全 文 ：。180· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月
葡萄籽原花青素二聚体的提取分离与结构鉴定
徐德平，孙芸，谷文英，丁霄霖
(江南大学食品学院，江苏无锡214036)
20世纪80年代以来，人们对原花青素的单聚
体、二聚体、三聚体、四聚体和高聚体进行生化、药理
活性的研究，发现其具有抗氧化、抗致突变、抗心血
管疾病等活性，其中二聚体和三聚体活性最强[1]。葡
萄籽原花青素单体主要由(+)一儿茶素(catechin)、
(一)一表儿茶素(epicateehin)、(一)一表儿茶素没食子
酸酯组成，各单体通过4—6或4—8键相连，形成二
聚、三聚、四聚等多聚体。葡萄籽中的原花青素由于
聚合度、单体及连接键的不同，各聚合度可能的异构
体数目为2—1×3”(72一聚合度)，单二聚体就有18
种可能的异构体，结构非常复杂，各低聚体及各同聚
异构体之间极性相近，由于原花青素异构体数目繁
多，一般液相色谱仪也很难分开，能得到的异构体也
仅仅有有限的几种，使葡萄籽中原花青素的分析、分
离十分困难[2叫]。目前国外对葡萄籽原花青素的研
究非常多，国内的研究报道也有很多，但主要集中在
生理活性研究和生产开发方面，对低聚体的化学组
成和结构研究很少。本研究利用RP—HPLC分析了
葡萄籽粗提物中的二聚体原花青素的构成，并采用
反相色谱柱分离得到2个二聚体化合物，并对其结
构进行了鉴定。
1材料与方法
1．1 材料：葡萄籽由中国长城葡萄酒公司提供；
HPLC用甲醇为色谱纯，甲醇、石油醚(30--60℃)、
醋酸乙酯等皆为AR级(上海化学试剂采购供应
站)；GF。。。硅胶板(山东烟台芝罘化工厂)；色谱柱：
聚酰胺(60目，浙江台州化工厂)，SephadexLH一20、
Hw一40为进口分装。
1．2仪器：WatersPlatformZMD4000液质联用
仪；BruckerAV500核磁共振仪(中国科学院上海
有机化学研究所)。
1．3方法
1．3．1色谱条件：色谱柱ZorbaxXDB(250mm×
4．6mm，5弘m)；流动相A：1％甲酸，B：80％甲醇+
1％甲酸。梯度洗脱：0～5min100％A；5～50min
100％A一20％A+80％B。质量流量1mL／min，柱
收稿日期：2004—05—25
温30℃，进样量20pL。检测分流比5：1，280nm
检测。质谱条件：负离子扫描(ESI一，优屈260～
1500)，毛细管电压4．2kV，锥孔电压50V，光电倍
增器电压650V，离子源温度120℃，脱溶剂气温度
300℃，结果用MassLynx软件分析[5‘6]。
1．3．2葡萄籽提取物：葡萄籽5妇粉碎后室温用
甲醇(料液比l：7)提取3次，提取液滤过，除去溶
剂，石油醚脱脂，将脱脂后的物质用3倍体积的醋酸
乙酯萃取，反复多次，直到醋酸乙酯相无色为止，合
并醋酸乙酯相，蒸干，蒸发温度≤40℃，得醋酸乙酯
提取物(用于分离单聚体化合物)。将醋酸乙酯提取
后的剩余物蒸干，取少量固体物溶于甲醇，过0．45
肛m膜后用HPLC—MS分析，余下用于二聚体化合
物的分离。
1．3．3二聚体化合物的分离：将醋酸乙酯提取后的
剩余物蒸于用适量水溶解，上聚酰胺柱(600mm×
60mm)，先用去离子水洗脱，再用甲醇梯度洗脱
(20％、40％、60％)，分步收集。40％甲醇溶液洗脱得
流份A，60％甲醇溶液洗脱得流份B，将流份A部分
浓缩至一定体积后上SephedexLH一20柱(500
mm×35mm)，先用去离子水洗脱，再用甲醇梯度洗
脱，15mL收集一管，可得到C、D、E、F4个组分，每
组分主要含1个化合物，将C、D每个组分反复上
HW一40柱(500mm×35mm)，并用甲醇梯度洗脱，
可得2个纯化合物，分别为I、II。
1．3．4二聚体化合物的结构鉴定：将所得I、Ⅱ两
个化合物用DMSO～d。溶解后，进行1H—NMR和
13C—NMR等分析。
2结果与分析
2．1 反相HPLC分离结果：从葡萄籽提取液选择
离子色谱图(图1)及各峰的ESI质谱信息可以较清
楚地检出6种非酯二聚体(m／z为577)，出峰时间
分别为20．34、21．18、21．78、23．58、25．97、26．45
min，和2种二聚体没食子酸酯(m／z为729)出峰时
间分别为27．77、28．49min。可见从本研究所用的
葡萄籽中可检出的二聚体数量为8种，LC—MS只能
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月‘181。
分辨相对分子质量，不能进一步给出结构信息。
96．97
0
20342，78
敝 1肥：00～．
图l 葡萄籽中原花青素二聚体HPLC色谱图
Fig．1HPLCchromatogramofprocyanidin
