全 文 ：·1862· 中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第12期2006年12月
蕲蛇药材及其市售混淆品的Cytb基因序列与分析
宋文成1，宋社吾扩，刘道芳2，刘海兵1，宋礼华2
(1．安徽大学生命科学学院，安徽合肥230001；2．安徽省生物研究所，安徽合肥230088)
摘要：目的分析蕲蛇药材正品及其市场收集样品的Cytb基因序列，为蕲蛇药材分子鉴别提供依据。方法利
用Cytb基因，对蕲蛇药材及其市场收集样品进行了序列测定和分析。结果蕲蛇药材存在着混杂现象；蕲蛇药材
正品与其市售混淆品的Cytb基因序列有着显著差异，该序列在蕲蛇种内差异率为0H～0．91％，与混淆品间的差
异率为18．57％～23．78％。结论Cytb基因序列是一种鉴别蕲蛇药材与其混淆品较好的分子遗传标记。
关键词：蕲蛇；Cytb基因；分子鉴别
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)12—1862—04
SequenceandanalysisofCytbgeneofAgkistrodonanitsadulterantssoldinmarket
SONGWen—ehen91，SONGShe—WU2，LIUDao—fan92，LIUHai—bin91，SONGLi—hua2
(1．CollegeofLifeScience，AnhuiUniversity，Hefei230001，China；2．AnhuiInstituteofBiology，Hefei230088，China)
Abstract：ObjectiveTodifferentiatethesequencesofCytbgeneAgkistrodonfromitsadulterants
soldinthemarketinordertoprovidemolecularevidenceforidentificationofAgkistrodon．MethodsCytb
genewasusedtOsequenceandanalyzeAgkistrodonanitsadulterantssoldinthemarket．ResultsThere
wasamixedphenomenoninAgkistrodonspecies．Thediff rencesofCytb genesequencebetween
Agkistrodonanitsadulterantssoldinthemarketaresignificant：thedifferenceratesamongthespeciesof
Agkistrodonare0％一O．91％，thedifferenceratesbetweenAgkistrodonanitsadulterantsare18．57％～
23．78％．ConclusionThecharacteristicsofCytbgenesequencecanbeusedasabettermolecularmarker
forauthenticatingAgkistrodonfromitsadulterants．
Keywords：Agkistrodon；Cytbgene molecularidentification
蕲蛇是一种贵重的中药材，具有祛风、通络、止
痉的功效。用于风湿顽痹、中风麻木拘挛、口眼喁斜、
半身不遂、抽搐痉挛、破伤风症、麻风疥癣。本品为蝰
科动物五步蛇Agkistrodonacutus(Genther)的干
燥体[1]。近年来，由于动物类药材资源有限，用量较
大，价格昂贵，出现了用其他蛇冒充蕲蛇或在蕲蛇体
内掺假的现象[2’3]，特别是炮制的蕲蛇和蕲蛇肉等，
除去了头、鳞、骨，更易混杂。
由于中药传统上对动物类药材品种进行鉴定，
是采用经典的形态分类学和解剖学特征，有时结合
理化分析。不仅费时费力，且准确鉴定存在相当难
度，特别是经炮制和储藏的动物类药材，其在外部形
态和组织构造等方面都有改变，依据传统的鉴定方
法更加难以准确鉴别。蕲蛇药材的鉴别，目前主要也
是根据其外部形态特征和骨骼、鳞片的形态特征[4]。
因此，市售的蕲蛇药材也较为普遍地存在着伪品和
混淆品现象。随着分子生物学技术的迅猛发展，
DNA分子遗传标记方法被引入药材品种鉴别领
域[5]，其中DNA序列分析技术具有准确性高、重复
性好等优点，而被有效地用于中药材的真伪鉴定。本
研究利用Ctyb基因，对蕲蛇药材正品及其市场收
集样品进行了序列测定与分析。
1材料与方法
1．1样品来源：采用样本分别购自蕲蛇产地的药材
市场和药房。其中5个为未经炮制蛇的药材，另外5
个为炮制过的蛇块。同时，从安徽中医学院药学系选
用经形态学准确鉴定确认的蕲蛇药材正品1条。药
材经安徽中医学院药学系王德群教授鉴定。样品来
源及编号见表l。
1．2总DNA的制备：从经过前处理的样品中，取
蛇肌肉，并刮去表层肌肉，用双蒸水清洗2～3次，
加入研钵中用液氮研成粉末，称取lmg。以下方法
收稿日期：2006—02—06
基金项目：安徽省自然科学基金资助项目(03043101)；安徽省优秀青年科技基金资助项目(04043056)
作者简介：宋文成(1981一)，男，安徽省明光市人，安徽大学生命科学学院在读硕士研究生，研究方向中药分子鉴别与新药开发。
Tel：(0551)5317751E—mail：wencheng一4318@sina．corn
*通讯作者宋社吾Tel：(0551)5317751E—mail：songshewu@126．com
