：zrxl230@163．net
*通讯作者Tel：(0871)7392184Fax：(0 71)7392576E—mail：fisher@yninm01．com
万方数据
·420· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月
于随意扩增PCR(AP—RCR)、用于检测基因多态性
并用扩增产物直接测序的一种新方法。这是一种以
通用测序引物M13为核心序列，在此基础上任意添
加少数碱基的引物进行样品基因组的PCR扩增，以
得到相应的DNA指纹的方法。这个方法利用了引
物M13的序列特性，即其广泛地存在于真核、原核
细胞基因组当中，并且出现于多个位点。DALP拥有
RAPD信息量大的优点，同时也不需要被分析样品
的基因组参考序列。而其引物序列相对RAPD较长
(RAPD引物不多于10个碱基)，PCR扩增时使用
以相对高的退火温度，这些都使得DALP的结果比
RAPD有更高的重复性和稳定性。同时，由于使用
以通用测序引物M13为核心序列的双引物扩增，得
到的DNA条带57端和37端的序列不一样，但都含
有对应的M13序列，所以可以用充作其核心序列的
M13测序引物直接测序，省去了繁琐的克隆步骤，
简化了实验流程。
DALP最早应用于检测基因组中微小的插入、
缺失、变异和微卫星DNA位点[4]，结果在得到的7
个多态性位点中有6个出现微小的插入或缺失现
象，1个含有数量可变的重复序列(微卫星位点)。本
研究以红景天基因组DNA为模板，通过对PCR反
应体系中各种参数的优化设置，分析比较各种因素
对DALP扩增结果影响，找出合适的反应体系，为
下一步开展红景天属分子标记奠定基础。
1材料与方法
1．1实验材料：红景天采自云南省中甸并种植在实
验田内不超过半年。引物(P。、P：、P。、P。)为复旦大学
生物系提供，其序列见表1，TaqDNA聚合酶(含缓
冲液和M92+)和dNTPs(购自上海生工公司)。
表1引物序列
Table1 Sequenceofprimers
1．2 DNA提取：基因组DNA提取采用CTAB
法[5“]，并稍作修改。约0．5g植物组织加入到4mL
预热到65℃的2×CTAB(含2％p一巯基乙醇)中，研
磨成糊状，65。C水浴1h，冷却，加入1／3体积5
mol／LKAc冰浴1h，4℃10000×g离心10min，
取上清液，CI(氯仿一异戊醇一24：1)抽提2次，取上
清液加3／4体积的异丙醇，一20℃静置30～60
min，100 0×g离心10min，70％乙醇冼2次，无
水乙醇洗1次凉干。加1XTE400肚L，室温静置2
h，使DNA充分溶解，1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙
锭染色，用2DNA(25、50、100ng／p．L)标定，利用
Kodak1D分析软件分析并标定到20ng／,uL备用。
1．3 DNA扩增：按Desmarais、Lanneluc和Lagnel
的方法在PE9700扩增仪(美国PE公司)上进行，
PCR反应体系为20肛L。根据有关文献报道和试验
要求对DNA扩增中的一些重要参数进行梯度设
置，并严格控制其他参数和反应条件，确保试验的准
确性和可比性。
1．4电泳检测：扩增产物在1×TAE、1．5％的琼脂
糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，用GeneRulerTM
100bpDNA作相对分子质量标记(MBI
Fermentas)，电压3V／cm，用Kocad1D紫外凝胶
成像仪观察照像。
2结果与讨论
2．1 引物浓度及比对PCR结果的影响：见图1(71物
浓度及引物浓度比梯度)及表2，M92+浓度为2．5
mmol／L，dNTPs浓度为1mmol／L，Taq酶1U，2
pL缓冲液，模板DNA量60ng。研究结果表明，引物浓
度为5pmol／L，引物浓度比为1：3时获得较好的扩增
效果，引物浓度及引物浓度比对PCR影响不是很大。
表2引物浓度及引物浓度比梯度对PCR的影响
Table2 Effectofprimerconcentrationandprimer
concentrationVSgradientonPCR
“+／一”表示扩增严物不稳定，“+”表不扩增产物效率商，“+
+”表示扩增产物效率较高(表2～12注相同)
“+／一”：LabileproductofPCR，“+”：efficientproductof
PCR，“++”：moreefficientproductofPCR(sameinchart2—12)
2．2 dNTPs浓度对PCR结果的影响：见图1
(dNTPs浓度梯度)及表3。M92+浓度为2．5mmol／
L，1弘L5pmol／L选择性引物，1pL5pmol／L反向
引物、引物浓度比为1：1，1U的Taq酶，2弘L的缓
冲液，模板DNA量60ng，结果表明：dNTPs浓度
变化对PCR带型影响较小。dNTPs浓度为1．25
mmol／L时获得较好的扩增效果，dNTPs浓度高于
2．5mmol／L时带明显减弱。
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月·421·
图1 DALP的反应体系探索结果
Fig．1AmplificationresultsofDALPreactionsystem
表3 dNTPs浓度对PCR的影响
Table3 EffectofdNTPsconcentratiOnonPCR
2．3缓冲液用量对PCR结果的影响：见图1(缓冲
