全 文 ：茶多酚对人癌细胞和人体细胞增殖及凋亡的实验研究
谢冰芬 ,冯公侃 ,朱孝峰 ,李志铭 ,刘宗潮
(中山大学 肿瘤防治中心 ,广东 广州　 510060)
摘　要: 目的　选用 4种人癌细胞和 3种人体正常细胞进行试验 ,比较茶多酚 ( TP) 对人肝癌细胞 Bel-7402等和
人体肝细胞 CLC增殖周期的影响和诱导凋亡的作用。方法　用 M T T法测定 T P对人癌细胞和人体正常细胞的细
胞毒作用 ,用流式细胞仪 ( FCM ) 观察 TP对细胞的周期改变和诱导凋亡作用。 结果　 TP对人癌细胞 Bel-7402,
CNE1 , KB和 H-29的 IC50依次为 68. 2, 104. 63, 119. 83和 148. 61μg /m L;对人体正常细胞 CLC, HEK-293和 HD-
M EC 的 IC50均 > 400μg /m L。 150和 300μg /m L TP处理 Bel-7402细胞 12, 24和 36 h,细胞凋亡率分别为
13. 2% , 37. 6% , 40. 7% 和 17. 1% , 39. 9% , 57. 7%。 表明 TP可诱导 Bel-7402细胞凋亡 ,使细胞周期停滞于 S—
G2 /M期 ,而对 CLC细胞无此作用。结论　 TP对人癌细胞的细胞毒作用显著高于对人体正常细胞的作用 ,提示
TP对人癌细胞有一定的选择杀伤作用。
关键词: 茶多酚 ( TP) ;细胞增殖 ;人癌细胞 ;诱导凋亡
中图分类号: R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 06 0540 04
Experimental studies of tea polyphenols on proliferation and apoptosis
in human cancer cells and human normal cells
X IE Bing-fen, FENG Gong-kan, ZHU Xiao-feng , LI Zhi-ming, LIU Zong-chao
( Cancer Center, Sun Yat-sen Univ ersity of Medical Sciences, Guang zhou 510060, China )
Key words: tea polyphenols ( TP) ; cells pro li feration; human cancer cells; inducing apopto sis
　　绿茶及其提取物如茶多酚 ( TP) 及儿茶素
( EGCG)均有防癌抗癌作用 [1～ 3 ] ,最近流行病学研
究表明 ,以 TP为主要活性成分的绿茶可以通过各
种途径抑制肝细胞癌变 [4 ]。 绿茶具有防癌和抗癌作
用 ,但对人体正常细胞是否有影响 ,目前对此方面的
报道极少。为了探讨茶多酚对人癌细胞和对人体正
常细胞的作用 ,本研究选用了 4种人癌细胞和 3种
人体正常细胞进行生长抑制试验 ,同时选用了人肝
癌细胞 Bel-7402和人体肝细胞 ( CLC)进行增殖周
期的影响及诱导凋亡的试验 ,从而进一步了解 TP
对人癌细胞和人体细胞作用的差异性。
1　材料
1. 1　受试样品及试剂: 茶多酚 ( tea polypheno l,
T P): Sigma公司产品 ,儿茶素含量> 60% ,临用前
用三蒸水配制 ;噻唑蓝 ( M T T)粉: Janssen Ohimica
公司产品 ;氢化可的松、胎牛血清蛋白 ( FBSP)、表
皮生长因子 ( EGF) , M CDB-131培养液和 RPM I-
1640培养基: Sigma公司产品 ;顺铂 ( DDP):国内市
售产品 ;流式细胞仪: Coul ter Eli te公司产品。
1. 2　细胞株: 人肝癌细胞株 ( Bel-7402)、人鼻咽癌
细胞 ( CN E1 )、人口腔癌细胞 ( KB)、人结肠癌细胞
( HT-29)、人肝细胞 ( Chang Liver cell)和人胚肾上
皮细胞 ( HEK-293) ,上述细胞株均由本所传代保
种 ,人真皮毛细血管内皮细胞 ( HDMEC)由美国引
进。 除 HDMEC细胞培养于含氢化可的松和 EGF
的 MCDB-131培养基中外 ,其他 6种细胞均培养于
含 10% 小牛血清的 RPM I-1640培养液中 ,于
37℃ , 5% CO2条件下培养。
2　方法
2. 1　 MT T法检测 T P对细胞生长的抑制作用: 按
文献进行试验 [5 ] ,取对数生长的各种人癌细胞和人
体正常细胞于 96孔培养板接种 2× 104细胞 /孔 ,培
养 24 h后加入 25～ 400μg /mL 5个浓度的 TP,培
养 72 h ,实验结束前 4 h加入 MT T液 ( 5 mg /mL)