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第12期2006年12月·1863·
表1试验所用的蛇类药材样品及分析结果
参见文献报道[6]。
1．3 Cytb基因片段的PCR扩增：PCR扩增的引
物为Cytb基因通用引物L14841，H151497，由
Kocher等设计的[7]。其序列为：L1484157
AAAAAGCTTCCATCCAACATCTCAGCATGA—
TGAAA3’和 H1514957AAACTGCAGCCCC—
TCAGAATGATATTTGTCCTCA3’。扩增体积为
20弘L，包括：12弘LddH20，2弘L10×buffer，2弘L
25mmol／LMgCl2，0．5肛LdNTPs(10rnmol／L
each)，1弘L0ttmol／L上游和下游引物，1UTaq
DNA聚合酶以及50～100ngDNA模板。扩增反应
在T1ThermocyclePCR仪上进行，95‘C预变性5
rain；94。C变性40s，55℃复性1rain，72℃延伸
2min，扩增35个循环；最后72℃延伸5rain。取以
上PCR产物5弘L，用1％的琼脂糖凝胶电泳，EB
染色，紫外灯下观察结果。
1．4 序列测定与分析：采用克隆测序，PCR产物经
过GelExtractionM niKit(上海华舜生物工程有
限公司)纯化后(步骤参照说明书)，通过pUCM—T
VectorSystem(上海生工生物工程技术服务有限
公司)与pUCM—T载体连接，转化感受态宿主菌
(JMl09)，通过蓝白斑筛选和特异PCR鉴定重组质
粒。交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行
测序，每个样重复测2次，每次测3个以上克隆。所
测的DNA序列样本通过“BLAST”工具(NCBI站
点)进行序列检索和同源性比较，再用
CLUSTALX、MEGA等软件分析。
2 结果
2．1 Cytb基因片段在所收集样本中的PCR扩
增：本研究用L14841和H15149引物可以在所收
集的所有样品中，扩增出380bp左右的目的片断，
见图1。
M—DNA分子量标记N一空白(水)对照1—11：样品1～11
M—DNAMarkerN—negativecontrol1—11一a．mplesNo·1一11
图1 所收集样品中Cytb基因片断PCR产物电泳图
Fig．1ElectrophoretogramofPCRproducts
ofCytbgenefragmentsfrom
collectedsamplesofAgkistrodon
2．2蕲蛇药材正品及其市场收集样品的Cytb基
因片段序列：所测蕲蛇药材正品1的Cytb基因片断
长度，不含引物为307个bp；其(GC)量为42．99％
(图2)。同一样品克隆间测序没有发现序列差异。
在市场收集的样品中，有4个样品的Cytb基
因序列与蕲蛇药材正品的序列高度同源。共仅有3
个碱基对发生了替换：样品2中第278位点A替换
了G；样品4中第78位点G替换了A和样品5中
第50位点C替换了T，而样品3的序列与蕲蛇药材
正品的序列完全相同，重复测样和克隆间也没有发
现序列差异。可以认为，这4个市场收集样品为蕲蛇
正品(图2)。
将所测的蕲蛇正品的Cytb基因序列与
GenBank中注册的核苷酸序列进行同源性比较。所
测的蕲蛇正品的Cytb基因序列与数据库中的3段
蕲蛇序列，同源性均超过了97％(AY223560，
99％；AF038883，98％和AFl71919，97％)。Cytb
基因序列在蕲蛇种内变异小，碱基序列差异率为
0％～0．91％，小于1％。
其余6个市场收集样品的Cytb基因序列出现
了分化(图2)。通过BLAST的同源性分析，样品8
和9的序列与眼镜蛇Ⅳ咖naja(Stejneger)的Cyt
b基因序列高度同源(DQ272477，同源性百分率
96％；DQ272477，同源性百分99％；样品6和10与
银环蛇BungarusmulticinctusmulticinctusBlyth的
Cytb基因序列高度同源(DQ272478，同源性百分
率100％；DQ272478，同源性百分率99％)；样品7
的序列与王锦蛇的Cytb基因序列高度同源
(AF036017，同源性百分率97％)；而样品11的序
列则与腹斑水蛇Enhydrisbocourti(Jan)高度同源
(AF499265，同源性百分率92％)。在重复测样和克
隆间也没有发现序列差异。
通过Cytb基因的序列测定和分析，在市场收
集的10个样品中，真正的蕲蛇药材正品有4个，其
一态
g
一状
m
一
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鬲帆。磊一竺缸恤一
k
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1
一
k
一
曲
一
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『一编一样
万方数据
·1864· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第12期2006年12月
1 cTTT6G^Tcc^T^TT^竹T^ccTG0cT从TAA CCAAATCATMC G(；CTTCT CTT66CMTT ACTACAC GCCAACATc^^cTT脱CITrTCATCCATCATC ACA[1io]
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图2蕲蛇药材正品及其混淆品的Cytb基因片段序列