液浓度梯度)及表4。M92+浓度为2．5mmol／L，
dNTPs浓度为1．25mmol／L，1ttL5pmol／L选择
性引物，3ttL5pmol／L反向引物，引物浓度比为
1：3，2U的Taq酶，模板DNA量60ng，以红景天
为实验材料的研究结果表明，缓冲液用量对PCR带
型影响较大，达到2肛L时获得较好的扩增效果，高
于2．4肛L时带型较弱。
表4缓冲液浓度对PCR的影响
Table4 EffectofbuffercOncentrationonPCR
泳道 缓冲液／肛L 结果 泳道 缓冲液／肛L 结果
1 0．8—一 4 2 ++
2 1．2 + 5 2．4 +／一
3 1．6 + 6 3 J-／——
2．4 模板DNA的量对PCR结果的影响：见图1
(模板浓度梯度)及表5。M92+浓度为2．5mmol／L，
dNTPs浓度为1mmol／L，1弘L5pmol／L选择性引
物，3弘L5pmol／L反向引物，引物浓度比为1：3，1
U的Taq酶，样品DNA稀释为一定梯度进行扩增，
以决定最佳DNA量，模板DNA量的变化对PCR
带的影响较大，10～20ng带较弱，40～100ng带较
稳定，60ng为最佳。
2．5 Taq酶用量对PCR结果的影响：Taq酶用量太
低则扩增效率低，使DALP指纹多态性降低，太高时
使DALP稳定性降低，且背景值增高，甚至出现拖尾
现象[7]。见图1(Taq酶浓度梯度)及表6，M92+浓度为
2．5mmol／L，dNTPs浓度为1．25mmol／L，1肛L5
pmol／L选择性引物，3弘L5pmol／L反向引物，引物
浓度比为1：3，2弘L的缓冲液，模板DNA量60ng，
以红景天为实验材料的研究结果表明，Taq聚合酶用
量为2U时获得较好的扩增效果。
2．6 M92+浓度对PCR结果的影响：Mg抖浓度是
PCR反应中的一个重要因素。M92+浓度不但会影
响酶的活性及合成的忠实性，而且还会影响引物与
模板的结合效率，模板与PCR产物的解链温度以及
产物的特异性和引物二聚体的形成等凹]，见图1
(M92+浓度梯度)及表7。dNTPs浓度为1mmol／L，
表5模板浓度对PCR的影响
Table5 Effectof emplateconcentrationonPCR
泳道 模板／ng 结果 泳道 模板／ng 结果
1 10 J-／—— 4 60 ++
2 20 +／一 5 100 +
3 40 +
表6 Taq酶浓度对PCR的影响
Table6 EffectofTaqpolymerase
concentratiOnonPCR
泳道Taq酶／u结果 泳道Taq酶／u结果
1 0．5 +／—— 3 I．5—一
2 1 +／一 4 2 ++
表7 M92+浓度对PCR的影响
Table7 EffectofM92+concentrationonRCR
万方数据
·422· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月
1弘L5pmol／L选择性引物，3pL5pmol／L反向引
物，引物浓度比为1：3，1U的Taq酶，2肛L的缓冲
液，模板DNA量60ng。研究结果表明，M92+浓度
对PCR带的影响较大，M92+浓度为1～2mmol／L
或3mmol／L时带较弱，M92+浓度为2．5mmol／L
时获得较好的扩增效果。
2．7 引物组合对PCR结果的影响：引物组合中4种组
合扩增都好，见图l(引物组合)及表8。Mg抖浓度为2．5
mmol／L，dNTPs浓度为1mmol／L，1|uL5pmol／L
选择性引物，3弘L5pmol／L反向引物，引物浓度比为
1：3，1U的Taq酶，2肛L的缓冲液，模板DNA量60
ng，2．1～2．7项反应过程均为95℃预变性5min、94
。C变性30S、55℃退火30S、72℃延伸30S，40个循
环，再72℃延伸10rnin，完成整个PCR反应。
表8引物组合对PCR的影响
Table8 EffectofprimercombinationsonPCR
泳道 引物 结果 泳道 引物 结果
1 P2、P4 + 3 P2、P3 +
2 P1、P4 + 4 Pl、P3 +
2．8 PCR热循环的反应参数：反应过程为94℃变
性30S、50℃退火30S、72℃延伸1min(最后一个
循环10min)，共30个循环。其中摸索延伸时间以60
S最好，见图1(延伸时间梯度)及表9。退火温度以50
℃最好，见图1(退火温度梯度)及表10；退火时间以
30S最好，见图1(退火时间梯度)及表11；循环次数
以30次最好，见图1(循环次数梯度)及表12。
表9延伸时间对PCR的影响
Table9 Effectofextendingt meonPCR
表10退火温度对PCR的影响
Table10EffectofannealingtemperatureonPCR
表11退火时间对PCR的影响
Table11 Effectofannealingt meOilPCR
表12退火循环次数对PCR的影响
Table12EffectofannealingcyclesonPCR
3 结论
通过对上述PCR反应条件中主要参数的试验
和比较分析，结果表明，红景天属DALP的反应条
件为：反应体系20弘L、M92+浓度2．5mmol／L、
dNTPs浓度1．25mmol／L，模板DNA量60ng，1
tLL5pmol／L选择性引物(上海生工合成)，3肛L5
pmol／L反向引物(de海生工合成)、引物浓度比1：
3、TaqDNA聚合酶2U。反应程序为95℃预变性5
min，94。C变性30S，50℃退火30S，72℃延伸1
