全 文 ：冬凌草甲素通过线粒体途径诱导人黑色素瘤 A375-S2 细胞凋亡
张春玲1, 2, 吴立军2, 左海军2, 田代真一3, 小野寺敏3, 池岛乔1α
(11 沈阳药科大学中日医药研究所, 辽宁 沈阳　110016; 21 沈阳药科大学 天然药物化学研究室, 辽宁 沈阳　110016;
31 昭和药科大学 病态科学研究室, 日本 东京　19428543)
摘　要: 目的　研究冬凌草甲素诱导人黑色素瘤 A 3752S2 细胞凋亡的作用机制。方法　M T T 法检测冬凌草甲素
对A 3752S2 细胞生长的影响及各种 Caspase 抑制剂、佛波酯 (PM A )、PKC 抑制剂 H 27 对冬凌草甲素作用的影响;
DNA 凝胶电泳法检测细胞凋亡; LDH 法测定乳酸脱氢酶 (LDH ) 活力。结果　冬凌草甲素对A 3752S2 细胞生长有
显著抑制作用, 并能显著诱导A 3752S2 细胞发生凋亡, 其作用呈明显的量效关系和时间依赖性。形态学观察可见凋
亡小体的形成, 琼脂糖凝胶电泳可见凋亡典型的 DNA 梯带; Caspase 家族抑制剂, Caspase29 抑制剂能显著抑制冬
凌草甲素诱导A 3752S2 细胞的凋亡。大剂量 PM A (400 ngömL ) 显著抑制 34. 3 Λmo löL 冬凌草甲素诱导A 3752S2
细胞凋亡, 而小剂量 PM A (10 ngömL ) 与冬凌草甲素有协同杀死细胞的作用, 且 PKC 抑制剂 H 27 也可下调这种
凋亡作用。Caspase23 的抑制剂可抑制 Caspase23 的活力升高。结论　适宜浓度的冬凌草甲素 (34. 3 Λmo löL ) 诱导
A 3752S2 细胞凋亡, 这种作用是通过线粒体调节 Caspase 的激活来实现的。
关键词: 冬凌草甲素; A 3752S2 细胞; 凋亡; 线粒体; Caspase; PKC
中图分类号: R 28515　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 04 0423 04
Or idon in - induced A375-S2 cell apoptosis through m itochondr ia l pa thway
ZHAN G Chun2ling1, 2, W U L i2jun2, ZUO H ai2jun2, TA SH IRO Sh in2ich i3,
ONOD ERA Sato sh i3, IKEJ IM A T akash i13
(11Ch ina2Japan R esearch Inst itu te of M edical and Pharm aceu tical Sciences; 2. D epartm ent of Phytochem istry,
Shenyang Pharm aceu tical U niversity, Shenyang 110016, Ch ina; 3. D epartm ent of C lin ical and B iom edical
Sciences, Show a Pharm aceu tical U niversity, Tokyo 19428543, Japan)
Abstract: Object　To study the m echan ism s of o ridon in2induced A 3752S2 cell apop to sis. M ethods　
M T T assay, mo rpho logica l ob servat ion, agaro se gel electropho resis, LDH release and Caspase inh ib ito rs,
PM A , PKC w ere u sed. Results　O ridon in had sign if ican t apop to t ic effect on A 3752S2 cells in a do se2 and
a t im e2dependen t m anners. T he m arked mo rpho logica l changes including conden sed ch rom atin, nuclear
fragm en ta t ion and apop to t ic bodies; and DNA ladder in agaro se gel w ere ob served. T he act ivity of Cas2
pase23 w as increased after t rea tm en t w ith o ridon in abou t 6 t im es as m uch as the con tro l value, since h igh
do se PM A inh ib ited PKC act ivity, low do se PM A act ivated PKC. In th is study, 400 ngömL PM A b locked
34. 3 Λmo löL o ridon in2induced A 3752S2 cell apop to sis and PKC inh ib ito r H 27 dow n2regu la ted the apop to t ic
effect, how ever, low do se PM A (10 ngömL ) mo re sen sit ized A 3752S2 cell to o ridon in. Conclusion　O ri2
don in (34. 3 Λmo löL ) can induce A 3752S2 cell apop to sis via m itochondria2regu la ted Caspase pathw ay act i2
vat ion, PKC act ivat ion is invo lved in th is m echan ism.