dimerf omgrapes ed
2．2鉴定
化合物I：浅黄色粉末，极易溶于水、乙醇、甲醇
等溶剂，不溶于丙酮、醋酸乙酯等小极性溶剂。
1H—NMR(400MHz，DMSO—d6)：上部(catechin)6：
2．99(1H，H一4)，4．05(1H，m，H一3)，4．73(1H，d，J=
7．8Hz，H一2)，5．85(1H，d，，=2．1Hz H一6)，6．12
(1H，d，J一2．1Hz，H一8)，6．74(1H，d，J一7．8Hz，
H一67)，6．88(1H，d，t，=7．6Hz，H一5’)，7．03(1H，d，
J一2．7Hz，H一27)。下部(epicatechin)艿：2．64(1H，
H一49)，2．89(1H，H一40【)，4．43(1H，m，H一3)，4。63
(1H，S，H一2)，6．02(1H，d，t，=2．3Hz，H一6)，6．17
(1H，d，J一2．3Hz，H一8)，6．84(2H，H一67， 一57)，
6．98(1H，S，H一27)。从1H—NMR数据可见，4．73，
4．63处各有一个H，4．73为双峰，是catechin上的
H一2，4．63为单峰，应是epicatechin上的H一2，epi—
catechin上的H一2一般在4．8左右，而此处小于
4．8，表明epicatechin、epicatechin上的H一2受到其
他基团的影响而向高场移动。在8小于3的高场区
只有3个H，说明H一4成键。
二聚体是由(+)一儿茶素(catechin)、(一)一表儿
茶素(epicatechin)、(一)一表儿茶素没食子酸酯通过
4—6或4—8键相连形成，化合物I没有没食子酸
酯的信号，排除了(一)一表儿茶素没食子酸酯成键的
可能。catechin、epicatechin的C一4一般在26～29，
从”C—NMR光谱中可见637．2处有一碳信号，这一
碳信号表明c一4位成键；C～．的碳信号catechin一
般在68左右，epicatechin的C一3的信号在67左右，
从”C—NMR光谱中可见艿67．3，72．8处各有一碳信
号，而68左右未见碳信号，表明epicatechin的C一4
未成键，从DEPT谱中也可证实，catechin的C一4成
键使C一3向低场移动到72．8，可以判断epicatechin
在下，catechin在上。epicatechin的C一6的信号大于
96，C一8的信号小于96，从13C—NMR光谱中可见
(396．2，96．9处各有一碳信号，而95．8处仅有一碳
信号，_(396．2，96．9处的碳信号分别为catechin、epi—
catechin的C一6，95．8处的碳信号应为catechin的
C一8，表明epicatechin的C一8成键并向低场移动。通
过以上分析并参照文献得化合物I为catechin4—8
epicatechinE7～9|。13C—NMR(400MHz，DMSO—d6)：
上部(catechin)C一4—37．2，C一3—72．8，C一2-82．2，C-8—
95．8，C一6—96．2，C一4a一101．7，C一57—116．0，C一2’一
116．2，C一67—120．7，C一17—131．3，C一37—144．1，C一4’一
144．7，C一8a一153．2，C一5—154．9，C一7—155．5；下部
(epicatechin)C一4—27．4，C一3—67．3，C一2—80．7，C一8—
109．3，C一6—96．9，C一4a一100．2，C一57—115．3，C一2’一
116．5，C一6’一120．15，C一1’一131．17，C一3’一143．9，C一4’一
144．2，C一8a一153．4，C一5—155．3，C一7—157．1。化合物
I结构见图2。
H
Oil
图2化合物I的结构
Fig．2StructureofcompoundI
化合物Ⅱ：浅褐色粉末，极易溶于水、乙醇、甲醇
等溶液，不溶于丙酮、醋酸乙酯等小极性溶剂。
1H—NMR(400MHz，DMSO—d6)：上部(catechin)占：
2．85(1H，H一4)，4．01(1H，m，H一3)，4．57(1H，d，J一
7．9Hz，H一2)，5．94(1H，d，J一2．2Hz，H一6)，6．18
(1H，d，J一2．2Hz，H一8)，6．75(1H，d，J=8．2Hz，
H一67)，6．82(1H，d，J=8．2Hz，H一5’)，7．02(1H，d，
，=2．7Hz，H一27)。下部(epicatechin)8：2．63(1H，
H一49)，2．87(1H，H一4a)，5．34(1H，m，H一3)，5．04
(1H，S，H一2)，5．78(1H，d，t，=2z，H一6)，6．07
(1H，d，J一2Hz，H一8)，6．79(1H，d，J一7．2Hz，H一
