全 文 ：中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第3期2007年3月·449·
象的内在原因有待进一步研究。
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红花RAPD和AFLP分子标记技术多态性效率比较
，
张阵阵1，郭美丽1t，张军东2，张汉明1
(1．第二军医大学药学院生药学教研室，上海200433}2．第二军医大学药学院药理学教研室，上海200433)
摘要：目的 探讨RAPD和AFLP这两种分子标记技术应用于红花不同品系多态性效率的比较。方法以河南
无刺大红袍和若羌有刺白两个红花品系为材料，应用100条RAPD引物、64对AFLP引物，对两品系进行多态性
筛选，初步确定反映品系问差异的引物。结果 筛选到RAPD特异性引物共5条，分别为AA52726、AA52729、
AA52739、AA52766、AA52785，在两品系间扩增到稳定的差异片段；筛选到AFLP特异性引物共7对，分别为
AF26356、AF26372、AF26385、AF26311、AF26396、AF26327、AF26343，在两品系间扩增到稳定的差异片段。结果
表明，平均每条RAPD引物可以扩增出红花基因组片段数目4～10条，多态性选出率为0．20％，平均每对AFLP
引物可以扩增出红花基因组片段数目为50～80条，多态性选出率为0．31％。就每条(对)引物平均可以扩增出多态
性条带的数目而言，RAPD引物为1～2条，AFLP引物组合则4～5条，AFLP的检测效率明显高于RAPD。结论
在红花的分子标记研究中，AFLP较RAPD为更有效的分子标记。
关键词：红花；RAPD}AFLP；分子标记；效率比较
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)03—0449一03
Efficiencycomparisononp lymorphisminCarthamustinctoriuswithRAPDandAFLP
ZHANGZhen—zhenl，GU0Mei—lil，ZHANGJun—don92，ZHANGHan—min91
(1．DepartmentofPharmacognosy，SchoolofPharmacy，SecondMilitaryMe icalUniversity，Shanghai200433，China，
2．DepartmentofPharmacology。SchoolofPharmacy，SecondMilitaryMe icalUniversity，Shanghai200433，China)
Keywords：CarthamustinctoriusL．；randomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)；amplified
fragmentlengthpolymorphism(AFLP)；molecularmarker；efficiencyomparison
收稿日期：2006—06—27
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30271588)}国家中医药管理局课题(02—03zp54)I上海市基础研究重点项目(043919313)
作者简岔：．张畦堕11979一)，女，山东人，硕士，研究方向为生药种质资源。E-mailtZZ—jane@163．corn．
*通讯作者郭美丽E—mail：ndguo@smmu．edu．tom
万方数据
·450· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第3期2007年3月
红花为菊科一年生草本植物红花Carthamus
tinctoriusL．的干燥管状花[1]，具有扩张冠状动脉、
抗凝、降血压、耐缺氧、抗炎镇痛、防治血栓等多种药
理作用[2]，是传统的活血化瘀中药。由于长期的自然
选择和人工选择的结果，红花种内产生了明显的分
化，形成了丰富的种质资源，从外部形态到有效成分
的组成及量上均存在一定差异[3]。因此，寻找高效率
鉴定红花不同种质资源的有效分子标记技术方法具
有重要意义。
RAPDE41和AFLPE51是目前常用的分子标记。这
两种分子标记方法已在遗传群体结构分析、亲缘关
系分析以及基因图谱构建等方面得到了应用[6’7]。本
研究探讨了红花RAPD和AFLP两种分子标记方
法的多态性效率，旨在寻找红花的高效分子标记，为
进一步进行红花种质资源研究及分子辅助标记育种
研究奠定基础。
1材料与仪器
1．1材料：红花两品系河南无刺大红袍和若羌有刺
自由新疆农业科学院王兆木研究员提供，并经本课
题组多年反复纯化。幼嫩叶片采自第二军医大学药
学院药圃；琼脂糖(上海YIT0生物技术有限公
司)，Taq酶(2．5U／弘L)、dNTP(10mmol／L)、
MgCl2(25mmol／L)、10×PCRbuffer为上海天为
时代科技有限公司产品。限制性内切酶EcoRI、
MseI、T。DNA连接酶均购自NEB公司；尿素、丙烯
酰胺、甲叉丙烯酰胺、过硫酸胺、TEMED购自上海
华舜生物公司；硝酸银、剥离硅烷、亲和硅烷购自北
京鼎同生物公司；引物、接头由上海生工生物公司合
成；其余试剂均为国产分析纯。
1．2 仪器：PCR仪(Biometra公司，德国)，
ELITE300型电泳仪、GES型电泳槽：Dolphin—DOC
凝胶成像系统为美国Weahec公司产品。
2方法
2．1 模板DNA提取：以红花幼嫩叶片为材料，按
照CTAB微量法[81提取DNA。
2．2 RAPD分析：RAPD的反应体系为：Taq酶
0．04U／肛L、dNTP0．30mmol／L、Primer0．32
pmol／L、M92+1．5mmol／L、模板1．0mg／L，10×
PCR缓冲液2．5pL，DDH：O补足25pL。反应程序
