全 文 ：中草焉ChineseTraditionalandHerb Drugs第37卷第9期2007年9月
茶多酚和维生素C对人胚肾293细胞缺糖缺氧损伤保护作用的比较
吕 勇1，金越1，韩国柱”，周 琴1，孙慧君1，李楠。
(1．大连医科大学药理教研室，豇宁大连 116027，2．大连理工大学化学分析教研室，辽宁大连116023)
摘要：目的从细胞水平研究茶多酚(TP)对人胚肾293细胞缺糖缺氧性损伤的保护作用，并与抗氧化剂维生
隶C(Vc)进行比较。方法采用缺糖培养基并以连二亚硫酸钠消除培养基中的氧，诱导产生缺氧映糖损伤模型·
铡定细胞的存活率、乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及总抗氧化能力，并计算ICso。结果在
细胞损伤模型中，TP和VC均表现出极强的抗氧化能力．TP能显著提高细胞的存活率、SOD活性和总抗氧化能
力并抑制LDH的活性，TP的作用均大于VC。结论TP和VC体外具有强大的自由基清除作用，且呈现明显的
剂量依赖性，TP在细胞损伤模型中的抗自由基作用均大于VC。
关蕾诃：茶多酚(TP)}维生索C(Vc)’自由基‘缺氧缺糖性损伤}人胚肾293细胞
中围分类号：R285．75 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)09—1370—03
Comparatives udyonprotectiveeffectsofteapolyphenolsa dvitaminCo anoxia／
hypoglycemiainjuryinculturedhumanembryonicrenalcell293
LUYon91，JINYuel，HANGiao—zhul，ZHOUQinl，SUNHui—iunl，LINan2
(1．DepartmentofPharmacology，DelianMedicalUniversity，Dalian116027，China·2-DepartmentofAnalytical
Chemistry，DalianUniversityotSciencesandTechnology，Dalian116023，China)
Keywords：teapolyphenol(TP)，vitaminC(VC)；freeradical；anoxia／hypog[ycemiainjury；hum n
embryonicrenaleell293
茶多酚(teapolyphenol，TP)是从绿茶中提得
的一种多酚类化合物的总称，是茶叶的主要活性成
分[1】。目前，国内外学者对TP的大量研究表明，TP
具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等生物活性”“】。但TP
对离体人胚肾细胞损伤的保护作用国内外鲜有报
道。本研究旨在研究TP对缺糖缺氧诱导的人胚肾
293细胞损伤的保护作用，并与维生素C(Vc)进
行比较，从而为TP的新药开发进一步提供证据。
1材料与方法
I．1 药品及试剂：TP，购自江西婺原茶场，质量分
数≥98％}VC分析纯f连二亚硫酸钠，中国医药公司
北京公司；DMEM培养基Hyclone公司；胎牛血清，
杭州四季青生物制品研究所}噻唑蓝(MTT)，
GenetimesTechnologyInc公司；SOD、LDH、总抗氧
化能力试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。
1．2仪器：3366型二氧化碳培养箱，美国Forma
Scientific；XD一101倒置显微镜，南京江南光电
(集团)股份有限公司；Thermo--354酶标仪，美国
热电公司；sw—cJ—IFD超净工作台，苏净集团安
泰公司}80--1型离心机，上海手术器械厂。
1．3细胞株：人胚肾293细胞株，由大连医科大学
附属第二医院分子生物学实验室惠赠。
1．4人胚肾293细胞的缺氧缺糖损伤模型的复制
及实验分组：根据文献方法。删稍加改进建立缺氧缺
糖模型。将正常DMEM培养液培养的293细胞用
含糖Earle’s液(g／L)(NaCI6．68，K(310．4，
CaCl20．2，MgSOl·7H200．2，NaHC03Z．2，
NaH2PO．-2H200．4，HEPES2．4，葡萄糖0．2，