Key words: o ridon in; A 3752S2 cell; apop to sis; m itochondria; Caspase; PKC
　　冬凌草甲素 (o ridon in ) 是从冬凌草 R abd osia
rubescens (H em sl. ) H ara 中提取出的一种四环二萜
类化合物, 许多研究表明它具有抑制肿瘤细胞生长
的作用[1, 2 ] , 但其对人黑色素瘤 A 3752S2 细胞生长
的抑制作用机制不明。本实验以A 3752S2 细胞为材
料, 应用光学显微镜, 琼脂糖凝胶电泳技术, 研究冬
凌草甲素抑制A 3752S2 细胞生长的作用机制。 1　材料与方法111　药品与试剂: 冬凌草甲素 (纯度> 98% )由中国科学院昆明植物研究所提供。Caspase 家族抑制剂z2VAD 2fm k 与 Caspase28 抑制剂 z2IETD 2fm k 购自 Enzym e System (CA , 美国) ; Caspase23 抑制剂z2D EVD 2fm k 与 Caspase29 抑制剂A c2L EHD 2CHO购自 Calb iochem (CA , 美国) ; Caspase21 抑制剂
·324·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 4 期 2004 年 4 月
α 收稿日期: 2003209215
作者简介: 张春玲 (1973—) , 女, 黑龙江人, 博士研究生, 主要从事天然产物抗肿瘤的机制研究。
T el: (024) 23844463　E2m ail: lzm 1993@yahoo. com3 通讯作者　E2m ail: ikejim at@vip. sina. com
A c2YVAD 2cm k 购自 Bachem (Bubendo rf, 瑞典) ;
M T T 购 自 Sigm a (M O , 美 国 ) ; p 2iodon it ro te2
t razo lium vio let ( IN T ) 与 L (+ ) 2乳酸钠为 Sigm a
(M O , 美国 ) 公司生产。N 2m ethylphen azin ium
m ethylsu lfa te (PM S) 购自中国医药公司北京采购
站。Β2n ico t inam ide aden ine dinucleo t ide (NAD ) 由
中国医药 (集团) 上海化学试剂公司提供。胎牛血
清购自北京元亨圣马生物技术研究所。
112　细胞培养: 人黑色素瘤细胞 A 3752S2 购自
A TCC (# CRL , 1872, Rockville, M D ) , 细胞于含
10% 胎牛血清, 1%L 2谷酰胺, 1×105 U ömL 青霉素
和 100 m gömL 链霉素的 R PM I21640 培养液中, 在
37 ℃, 5% CO 2细胞培养箱内培养。
113　体外药物敏感性实验: 取对数生长期A 3752S2
细胞, 接种于 96 孔培养板 (1×104ö孔) , 培养 10 h
后, 加入不同浓度 (816, 1712, 3413, 6816, 10219,
13712 Λmo löL ) 冬凌草甲素 [二甲基亚砜 (DM SO )
溶解, DM SO 浓度< 011% ], 每个浓度设 3 个平行
孔, 对照孔加不含药物的 011% DM SO 培养液, 空
白孔不加细胞只加 011%DM SO 培养液及不同浓度
冬凌草甲素, 于 37 ℃, 5% CO 2条件下继续培养 12,
24, 36, 48 h, 每孔加入 5 m gömL M T T 20 ΛL , 培养
4 h 后, 每孔加入 150 ΛL DM SO 溶解, 于酶标仪
492 nm 波长处检测各孔吸光度 (A ) 值, 按文献方
法[3 ]计算细胞死亡率并绘制各组时效反应曲线。
114　乳酸脱氢酶 (LDH ) 活力测定: 根据文献[4 ]方
法稍作改动, 将 A 3752S2 细胞接种于 96 孔培养板
中培养, 10 h 后加入冬凌草甲素, 培养 12 h 后收集
细胞加入 LDH 底物 (pH 8. 2, 0. 2 mo löL T ris2
HC l 10 mL 中各组份终浓度分别为: L (+ ) 2乳酸钠
0105 mo löL , IN T 6. 6×10- 4 mo löL , PM S 2. 8×
10- 4 mo löL , NAD 1. 3×10- 3 mo löL ) , 每孔设 3 个
平行孔, 分别测定上清液中 LDH 的量 (LDH e) 作
为细胞坏死的指数; 悬浮细胞中LDH 的量 (LDH p )
作为细胞凋亡指数; 培养瓶中贴壁细胞中 LDH 的
量 (LDH i) 为细胞内的乳酸脱氢酶的含量。计算细
胞凋亡率及细胞坏死率。
凋亡率= LDH p ö(LDH p + LDH e+ LDH i)×100%
坏死率= LDH eö(LDH p + LDH e+ LDH i)×100%