为95℃预变性8min，95℃变性1min，37℃复性1
min，72℃延伸1min，40个循环，最后延伸2min。
1．5％琼脂糖凝胶电泳观察、记录。
2．3 AFLP分析
2．3．1 限制性消化与接头连接：酶切反应体系为
DNA(100ng／laL)2．5弘L，^如PI(12U／taL)0．25taL，
EcoRl(10U／I_￡L)0．25t．tL，Buffer4 pL，BSA0．2
t．tL，ddH2012．7弘L，37℃酶切3h， 2℃10min；连
接体系为酶切完成的DNA样品，再加MA(25
t-tmol／L)1．0pL，EA(5／xmol／L)0．5弘L，ATP(10
mmol／L)0．25弘L，TIDNA连接酶(3U／tLL)0．15
btl。，Buffer1．0tLL，ddH202．1肛L，16℃连接过夜。
2．3．2 预扩增：预扩增反应体系为连接完成的
DNA样品1．0pL，Moo(50ng／}tL)0．6弘L，Eoo(50
ng／}tL)0．6弘L，10×PCRBuffer2．0ttL，Taq酶(5
U／／xL)0．2弘L，dNTP(10mmol／L)0．4肛L，
ddH。015．2弘L，混合后加1滴石蜡油，进行预扩增；
反应条件为：72℃、5min；95℃、30s，56℃、30S，
72℃、2rain，20个循环；72℃、5min，4℃保温，扩
增在PCR热循环仪上进行，预扩增后，扩增产物在
1．5％琼脂糖检测，一20℃保存备用。
2．3．3选择性扩增：选择性扩增反应体系为预扩增
混合液5．0I．tL，MseI引物(50ng／btL)0．81．tL，EcoRI
弓I物(50ng／pL)0．4严L，10×PCRBuffer2．0弘L，
Taq酶(2U／uL)0．4pL，dNTP(10mmol／L)0．4
弘L，ddH。O11．0弘L，混合后加1滴石蜡油，进行选
择性扩增；反应条件为：95℃、2min；95℃、30s，65
℃、30S(每个循环降低0．7℃)，72℃、1min，13个
循环；95℃、30S，56℃、30S，72℃、1min，24个循
环；72℃、5min，4℃保温，1．5％琼脂糖凝胶电泳检
测，一20℃保存备用。
2．3．4AFLP扩增产物的电泳及银染检测：扩增产
物6％的变性PAGE凝胶，2500V恒压电泳分离，
银染检测。
3结果与分析
3．1 RAP 标记结果与分析：选用上海生工生物
公司的100条随机引物对河南无刺大红袍和若羌
有刺白两种红花品系进行PCR扩增，每条引物都能
扩增出2～10条不等的条带，平均每条引物扩增出
5．4条带。初步筛选5条引物(编号为AA52726、
AA52729、AA52739、AA52766、AA52785)在两品
系间存在多态性，多态性选出率为0．zoA。RAPD引
物平均可以扩增出多态性条带的数目为1．4条。
见图1。
3．2 AFLP标记结果与分析：选用上海生工生物公
司合成的64对引物对河南无刺大红袍和若羌有刺
白两种红花品系进行PCR扩增，每条引物都能扩增
出40～80条不等的条带，平均每条引物扩增出57
条带。初步筛选7对引物(编号AF26311、AF26327、
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第3期2007年3月·451·
AF26343、AF26356、AF26372、AF26385、AF26396)
在两品系问存在多态性，多态性选出率为0．31％。
AFLP引物平均可以扩增出多态性条带的数目为
4．8条。见图2。
H一河南无刺大红袍 R一若羌有刺白M—Marker2000
H—．HenanwueidahongpaoR、-RucqiangyoucibaiM-marker
圈1河南无刺大红袍和若羌有刺白两种红花品系部分
引物的RAPD扩增图
Fig．1AmplifiedprofilebyRAPDprimersinHenan—
Wucidahongpaoa dRuoqiangyoucibai，
twolinesinC．tinctorius
H一河南无刺大红袍 R一若羌有刺白MiMarker2 000
H—HenanwucidahongpaoR—Ruoqi ngyoucibaiM—marker
图2河南无刺大红袍和若羌有刺白两种红花品系部分
引物的AFLP扩增图
Fig．2AmplifiedprofilebyAFLPprimersinHenan—
wucidahongpaoa dRuoqiangyoucibai，
twolinesinC．tinctorius
3．3两种分子标记方法的比较：对河南无刺大红袍
和若羌有刺白品系，两种标记系统都能产生各自有
效的多态性条带，但多态性水平和检测效率各不相
同。每对AFLP的多态性检测效率大于RAPD。各
项指标的比较见表l。
AFLP分子标记方法较RAPD分子标记方法
在红花种质资源研究中为高效分子标记技术。
表1 RAPD与AFLP分子标记比较
Table1 ComparisonofRAPDandAFLPmarkers
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红花RAPD和AFLP分子标记技术多态性效率比较
作者： 张阵阵， 郭美丽， 张军东， 张汉明， ZHANG Zhen-zhen， GUO Mei-li， ZHANG Jun-
dong， ZHANG Han-ming
作者单位： 张阵阵,郭美丽,张汉明,ZHANG Zhen-zhen,GUO Mei-li,ZHANG Han-ming(第二军医大学药学
院,生药学教研室,上海,200433)， 张军东,ZHANG Jun-dong(第二军医大学药学院,药理学教
研室,上海,200433)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(3)
被引用次数： 5次
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