全 文 ：制备高效液相色谱分离纯化荷叶碱
刘婧靖, 罗旭彪, 陈　波3 , 姚守拙Ξ
(湖南师范大学 化学生物学及中药分析省部共建教育部重点实验室, 湖南 长沙　410081)
摘　要: 目的　研究制备型高效液相色谱 Pep2H PL C 分离纯化荷叶碱的方法。方法　荷叶提取物经 1% 盐酸水溶液
提取后, 用氯仿萃取。萃取液蒸干, 以流动相溶解。用 P rep 2H PL C 分离制备。收集液浓缩到一定体积析出针状晶体,
即得荷叶碱。结果　该方法所得产品经M S、IR、UV、1H 2NM R和H PL C 图谱鉴定, 与文献、对照品比较, 确定为荷叶
碱, 质量分数大于 98% , 制备收得率大于 49%。结论　本法生产周期短, 产品质量高, 方法简便, 生产费用低, 荷叶
碱产品可以用作分析方法的对照品。
关键词: 荷叶; 荷叶碱; 制备高效液相色谱
中图分类号: R 28412; R 286102　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2006) 01 0055 03
Isola tion and pur if ica tion of nuc ifer ine by prepara tive HPLC
L IU J ing2jing, LUO Xu2b iao , CH EN Bo, YAO Shou2zhuo
(Key L abo rato ry of Chem ical B io logy and T radit ional Ch inese M edicine R esearch of M in istry
of Education, H unan N o rm al U niversity, Changsha 410081, Ch ina)
Abstract: Objective　To estab lish an iso la t ion and pu rif ica t ion m ethod of nuciferine by p repara t ive
H PL C1M ethods　N elum bo nucif era leaves w ere ex tracted by 1% HC l so lu t ion, then the supernatan t w as
ex tracted by ch lo rofo rm and the residue w as ob ta ined after ch lo rofo rm evapo rat ion1 T he residue w as dis2
so lved in mob ile phases1 T he so lu t ion w as iso la ted and pu rif ied by p repara t ive H PL C1 F ract ion co llected in
su itab le eluen t t im e w as concen tra ted to a certa in vo lum e1 N uciferine cou ld be p recip ita ted as needle crys-
ta ls1 Results　Compared w ith the litera tu re and reference sub stance, nuciferine w as iden t if ied by M S, IR ,
UV 1H 2NM R , and H PL C1 T he pu rity of the p roduct w as h igher than 98% and nuciferine yield from ex2
t racts by th is m ethod w as over 49% 1 Conclusion 　T he developed m ethod is simp le, rap id, and at low
p roduct ion co st1 T he nuciferine p roduct ow n s the quality of reference sub stance1
Key words: the leaves of N elunbo nucif era Gaertn1; nuciferine; p repara t ive H PL C
　 　 荷 叶 为 睡 莲 科 植 物 莲 N elum bo nucif era
Gaertn1 的叶, 具有清热解暑、升发清阳、凉血止血
之功[1 ]。《本草纲目》载“荷叶服之, 令人瘦劣”。现代
临床广泛应用于肥胖症及高脂血症[2 ]。荷叶碱是荷
叶中的一种阿朴啡型生物碱。药理研究表明荷叶碱