20μL /孔 ,再培养 4 h后 ,弃去上清液加入 DM SO
0. 1 mL /孔 ,置酶联仪 570 nm波长测吸光度 ( A )
值 ,计算细胞生长抑制率 ,并用“ Pharmacologic Ca l-
culation Sy stem < 46> Li tchfi led& Wilcoxon I”计
·540· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
收稿日期: 2002-09-30基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 39870886和 39900183) ;中山医科大学“ 211工程”重点学科建设基金资助项目 ( 98069)作者简介:谢冰芬 ( 1940— ) ,女 ,广东人 ,中山大学肿瘤防治中心副研究员 ,硕士研究生导师 , 1966年毕业于广州中山医学院 ,专业为肿瘤药理和肿瘤化疗 ,从事抗癌药物的体内外试验 ,合并化疗 ,增效减毒及抗癌作用机制研究 (包括对 DN A拓扑异构酶、 DN A引物酶、 DNA损伤和凋亡等研究 )。 近年来系统地研究了绿茶多酚、番荔枝内酯、紫草萘醌类衍生物等抗瘤作用及机制研究。
Tel: ( 020) 87765368-7333; Fax: ( 022) 87754506
算机程序求出半数抑制浓度 ( IC50 )进行比较。
细胞生长抑制率 (% )= ( 1- A实验组 /A对照组 )× 100%
2. 2　流式细胞仪测定细胞周期及凋亡:分别收集经
T P 150和 300μg /mL处理 12, 24和 36 h的 Bel-
7402细胞和 CLC细胞 ,胰酶消化 , PBS洗涤 2次 ,
70% 冷乙醇固定 ,碘化丙啶 ( PI)染色 ,流式细胞仪
进行荧光检测各细胞周期 DNA含量和凋亡率。
3　实验结果
3. 1　 M TT法测定 TP对各种细胞的细胞毒作用:
用 25～ 400μg /mL T P处理各种人癌细胞 ( Bel-
7402, CN E1 , KB和 HT-29) 72 h,对上述 4种人癌
细胞均有不同程度的生长抑制作用 ,且抑制率随
T P浓度的增加而增加 ( P < 0. 05)。它们的 IC50分
别为 68. 2, 104. 63, 119. 83和 148. 61μg /mL。上述
浓度的 T P对 3种人体正常细胞 ( CLC, HEK-293
和 HDMEC) 处理 72 h,它们的生长抑制率均 ≤
38% (在最高浓度 400μg /mL T P对上述 3种人体
正常细胞的生长抑制率分别为 38. 0% , 34. 6% 和
36. 9% ) , IC50均> 400μg /mL,见表 1和图 1。提示
T P对人癌细胞的生长抑制作用明显高于对人体正
常细胞的作用。另抗癌药顺铂 ( DDP)不管对人癌
细胞 ( IC50为 1. 89～ 3. 44μg /mL)还是对人体正常
细胞 ( IC50为 2. 12～ 13. 59μg /mL)均具有强的杀
伤作用 ,对两种细胞没有明显的选择性。
3. 2　流式细胞术 ( FCM ) 检测细胞凋亡: 人肝癌细
胞 ( Bel-7402)用 150μg /mL T P处理 12, 24和 36 h
的凋亡率分别为 1 3 . 2% , 2 7. 6% 和 4 0% ,在
表 1　 TP和 DDP对人癌细胞和人体正常
细胞生长的 IC50值 μg· mL- 1
Table 1　 IC50 value of TP and DDP on growth of human
cancer cell and human normal cell μg· mL- 1
药物 人癌细胞
Bel-7402 CN E1 KB HT-29
人体正常细胞
CLC HEK-293 HDM EC
TP 　 68. 20 104. 63 119. 83 148. 61 > 400 > 400 > 400
DDP 2. 12 4. 16 1. 89 3. 44 13. 59 5. 32 2. 12
图 1　 TP 400μg /mL对人癌细胞和
人体正常细胞生长的影响
Fig. 1　 Growth inhibitory ef fects of TP ( 400μg /mL) ag-
ainst human cancer cell and human normal cell
DNA含量频率直方图上可见典型的亚 G1峰 ,此峰
随时间的延长而增大 ,见图 2-A～ C;用 300μg /mL
TP处理 Bel-7402细胞的凋亡率依次为 17. 1% ,
39. 9% 和 57. 7% 。在未经 TP处理的对照中 , Bel-
7402在各时间点的凋亡率分别为 2. 1% , 4. 4% 和