115　细胞 DNA 提取及电泳观察[5 ]: 将细胞接种于
6 孔板 (2×106ö孔) , 培养 12 h 后加入冬凌草甲素
3413 Λmo löL , 于不同时间收集细胞 ( 1× 106 ) ,
150×g 离心 5 m in, PBS 洗涤 1 次, 加入细胞裂解
液 100 ΛL (T ris2HC l 10 mmo löL pH 7. 4, ED TA
10 mmo löL pH 8. 0, T riton X2100 0. 5% ) , 4 ℃ 放
置 10 m in, 7 200×g 离心 20 m in。取上清液加 2 ΛL
RN ase A (20 ΛgöΛL ) , 37 ℃ 孵育 60 m in, 再加入 2ΛL 蛋白酶 K (20 ΛgöΛL ) , 37 ℃ 孵育 60 m in, 加入
N aC l (015 mo löL ) 及 50% 异丙醇, - 20 ℃ 放置过
夜。取出后 7 200×g 离心 15 m in, 尽量去除异丙
醇, 加入 T E 溶解液 ( T ris2HC l 10 mmo löL pH
7. 4, ED TA 1 mmo löL pH 8. 0) , 加溴酚蓝染色液,
置 100 V , 2% 琼脂糖凝胶电泳 40 m in, 用 011 m gö
mL 溴化乙啶染色 30 m in, 紫外透射仪下观察。
116　Caspase 抑制剂对冬凌草甲素诱导细胞凋亡
的影响: 将A 3752S2 细胞接种于 96 孔培养板中, 10
h 后分别加入各种 Caspase 抑制剂: z2D EVD 2fm k
( 10 Λmo löL ) , A c2YVAD 2cm k ( 10 Λmo löL ) , z2
IETD 2fm k ( 20 Λmo löL ) , A c2L EHD 2CHO ( 10Λmo löL ) , z2VAD 2fm k (10 Λmo löL ) , 60 m in 后, 各
孔加入冬凌草甲素 3413 Λmo löL , 设 3 个平行孔, 于
37 ℃, 5% CO 2条件下继续培养 12 h 后, 各孔按 113
项方法进行M T T 检测。
117　Caspase23 活力测定: A 3752S2 细胞 (5×105)
在 3413 Λmo löL 冬凌草甲素及 Caspase23 抑制剂共
同作用不同时间, 利用凋亡检测试剂盒 ( San ta,
C ruz, B io tech, CA , 美国) 测定 Caspase23 活力。
118　佛波酯 (PM A ) 及 PKC 抑制剂对冬凌草甲素
诱导细胞凋亡的影响: 将 A 3752S2 细胞接种于 96
孔培养板中, 培养 10 h 后分别处理如下: ①加入高
剂量的 PM A (200, 400 ngömL ) , 继续培养 24 h; ②
继续培养 23 h 后加入 PKC 抑制剂 H 27, 继续培养
1 h; ③继续培养 23175 h 后加入小剂量的 PM A
(5, 10 ngömL ) , 继续培养 15 m in。各种处理后加入
冬凌草甲素 3413 Λmo löL , 每种处理设 3 个平行孔,
于 37 ℃, 5% CO 2条件下继续培养 12 h 后, 各孔按
113 项方法进行M T T 检测。
119　统计处理: 数据均用 x ±s 表示, 进行 t 检验。
2　结果
211　冬凌草甲素对 A 3752S2 细胞生长、LDH 活力
及细胞凋亡的影响: 图 1 是冬凌草甲素 (816～
13712 Λmo löL ) 分别作用于 A 3752S2 细胞 12, 24,
36, 48 h 后的抑制曲线, 从图中可见冬凌草甲素对
A 3752S2 的细胞毒作用是随时间、剂量而改变的, 具
有明显的时效和量效关系。不同浓度冬凌草甲素
(816～ 13714 Λmo löL ) 作用于 A 3752S2 细胞 12 h
后, 通过测定不同部位 LDH 释放的量, 检测不同药
物剂量诱导细胞凋亡与坏死的程度。表 1 可见大剂
·424· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 4 期 2004 年 4 月
量冬凌草甲素 (13712 Λmo löL ) 作用于A 3752S2 细
胞 12 h 时, 诱导坏死的程度强于凋亡, 而在适宜的
浓度下 (3413 Λmo löL ) , 冬凌草甲素诱导其凋亡的
能力强。结果表明冬凌草甲素诱导A 3752S2 细胞的
凋亡要有适宜的浓度和适宜的作用时间。 3413Λmo löL 冬凌草甲素作用 A 3752S2 细胞 12 h 后可
见细胞在形态上的变化, 对照组细胞连接紧密, 大小
均匀, 加入冬凌草甲素作用 2 h, 可见细胞先变圆,
体积缩小, 细胞皱缩, 6, 12 h 核膜周边有的形成小
芽, 正处于形成凋亡小体的过程中 (数据未显示)。
1212 h　2224 h　3236 h　4248 h
图 1　冬凌草甲素对 A375-S2 细胞生长抑制作用