为荷叶中的主要降脂活性成分[3, 4 ]。荷叶碱的需求量
不断增加, 但是目前缺少方便有效的制备荷叶碱的
方法限制了对荷叶资源进一步的开发和利用。本实
验采用制备高效液相色谱技术, 对荷叶提取物中的
荷叶碱进行制备、分离和纯化。
1　制备与分离
111　仪器与试剂:W aters P repare L C4000 高效液
相制备色谱仪, L C—10 UV 检测器 (大连江申分离
科学技术公司) , 10 mL 定量环, JS—3030 色谱工作
站 (大连江申分离科学技术公司)。JCX—250W 超声
波清洗器 (山东济宁电子仪器厂) ,LD 4—2A 高速离
心机 (上海安亭科学仪器厂) , INOVA —400 核磁共
振仪, W aters M icrom ass ZQ 2000 质谱仪, Genera l
TU —1221 型紫外分光光度计, 二次蒸馏水, 试剂均
为分析纯。荷叶提取物由本实验室制备, 酸提碱沉,
H PL C 测定荷叶碱的质量分数为 214%。
112　制备条件
11211　上样溶液的制备: 称取 10 g 荷叶提取物于
500 mL 烧杯中, 用 1% 盐酸水溶液 500 mL 浸泡 12
h, 超声 30 m in, 调节 pH 值为 3, 4 000 röm in 离心,
上清液用 250 mL 氯仿萃取 2 次, 有机相置于水浴
锅上蒸干, 用流动相溶至 30 mL , 所得溶液备用。
11212　色谱条件: 色谱柱: 反相W aters P rep N ova2
pak HR C 18柱 (300 mm ×19 mm , 6 Λm ) ; 柱温: 室
温, 检测波长: 280 nm ; 流动相: 乙腈2012% 三乙胺水
·55·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2005203203
基金项目: 国家“十五”重大专项“创新药物及中药现代化”“食品安全关键技术”; 湖南省杰出青年基金资助项目 ( 03JJY1002,
2001BA 746C, 2001BA 804A 21, 2003AA 2Z3515)3 通讯作者　陈　波　T el: (0731) 8865515　E2m ail: dr2chenpo@vip1sina1com
溶液(3∶7) ; 体积流量: 36 mL öm in。制备色谱见图1。
t öm inÉ 2降荷叶碱　Ê 2荷叶碱É 2no rnuciferine　Ê 2nuciferine
图 1　荷叶碱的制备 HPLC 谱图
F ig11　Preparative HPLC chromatogram of nuc ifer ine
113　P rep 2H PL C 收集液的处理: 将荷叶碱收集液
在水浴锅加热浓缩到一定体积, 有针状晶体析出, 即
得荷叶碱。
2　产品质量分析
211　仪器与试剂: 岛津高效液相色谱 ( SCL —
10A vp 系统控制器, SPD—10A vp UV 2V IS 检测器,
L C—10AD vp 液相色谱, S IL —10A vp 自动进样器,
Sh im adzu C lassvp 色谱管理系统) , 乙腈为分析纯,
三乙胺为分析纯, 水为二次蒸馏水。荷叶碱对照品
(中国药品生物制品检定所, 批号: 1115662200201)。
212　色谱分析条件: Spherigel C18柱 (250 mm ×416
mm , 5 Λm ) ; 柱温: 室温; 检测波长: 280 nm ; 流动相
(A ) 011% 三乙胺水溶液, (B ) 乙腈; 线性梯度洗脱:
0～ 15 m in, 60% A～ 20% A ; 15～ 20 m in, 20%
A～ 0% A。经氯仿提取纯化后样品溶液和荷叶碱产
品的色谱图见图 2 和 3。
t öm in
图 2　制备液的 HPLC 谱图
F ig12　HPLC Chromatogram of sample solution
213　产品纯度分析及收得率: 10 g 荷叶提取物约
可制备 120 m g 荷叶碱, 面积归一化定量确定产品
质量分数大于 98% , 外标法定量确定产品质量分数
为 9812%。按照质量分数为 9812% 计算原料中荷叶
碱收得率为 4911%。
t öm in
图 3　荷叶碱产品的 HPLC 图谱
F ig13　HPLC Chromatogram of nuc ifer ine product
214　产品鉴定: 纯化后得到的物质为白色针状晶
体, 分子式为 C 19 H 21O 2N , 熔点为 161～ 164 ℃。
UV ΚCH 3OHm ax nm : 271, 230。ES I2M S m öz : 296 [M +
H ]+ , 265 [M - CH 3O ]+ 。 1H 2NM R (CDC l3 ) ∆:
21593 (3H , 2N 2CH 3 ) , 31654 (3H , 单峰2O 2CH 3 ) ,
31888 (3H , 单峰2O 2CH 3 ) , 81362 (1H , 多重峰) ,
61637 ( 1H , 单峰 ) , 芳2H。 IR ΜKB rm ax cm - 1: 3 002、
1 593、1 566、1 496、1 450、1 370、1 313、1 245、
1 109、1 032、764。以上数据与荷叶碱的相关文献报
道数据[5, 6 ]相符, 并与对照品比较, 推断该化合物为
荷叶碱。
3　讨论
311　预处理条件的优化: 制备用原料中荷叶碱和杂
质将影响上样量和产品得率。比较了氨水浸泡、氯仿
提取、再 1% 盐酸反萃和用 1% 盐酸提取后、调 pH
值为 3、再氯仿萃取两种方式对进一步纯化提取物
中荷叶碱的影响。后者所得荷叶碱的量是前者的
4169 倍, 且在色谱图中杂质峰明显减少。所以, 本实
验选择后者作为进一步纯化荷叶碱的预处理方式。
312　流动相的选择
31211　乙腈对荷叶碱制备分离的影响: 考察了流动
相中乙腈与 011% 三乙胺水溶液体积比为 30∶70、
32∶68、35∶65、40∶60 时对制备荷叶碱的影响。当
乙腈高于 35% 时, 荷叶碱与原荷叶碱 (图 1 中É 部
分经质谱初步鉴定为原荷叶碱)有部分交叠, 难以得
到纯度高的荷叶碱。乙腈为 32% 时, 荷叶碱与原荷
叶碱基本达到了基线分离, 而 30% 乙腈能使荷叶碱
与原荷叶碱完全分离, 有利于进行上样量的优化。
31212　三乙胺对荷叶碱制备分离的影响: 当流动相
中乙腈与 011% 三乙胺水溶液体积比为 30∶70 时,
虽然能完全分离, 但是峰形拖尾较严重, 分离时间
长。增加峰形抑制剂的体积比例至 012% 时能有效
地改善峰形, 缩短制备分离时间。然而, 继续增加三
乙胺的量, 使得流动相碱性过高, 将严重损害柱的使
用寿命。
·65· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
313　上样量的选择: 首先利用W ater P rep N ova2
pak HR C 18柱 (300 mm ×718 mm , 6 Λm ) 色谱柱来
优化上样量, 体积流量为 6 mL öm in, 每次进样 015
mL , 分离效果好, 但是制备量偏小, 上样量约 4 m g,
当进样 115 mL , 则突破了检测极限, 不能准确收集
产品, 而当进样量为 1 mL 时, 上样量为 8 m g 左右,
不影响分离度, 且质量分数符合质量要求 (98% ,
H PL C )。使用反相W aters P rep N ovapak HR C 18柱
(300 mm ×19 mm , 6 Λm ) 进行制备, 按体积比扩大
进样量, 将流动相体积流量增为 36 mL öm in, 进样
体积扩大为 6 mL , 则上样量可达到约 48 m g, 且分
离度、质量分数均符合上述要求。根据分析色谱仪对
相应收集液进行检测, 可知Ê 部分为荷叶碱收集液。 References:[ 1 ]　Ch P (中国药典) [S ]1 V o l É 1 20001[ 2 ]　T ao B, Chen M Y, L i X N , et a l1 Review in studies on phar2m aco logical effect of N elum bo nucif erine leaves [J ]1 Inf T ra2d it Ch in M ed (中国中药信息导报) , 2001, 18 (2) : 141[ 3 ]　T u C C, L i X Y, Yang J P, et a l1 Experim en t research of theto tal alkalo ids from N elum bo nucif erine leaves effect on low er2ing hyperlipem ia in fatty m ice [J ]1 J J iang x i Coll T rad it Ch inM ed (江西中医学院学报) , 2001, 13 (3) : 12021211[ 4 ]　Xu L Y, L iu Y G, Ye Z X, et a l1 D evelopm ent and research ofeffect on low ering hyperlipem ia of N elum bo nucif erine leaves[J ]1 H ubei J T rad it Ch in M ed (湖北中医杂志) , 1996, 18(1) : 422431[ 