pH7．4)，洗细胞2次，并稀释至1×i05／mL，接种
于96孔培养板上，作为正常组。细胞用含0．45
mmol／L连二亚硫酸钠的无糖的Earle’s液以同样
方法洗涤并稀释至lX105／mL，接种在同一块96孔
培养板上，作为损伤组。另取损伤组细胞加以不同浓
度的药物作为给药组。将培养板置于5％CO：、
37℃培养箱中培养24h后观察并测定指标。损伤
组及给药组统称实验组。
1．5指标的检测
1．5．1细胞存活率：采用MTT法口]，将培养24h
警銎最留；笑譬品蟊壤计蜘项目。。。。：。。。。。。；，
尊翥纂器≯毒瞽翟79高—％需I疗琶；；器嘉’8馨篓留翟；主嚣j‰甓耋是蠹黄酮类化台物的抗6由基作用研究·
万方数据
中革番ChineseTraditi仰alndHerbalDrugs第37眷第9期200／年9月·1371·
后的96孔细胞培养板每孔加入10庙MTT(5
mg／mL)，4h后镜下观察结晶情况并每孔加入100
pL三联液(含10％SDS，5“异丁醇，0．012
mmol／LHCl)，将细胞培养板放回培养箱，12h后
取出，在酶标仪上测定吸光度(A)值，检测波长
560nm，参比波长为630nm。计算细胞存活率[”。
细胞存活率一(^|-n／AⅢt-)X1000A
l，5．2LDH、SOD和总抗氧化能力的测定：按照试
剂盒说明进行，取细胞培养上清液测定LDH活力，
用1％的Triton一100裂解细胞后取培养液测定
SOD及总抗氧化能力。采用考马斯亮蓝法测定蛋白，
黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力，酶偶联比色法测定
LDH活力，Fenton反应比色法测定总抗氧化能力。
1．5．3抑制率及lc。。的计算；[抑制率一(A*#*一
A幢龃／A正常组一A扭债蛆)×lOO％]。将抑制率对药物浓
度的对数作图求其线性方程，根据该线性方程求其
Ic。用于TP和VC的抗自由基活性强度的比较。
1．6统计方法：全部实验数据用z土j表示，采用
SPSS软件包作方差分析，组间作t检验。
2结果
2．1 TP和VC对缺氧缺糖损伤后细胞存活率的
影响：由表1可知，TP和VC能显著提高细胞的存
活率(y)，且与浓度(x)呈明显量效关系。其中TP
线性方程为：Y—o．6477x+0．9974(r=0．991
6)，VC线性方程为：Y=0．5589X+0．8738(r=
0．991)。TP和VC对缺氧缺糖损伤所致细胞存活
率下降的Ic。。分别为0．17mmol／L和0．21mmol／
L，两药的作用强度TP>VC。
袭1 TP和VC对缺氧缺糖损伤后细胞存活率的影响
(；士‘，月一6)
1hble1 EffectofTPandVCOilcellsurvivalpercentage
after；UlOXla／hypoglycemiaInjury(；士J．n=6)
与正常组比较：AAp<0．01
与损伤组比较：‘P<0．05一P<0．01
AAp<0．01们norma|group
’P
的影响：由表2可知，TP和VC能显著提高SOD
活力(y)，且与浓度(x)呈明显量效关系。其中TP
线性方程为：y=0．5449x+1．1826(r一
0．9896)；VC线性方程为：Y一0．5494X+1．0467
o=o．9969)。TP和VC对缺氧缺糖损伤后SOD
活力下降的Ic；。分别为0．06ID．mol／L和0．10
mmo[／L，两药的作用强度TP>VC。
寰2 TP和VC对缺氧缺糖损伤后细胞SOD活力的影响
(-士j。n=6)
T■ble2 EffeetofTPandVCoRcellSODactivityafter
anoxla／hypoglycemiainjury(_士$，n=6)
组别剂量／(retool·L一1)SOD活力／(U·mL一1)抑制率／％
与正常组比较l△6P<0．0lf与攒伤组比较：一P
2．3 TP和VC对缺氧缺糖损伤后细胞总抗氧化
能力的影响：由表3可知，TP和VC能显著提高总
抗氧化能力(y)，且与浓度(x)呈明显量效关系。
其中TP线性方程为：y=o．7433X+1．3592(r=
0．9934)；VC线性方程为：y；0．6875x+0．9445
o；o．990)。TP和VC对缺氧缺糖损伤后细胞总
抗氧化能力下降的Ic。。分别为0．07mmo[／L和