6. 3% 。结果表明不同浓度的 TP均可诱导 Bel-7402
细胞凋亡 ,其凋亡率与 TP浓度和作用时间呈依赖
A, B, C-Bel-7402用 150μg /m L TP处理 12, 24和 36 h的凋亡峰 ; D, E, F-C LC用 150μg /m L T P处理 12, 24和 36 h的凋亡峰
A, B, C-apoptosis peak s in 150μg /m L T P treatment of Bel-7402 cells for 12, 24 and 36 h
D, E, F-apoptosis peak s in 150μg /m L TP treatment of CLC cells for 12, 24 and 36 h
图 2　 TP诱导 Bel-7402和 CLC细胞的凋亡图 (FCM检测 )
Fig. 2　 Chart of apoptosis of Bel-7402 and CLC cells induced by TP ( FCM )
·541·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
表 2　 TP对 Bel-7402和 CLC细胞周期的影响 %
Table 2　 Ef fect of TP on Bel-7402 cell and CLC cell cycle %
细胞株 组　别 12 h
G0 /G1 S G2 /M
36 h
G0 /G1 S G2 /M
Bel-7402 无药对照 49. 1 47. 1 9. 2 61. 5 34. 6 3. 9
T P 300μg /mL 53. 6 41. 8 4. 6 36. 9 60. 7 2. 4
CLC 无药对照 53. 4 34. 2 12. 4 56. 5 31. 2 12. 3
T P 300μg /mL 48. 0 38. 3 13. 7 45. 8 37. 8 15. 5
性 ,见图 3。在人体正常细胞 ( CLC)中 ,无药处理的
细胞经培养 12, 24和 36 h的凋亡率分别为 4. 8% ,
8. 9% 和 11. 9% ;用 150μg /mL TP处理的细胞凋
亡率分别为 7. 6% , 8. 8% 和 10% ;用 300μg /mL
T P处理的细胞凋亡率分别为 8. 6% , 12. 4% 和
14. 5% 。无药对照组与其他 2个 TP剂量组间的凋
亡率比较 (卡方检验 ) 无显著性差异 ( P> 0. 05) ,
提示 150和 300μg /mL 2个浓度的 TP对人体正
常细胞无明显诱导凋亡的作用 ,见图 2-D～ F。
1-对照　 2-T P 150μg /m L　 3-T P 300μg /m L
1-cont rol　 2-TP 150μg /m L　 3-T P 300μg /m L
图 3　 TP诱导 Bel-7402和 CLC细胞的凋亡率
Fig. 3　 Apoptosis rate of Bel-7402 cell
and CLC cells induced by TP
3. 3　流式细胞术检测 TP对 Bel-7402和 CLC两
种细胞增殖周期的影响: 从表 2可见 , 300μg /mL
T P处理 Bel-7402和 CLC细胞 12 h后 ,两种细胞
各周期的变化不明显 ,但处理 36 h后 ,与对照组比
较 Bel-7402细胞的 G0 /G1细胞明显减少 , S期明显
升高 , G2 /M期减少 ,提示 T P可以使 Bel-7402细胞
周期阻滞于 S— G2 /M期 ;而处理 CLC细胞 36 h
后 , CLC细胞各周期细胞分布与对照组比较 ,无明
显的改变。表明 T P对人癌细胞和人体正常细胞的
增殖周期的影响有一定的差异性。
4　讨论
　　结果表明 , 25～ 400μg /mL TP对 4种人癌细
胞均有不同程度的生长抑制作用 ,且有浓度依赖性。
T P可诱导人肝癌细胞 ( Bel-7402)凋亡 ,影响细胞
周期的进程 ,使细胞周期停滞于 S— G2 /M期 ,可能
影响细胞的有丝分裂 ,从而抑制细胞生长。而 TP对
3种人体正常细胞的生长抑制作用很弱 ,对人体肝
细胞 ( CLC)的诱导凋亡作用和增殖周期的进程影
响不明显 ,表明 TP对人癌细胞和人体正常细胞的
作用是有差异性的。此结果与 Ahmad等 [6 ]报道结
果相似 , T P的主要成分 EGCG可诱导人皮肤癌细
胞 ( ChaCaT ) 凋 亡 , 而 不 诱 导 人 表 皮 细 胞
( MHEKS)凋亡。 另亦与郭建霞等报道 [7 ] TP可影
响人肝癌细胞 ( SMMC-7721) 周期进程 ,阻于 S—
G2 /M期 ,和抑制肝癌细胞的核分裂 ,而不影响人体
肝细胞的结果是相符的。 提示 TP可选择性地杀伤
癌细胞而对人体正常细胞损伤较小。