Fig．2SequencealignmentofCytbgenefragmentofAgkistrodonanitsadulterants
余分别为混淆品，其中2个眼镜蛇，2个银环蛇，1个
王锦蛇和1个腹斑水蛇(表1)。
2．3蕲蛇与其混淆品的Cytb基因片段的序列分
析：混淆品中，2个银环蛇和王锦蛇的GC量分别为
35．18％、35．51％、37．78％，与蕲蛇药材正品的GC
含量有显著差异；2个眼镜蛇和腹斑水蛇的GC量
万方数据
中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第12期2006年12月·1865·
分别为42．67％、43．32％、41．37％，与蕲蛇药材正2个眼镜蛇样品之间有13个碱基差异，它们与蕲蛇
品的GC量无明显差异。 药材正品的差异率为18．57％～19．64％；而2个银
蕲蛇药材正品与王锦蛇间有63～64个碱基差环蛇样品之间仅有1个碱基差异，它们与蕲蛇药材
异，差异率为20．52％～20．85％；与腹斑水蛇间有正品差异率为23．13％～23．78％，以上差异包括了
64～65个碱基差异，差异率为20．85％～21．17％。碱基的置换和颠换。见表2。
表2蕲蛇药材正品及其混淆晶Cytb基因序列的差异率(下表：碱基差异率；上表：碱基差异数)
Table2 DifferentateofCytbgenesequenceamongA kistrodonanitsadulterants(down：different’rate
ofbasesequence，up：differentnumberofbasesequence)
样品号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 1 0 1 1 72 63 59 57 71 64
2 0．0033 1 2 2 73 64 60 58 72 65
3 0．0000 0．0033 1 1 72 63 59 57 71 64
4 0．0033 0．0065 0．0033 2 73 64 60 58 72 65
5 0．0033 0．0065 0．00330．0065 73 64 60 58 72 65
6 0．2345 0．23780．23450．2378 0．2378 71 59 59 1 61
7 0．2052 0．20850．20520．2085 0．20850．2313 59 58 7i 62
8 0．1922 0．1954 0．19220．1954 0．19540．19220．1922 13 59 69
9 0．1857 0．1889 0．18570．1889 0．18890．19220．18890．0423 59 67
10 0．23130．23450．23130．2345 0．23450．00330．23130．19220．1922 61
11 0．2085 0．2117 0．20850．21170．21170．19870．20200．22480．21820．1987
蕲蛇药材正品与其混淆品间，Cytb基因片断
碱基序列的差异率为18．57％～23．78％。因此，该
基因序列在蕲蛇种内的差异远远小于蕲蛇与混淆品
的种间差异。
3讨论
本研究所收集的蕲蛇药材均购买于蕲蛇产地的
药材市场和药房，但通过Cytb基因的序列测定和
分析，发现混杂现象较为严重。来自于药材市场和药
房的10个样品中，蕲蛇正品的比例不到一半。研究
中还发现主要的混杂方式有：直接将其他蛇类混杂
为蕲蛇，如样品6将眼镜蛇混杂为蕲蛇；在蕲蛇药
材内加入其他物质以增加体重。如样品4，虽然为蕲
蛇正品，但其体内两侧各有一块游离的肌肉。通过对
该肌肉的Cytb基因序列测定和分析，其序列与小
家鼠(MusmusculusLinne7)Cytb基因序列的同
源性达99％(V00711，X57780)，两次重复结果一
致。另外，通过加工制成蕲蛇块或是将蕲蛇头、尾和
皮剥离，粘贴在其他蛇体上来作为蕲蛇出售等，也是
常见的混杂方式。
Cytb基因是生物体内编码Cytb蛋白质的基
因，在线粒体基因组中，进化速度适中，在同种内个
体间保守性高，是动物类药材的理想分子遗传标记
物之一，已被有效地运用于多种动物类药材的分子
遗传标记鉴别‘引。本研究中，蕲蛇药材正品的种内个
体间Cytb基因序列差异率为oH～O．91％，而与
常见的混伪品之间的序列差异率为18．57％～
23．78％。因此，提示该基因片段可应用于蕲蛇药材
的分子鉴定。
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万方数据
蕲蛇药材及其市售混淆品的Cyt b基因序列与分析
作者： 宋文成， 宋社吾， 刘道芳， 刘海兵， 宋礼华， SONG Wen-cheng， SONG She-wu， LIU
Dao-fang， LIU Hai-bing， SONG Li-hua
作者单位： 宋文成,刘海兵,SONG Wen-cheng,LIU Hai-bing(安徽大学生命科学学院,安徽,合肥,230001)
， 宋社吾,刘道芳,宋礼华,SONG She-wu,LIU Dao-fang,SONG Li-hua(安徽省生物研究所,安
徽,合肥,230088)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(12)
被引用次数： 4次

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