min，30个循环，再72℃延伸10min，完成整个
PCR反应。这一反应体系可直接利用在红景天属
DALP系统分析和分子鉴定上，DALP图谱带型清
晰、重现性好、稳定性高。在利用DALP分子标记对
红景天属植物的3个种：大花红景天R．crenulata
(Hook．f．etThorns．)S．H．Fu、长鞭红景天R．
fastigiata(Hook．f．etThoms )S．H．Fu、云南
红景天R．yunnanensis(Franch．)S．H．Fu，1个
外类群长丝景天SedumbergeriHamet的22居群
22样品的扩增中，6个寡核苷酸引物对共检测到
257个基因位点，平均每个引物产生42．8条带。在6
个引物组合中，11个大花红景天居群除P。P。无特
征带外，其他5个引物组合P：P。、P。P。、P。P。、P，P。、
P。P。共扩增出9条特征带(见图2)，1kb处箭头指
的为大花红景天特征带。
该DALP反应体系可直接用于红景天药材品
种的分子鉴定，其DALP图谱带型清晰、重现性好、
稳定性高。由于药材市场上出售的红景天药材均为
其根茎，而且被切成块状，有经验的老中医和植物分
类学家也很难鉴定其种类和产地。笔者经大量的重
复性实验，发现DALP技术重复性高，方法简便、快
捷，都可以得到5个引物组合的9条特征带，获得清
晰可靠的DNA指纹图谱，可以把不同种类的红景
天及其产地清楚地鉴别开来；从DALP的UPGMA
聚类树和遗传距离，可以清楚地把不同产地的各个
红景天居群完全分开，为红景天药材的分类鉴定和
地道性鉴定提供可靠的分子依据。
在DNA分子鉴定的历史上，用于药用植物分
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月·423·
圈2红景天属植物P2P，组合DALP电泳图
(箭头代表大花红景天特征带)
Fig．2DALPelectrophorogramofP2P3co bination
withP3samplesamplificationforplantsof
RhodiolaL． (arrowindicatescharacteristic
bandsofR．crenulata)
子鉴定的DNA标记有10多种，应用广泛的主要有
RFLP、RAPD、AFLP和核酸序列分析等。RFLP在
技术上比较费力、成本高、多态性少，RAPD反应系
统不稳定、可靠性差，AFLP和ITS在分子鉴定上优
点突出，但是AFLP为显性标记、技术难度高，ITS
测序资金耗费大。而DALP是共显性标记，能检测
出纯和基因型及杂和基因型，提供了完整的遗传信
息，技术难度低、耗费小。本实验首次把DALP技术
用在传统中药材的鉴定上，DALP技术的优点克服
了传统分子鉴定的缺点，共显性数据提高了数据可
信度，有望成为今后中药分子鉴定的首选技术。
致谢：在材料采集中受到和云峰、张时刚、晏婴
才等的大力帮助。
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ISSR—PCR在石斛种间鉴别中的应用
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摘要：目的采用ISSR—PCR方法对石斛属9种植物进行鉴别，探讨不同种石斛在DNA分子水平上的差异。方
法选取10条由SSR组成的引物，对9种石斛进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析。结果10条引物中有7条
扩增出多态性条带。每条引物可检测的多态性位点最少7个，最多14个，扩增片段大小为220～1260bp。其中，引
物UBC一807和UBC一864具有较高的多态性条带比率，均可以独立将所有被测种区分开来。结论ISSR—PCR作为
一种简便、可靠的分子标记鉴定技术，可以作为石斛属种间鉴别的方法之一。
关键词：ISSR—PCR；分子标记；石斛属；鉴别
中图分类号：R282．710．3文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)03—0423—05
收稿日期：2004—05—10
基金项目：浙江省自然科学基金资助项目(C03050204)
作者简介：沈颖(1978一)，女，硕士生，研究方向为植物遗传与分子生物学。Tel：(0571)88273341E—mail：sheny78@sohu．com
*通讯作者Tel：(0571)81859020E—mail：xuel23@zju．edu．cn
万方数据
红景天属植物DALP反应体系的建立
作者： 李永谊， 虞泓， 朱荣勋， 和锐， 倪念春， LI Yong-yi， YU Hong， ZHU Rong-xun，
HE Rui， NI Nian-chun
作者单位： 李永谊,朱荣勋,和锐,倪念春,LI Yong-yi,ZHU Rong-xun,HE Rui,NI Nian-chun(云南英茂生
物技术实验室,云南,昆明,650106)， 虞泓,YU Hong(云南英茂生物技术实验室,云南,昆明
,650106;云南大学生命科学学院生态遗传学实验室,云南,昆明,650091)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(3)
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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200503040.aspx