TP可诱导鼻咽癌、胃癌、皮肤癌等多种人癌细
胞凋亡 [ 8～ 10]。诱导凋亡可能是 TP的抗癌作用机制
之一 ,凋亡可能与 Caspase-3的活化和 bcl-2表达
下调相关 ,即 T P可能通过影响信息传导通路来抑
制细胞的增殖和诱导凋亡。 TP可选择性地杀伤癌
细胞而对人体正常细胞影响较小 ,可能是因为癌细
胞的生物化学活性有别于原器官的正常组织 ,增殖
迅速 ,周期短 ,对 TP敏感 ,而人体正常组织细胞增
殖慢 ,周期长 ,对 TP不敏感。 Tolkman和 Gasparin
报道 [11, 12 ] ,实体肿瘤组织中的血管内皮细胞的倍增
时间仅为 4 d,而正常组织中的血管内皮细胞的倍
增时间为 1年 ,表明 2种细胞的增殖差异性。虽然
TP对癌细胞有选择性杀伤作用的真正机制尚未清
楚 ,但本实验结果证明 T P对人癌细胞和人体正常
细胞的杀伤作用确实存在差异 ,此差异对 TP在肿
瘤防治的开发方面有重要的意义 ,值得进一步研究。
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夏天无对小鼠学习记忆及脑内乙酰胆碱酯酶的影响
盛　瑞 ,顾振纶 ,蒋　航 ,曹　奕
(苏州大学医学院 药理教研室、苏州中药研究所 ,江苏 苏州　 215007)
摘　要: 目的　阐明夏天无制剂对记忆障碍小鼠的学习记忆功能及对小鼠脑内乙酰胆碱酯酶 ( Ach E) 的影响。 方
法　以东莨菪碱造成小鼠记忆获得障碍和乙醇造成小鼠记忆再现障碍 ,同时测定了小鼠脑内 AchE的活性。 结果
夏天无口服液及胶囊剂 0. 5, 1, 2 mg /kg对记忆障碍小鼠的学习记忆功能有不同程度的改善作用 ,并可抑制小鼠脑
内 Ach E活性。 结论　夏天无口服液及胶囊剂能增强小鼠的学习记忆功能 ,该作用可能与抑制 Ach E有关。
关键词: 夏天无 ;学习记忆 ;跳台法 ;乙酰胆碱酯酶
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 06 0543 03
Effects of Rhizoma Corydalis Decumbent is on learning and memory
ability and brain acetylcholinesterase activity in mice
SHENG Rui, GU Zhen-lun, JIAN G Hang , CAO Yi
( Depar tment of Pharmaco lo gy , Suzhou Institute o f Chinese Ma teria Medica,
Medical Colleg e o f Suzhou Univ ersity, Suzhou 215007, China)
Key words: Rhizoma Corydal is Decumbent is ( RCD) ; learning and memo ry abi li ty; step down test;
acety lcholinesterase ( Ach E)
　　阿尔茨海默病 ( AD)是严重危害老年人健康
的疾病之一 ,研究表明 ,痴呆的发生与脑内神经递质
的异常密切相关 ,其中胆碱 ( Ach) 系统尤为重要。
胆碱能假说认为中枢胆碱系统功能下降导致认知功
能受损。痴呆病人的认知能力受损程度与乙酰胆碱
酯酶 ( Ach E)活性相对增高及 Ach的相对减少呈
正相关 ,而且胆碱能系统在认知功能的恢复中也起
重要作用 [1 ]。
夏天无 Rhizoma Corydalis Decumbent is ( RCD)
具有降压镇痉 ,活血化瘀 ,行气止痛功效。 临床主要
治疗脑梗死 ,周围神经损害性瘫痪 ,腰椎间盘突出
症 ,坐骨神经痛 ,关节腰腿等疼痛及中小学生假性近
视 [2 ]。但对老年性痴呆的作用未见报道。本实验从夏
天无中提取有效部位 ,筛选实验发现其体外有较强
的 AchE抑制作用 ,推测可能对动物的学习记忆功
能产生影响。为此本实验探讨其对小鼠学习记忆等
脑功能的作用 ,同时检测小鼠脑组织中 AchE活性 ,
以期阐明该药的作用机制 ,为临床应用提供依据。
1　材料
1. 1　药物与试剂:夏天无口服液及胶囊剂由苏州中
·543·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
收稿日期: 2002-10-05基金项目:苏州市科技局社会发展基金 ( S S0126) ;专利号: 02111103. 0作者简介:盛　瑞 ( 1975— ) ,女 ,江苏常州人 ,苏州大学在读博士 ,主要从事心血管药理研究。
Tel: ( 0512) 65190599　 E-mail: sh eng rui@ 163. com