裹3 TP和VC对缺氧缺糖损伤后细胞总抗氯化能力的
影响(i士j，^一6)
TaMe，Effecto TPandVCOncellantioxldantespaeity
afteranoxia／hypoglyeemiainjury(-士$，n=6)
与正常组比较：AAp<0．0l
与损伤组比较·’p<0．05。。，
中革番ChineseTraditionalandHerhDrugs第37卷第9期2007年9月
0．19mmol／L，两药的作用强度TP>VC。
z．4 TP和Vc对缺氧缺糖损伤后上清液中LDH
活力的影响：由表4可知，TP和Vc能显著抑制
LDH活力(y)，且与浓度(x)呈明显量效关系。其
中TP线性方程为：y=0．6084X+0．803(r=
0．9938)}VC线性方程为lY=0．651x+0．6314
(r=0．9868)。TP和Vc对缺氧缺糖损伤所致
LDH升高的Ic50分别为0，32mmol／L和0．63
mmol／L，两药的作用强度TP>VC。
裹4 TP和VC对驶曩缺糖损伤后细胞上清液中LDH
蓿力的影响(；±$．n=6)
Table4 Eff∞tofTIPandVCODLDHvitality
in$upernataut丑fternoxla／bIypoglyeemta
InjuryG+s，n=6)
与正常组比较·60P<0，01
与损伤组比较t’P
。P<0·05’。P<0．01715injurygroup
3讨论
TP具有两个以上的酚性羟基，能提供氢，具有
抗氧化作用。许多研究表明，TP能够清除Oi、
·oH及脂自由基等，且具有量效关系口]。本实验采
用了人胚肾293细胞缺糖缺氧损伤模型研究了TP
和VC的抗氧化作用，结果证实了缺糖缺氧可导致
细胞膜损伤，使膜通透性增高，细胞内LDH漏出，
细胞培养液上清中LDH活性显著升高。同时本实
验MTT比色法的结果显示TP和VC能不同程度
地降低细胞缺糖缺氧所致的膜损伤，减少胞浆酶
LDH的漏出，有较好的剂量效应关系，由此提示
TP和VC具有抗氧化，保护细胞膜减轻自由基损
伤的作用。缺糖缺氧损伤可以使细胞SOD活力和
总抗氧化能力下降，加入TP后，可明显提高由于缺
糖缺氧作用而下降的SOD活力和总抗氧化能力，
且与胞浆标志酶LDH的释放减少相一致，有剂量
效应关系。实验结果说明TP和VC具有拮抗缺糖
缺氧细胞损伤的作用，提高细胞的存活率，这可能与
它们抗氧化功能有关。
本实验采用了计算Ics。的方法进行TP与VC
抗自由基强度的比较，结果显示TP强于VC。这可
能与TP分子中含有多羟基酚结构，苯并吡唷环和
苯酚环之间的大z键有关，从而显示较强的抗氧化
作用，TP也可能通过其他作用机制起间接的作用，
而不是直接清除自由基r⋯。
查阅国内外文献，虽已有大量文献证实了TP
的抗自由基作用，但是某些实验报告在比较TP与
VC强度时，只采用一或两个浓度所产生的作用进
行比较，而不是采用产生某一特定作用所需的浓度
(剂量)进行比较，这并不能确切地判断药物之间的
强弱关系。在本实验体系中采取了测定Ic。。的方法，
从而作出了较为客观和可靠的比较。
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万方数据
茶多酚和维生素C对人胚肾293细胞缺糖缺氧损伤保护作用的
比较
作者： 吕勇， 金越， 韩国柱， 周琴， 孙慧君， 李楠， L(U) Yong， JIN Yue， HAN Guo-zhu
， ZHOU Qin， SUN Hui-jun， LI Nan
作者单位： 吕勇,金越,韩国柱,周琴,孙慧君,L(U) Yong,JIN Yue,HAN Guo-zhu,ZHOU Qin,SUN Hui-
jun(大连医科大学,药理教研室,辽宁,大连,116027)， 李楠,LI Nan(大连理工大学,化学分
析教研室,辽宁,大连,116023)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(9)
被引用次数： 5次
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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200709031.aspx