57)，6．84(1H，d，J一7．2Hz，H一67)，6。92(1H，S，H一
27)，6．86(2H，S，2”，6”)。从1H—NMR数据可见，艿4．57
处有一个H，为双峰，是catechin上的H一2，艿5．04为
单峰，应是epicatechin上的H一2，epicatechin上的
H一2一般在4．8左右，而此处大于4．8，表明epicat—
echin上的H一2受到其他基团的影响而向低场移
动。艿5．34处的H可能为epicatechin上的H一3受其
他基团影响而向低场移动。66．86处有2个单峰H，
提示有没食子酸酯的存在，在8小于3的高场区只
万方数据
·182· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月
有3个H，说明H一4成键。
在化合物Ⅱ的13C—NMR谱中，8166．7碳信号为
羰基碳，提示有没食子酸酯的可能，3143．2～157．3有
13个连氧碳，而catechin、epicatechin各有5个连氧
碳，另3个连氧碳一定为没食子酸的，根据文献资料介
绍，二聚体中只有(一)一表儿茶素没食子酸酯的存在。
没食子酸在3位与(一)一表儿茶素连接，C一3向低场移
动，由于空间位阻，(一)一表儿茶素4位成键可能较小，
由于896．1，96．9处各有一碳信号，而95．3处仅有一
碳信号，说明C一8位参与成键。通过以上分析并参照文
献确定化合物Ⅱ为catechin4—8epicatechingal—
late／7~9]。13C—NMR(400MHz，DMSO—d6)：上部(cat—
echin)C一4—37．1，C一3—76．2，C一2—82．2，C一8—95．3，C一
6—96．1，C一4a一101．6，C一57—115．3，C一27—115．3，C一6
7—
120．1，C一17— 31．9，C一37—144．7，C一4’一144．8，C一8a一
155．6，C一5—155．8，C一7—157．3；下部(epicatechingal—
late)C一4—26．8，C一3—70．6，C一2—77．7，C一8—96．1，C一6—
96．9，C一4a一100．1，C一5’一115．4，C一27—115．4，C一6’一
118．6，C一17— 30．7，C一37—145．6，C一47—145．7，C一8a一
156．2，C一5—157，C一7—156．2。羰基166．7，C一1，，-
124．8，C一2，，-106．1，C一3，，_153．1，C一4，，_143．2，C一5，，-
151．3，C一6”一109．9。化合物Ⅱ结构见图3。
()II
}D
图3化合物Ⅱ结构
Fig．3StructureofcompoundⅡ
H
3讨论
苹果、可可原花青素其聚合体一般由表儿茶素
通过C4一C8键聚合而成，各聚合体的异构体数目一
般只有2～3个，很容易分离分析。而葡萄籽原花青
素则复杂得多，二聚体理论上有18种(其中6种为
没食子酸酯形式)，三聚体理论上有108种，要获得
如此多的相应对照品非常困难。本研究采用反相液
相色谱结合电喷雾质谱分析葡萄籽粗提物中二聚体
的组成，可以为葡萄籽原花青素的原料选择及质量
评价提供一种方法，在没有相应对照品的情况下借
助质谱在线检测比较、分析不同来源原花青素低聚
体的相对含量。
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过山蕨的化学成分研究(I)
李 宁1，吴永军2，李铣¨，王金辉1，王楠1
(1．沈阳药科大学，辽宁沈阳110016；2．辽宁桓仁药业股份有限公司，辽宁桓仁117201)
过山蕨又名马蹬草、还阳草、过桥草，为铁角蕨 科植物过山蕨CamptosorusibiricusRupr．的全草，
器薯品羿：攀04-宁05(-181979一)，女，河北保定人，在读研究生，2001年毕业于沈阳药科大学中药学院，同年考取本校天然药物化学专业研作者简介 李 宁( 一)，女，河北保定人，在读研究生， 年毕业于沈阳药科大学中药学院，同年考取本校天然药物化学专业研
究生。
*通讯作者Tel：(024)23902286E—mail：lixian@mail．sy．In．ca．
万方数据
葡萄籽原花青素二聚体的提取分离与结构鉴定
作者： 徐德平， 孙芸， 谷文英， 丁霄霖
作者单位： 江南大学食品学院,江苏,无锡,214036
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(2)
被引用次数： 2次
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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200502007.aspx