5 ]　L i Z C, Zhuo C X, Yang S J , et a l1 Study on chem ical com 2pound of N elum bo nucif erine leaves [J ]1 Ch in T rad it H erbD rug s (中草药) , 1996, 27 (Supp l) : 502521[ 6 ]　W ang J L , H u X M , Ying W H , et a l1 Research of the alka2lo ids from seeds of N elum bo nucif erine [J ]1 J Ch in M ed M ater(中药材) , 1991, 14 (6) : 362381
大孔吸附树脂纯化栀子中总环烯醚萜苷和栀子苷的研究
姚　干1, 何宗玉1, 方积年2Ξ
(11 重庆邮电学院生物信息学院, 重庆　400065; 21 中国科学院上海药物研究所, 上海　201203)
摘　要: 目的　建立栀子中总环烯醚萜苷测定方法, 研究 H PD 450 大孔吸附树脂纯化栀子总环烯醚萜苷、栀子苷的
工艺条件。方法　采用紫外分光光度法和高效液相色谱法测定目标成分, 考察 H PD 450 大孔吸附树脂对栀子总环
烯醚萜苷、栀子苷的吸附和洗脱条件。结果　栀子总环烯醚萜苷最大吸收波长为 238 nm , 与栀子苷一致, 栀子苷在
9136～ 21184 ΛgömL 与吸光度呈良好线性关系, 平均回收率为 98137% ; H PD 450 大孔吸附树脂可以将提取物中总
环烯醚萜苷由 45145% 提高到 83172% , 栀子苷由 24146% 提高到 62128%。结论　H PD 450 大孔吸附树脂能有效富
集并纯化栀子总环烯醚萜苷、栀子苷; 紫外分光光度法测定栀子总环烯醚萜苷具有快速、准确的特点。
关键词: 栀子; 总环烯醚萜苷; 栀子苷; H PD 450 大孔吸附树脂; 紫外分光光度法
中图分类号: R 28412; R 286102　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670 (2006) 01 0057 05
Pur if ica tion of tota l ir ido id glycosides and gen iposide in Ga rden ia j asm inoides
w ith HPD 450 macroporous resin
YAO Gan1, H E Zong2yu1, FAN G J i2n ian2
(11 Co llege of B io info rm ation, Chongqing U niversity of Po sts and T elecomm unications, Chongqing 400065, Ch ina;
21 Shanghai Inst itu te of M ateria M edica, Ch inese A cadem y of Sciences, Shanghai 201203, Ch ina)
Key words: Ga rd en ia jasm inoid es E llis; to ta l irido id glyco sides; gen ipo side; H PD 450 m acropo rou s
resin; UV spectropho tom etry
　　栀子Ga rd en ia jasm unoid es E llis 是常用清热泻
火中药, 其抗菌、解热有效成分是以栀子苷为代表的
环烯醚萜苷类化合物[1 ]。H PD 450 大孔吸附树脂是
一种苯乙烯型共聚体, 在苷类成分分离、纯化中具有
较多优点。本实验对其纯化栀子总环烯醚萜苷和栀
子苷的影响因素、使用次数及再生条件进行了系列
研究, 并建立了栀子总环烯醚萜苷测定方法。研究成
果已在中药天然药物五类新药——芩栀胶囊 (SF2
DA 药物临床试验批件号: 2005L 02273) 研制中得到
了成功运用。
1　仪器与材料
　　UV —2401PC 紫外分光光度计 (日本) ; A gilen t
·75·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2005203224
作者简介: 姚　干 (1970—) , 男, 四川省阆中市人, 副研究员, 中药学博士, 博士后, 主要从事中药药效物质基础、作用机制及中药新药研
究, 发表相关论文 10 篇, 先后参与及承担国家“九五”重点科技攻关、国家“973”计划及省部级科研项目 7 项。
T el: (023) 62471381　E2m ail: cdyaogan@etang1com