F ig. 1　Inh ibition of or idon in on A375-S2 cell growth
表1　冬凌草甲素诱导A375-S2 细胞凋亡与坏死 (x±s, n= 3)
Table 1　Or idon in - induced A375-S2 cells to apoptosis
and necrosis (x±s, n= 3)
冬凌草甲素浓度ö(Λmo l·L - 1) 凋亡率ö% 坏死率ö%
　　　　　816 1614±015 1318±015
1712 2113±019 1618±017
3414 2215±219 1814±119
6817 2710±119 3915±319
13714 2310±017 5310±115
212　细胞凋亡的电泳观察: 细胞发生凋亡时, 较显
著的生化标志是DNA 被有规律的切断, 在琼脂糖
凝胶电泳上形成梯状带子 (DNA ladder)。冬凌草甲
素 (3413 Λmo löL ) 作用 A 3752S2 细胞 12 h 时, 可
诱导其发生明显的DNA 片段化。不同时间的电泳
结果表明随着时间的增加,DNA 带子强度增强, 细
胞凋亡呈明显的时效关系, 见图 2。
图 2　冬凌草甲素诱导 A375-S2 细胞D NA 片段化
F ig. 2　Or idon in- induced A375-S2 cell
to fragmen tation of D NA
213　Caspase 抑制剂对冬凌草甲素诱导 A 3752S2
细胞凋亡的抑制作用: Caspase 家族抑制剂 z2VAD 2
fm k, Caspase21 抑制剂 A c2YVAD 2cm k, Caspase23
抑制剂 z2D EVD 2fm k, Caspase28 抑制剂 z2IETD 2
fm k 对冬凌草甲素诱导 A 3752S2 细胞凋亡有不同
程度抑制作用, z2VAD 2fm k, z2D EVD 2fm k 与 A c2
YVAD 2cm k 表现出较强的抑制效应 (P < 0101) , 而
z2IETD 2fm k 的抑制效果稍弱 (P < 0105) , 见表 2。
据此结果推测: 冬凌草甲素诱导A 3752S2 凋亡激活
了 Caspase 途径。尤其是 Caspase29 抑制剂 A c2
L EHD 2CHO 能显著下调这种凋亡作用。说明冬凌
草甲素诱导A 3752S2 细胞凋亡启动了线粒体途径,
因 Caspase29 是此途径中关键的 Caspase [6 ]。
表 2　Caspase 抑制剂对冬凌草甲素诱导
细胞凋亡的影响 (x±s, n= 3)
Table 2　Effect of Caspase inh ibitors on or idon in- induced
A375-S2 cell apoptosis (x±s, n= 3)
样　品 细胞存活率ö%
培养液 　　　10010±013
011%DM SO 9818±213
冬凌草甲素 3112±119
VAD + 冬凌草甲素 7215±1113 3
D EVD + 冬凌草甲素 6017±1143
L EHD + 冬凌草甲素 5011±3143
YVAD + 冬凌草甲素 4916±213
IETD + 冬凌草甲素 4418±212
　　与冬凌草甲素组比较: 3 P < 0105　3 3 P < 0101
　　3 P < 0105　3 3 P < 0101 vs o ridon in group
214　Caspase23 活力检测: 冬凌草甲素作用A 3752S2
细胞 12 h 后, 检测 Caspase23 活力, 结果 caspase23
活力是对照组的 6 倍左右, 见表 3。提示冬凌草甲素诱
导A 3752S2 细胞凋亡是激活 Caspase 途径。
表 3　冬凌草甲素对 A375-S2 细胞 Caspase-3
活力的影响 (x±s, n= 3)
Table 3　Effect of or idon in on activ ities of Caspase-3
of A375-S2 cell (x±s, n= 3)
样　品　　
Caspase23 活力
0 h 12 h 24 h 36 h
冬凌草甲素 511±013 3112±0123 3 2113±0143 1614±0133
D EVD + 冬凌草甲素 1015±014
　　与冬凌草甲素 0 h 组比较: 3 P < 0105　3 3 P < 0101
　　3 P < 0105　3 3 P < 0101 vs o ridon in2treated group fo r 0 h
215　PM A 及 PKC 抑制剂 H 27 对冬凌草甲素诱导
A 3752S2 细胞凋亡的作用: 文献[7 ]已报道高剂量的
PM A (200 ngömL ) 预先 24 h 加入可抑制 PKC 的
活性, 但小剂量的 PM A (10 ngömL ) 预先 15 m in
加入可激活 PKC 的活性。在本实验中发现, 预先 24
h 加入 PM A ( 400 ngömL ) 可减弱冬凌草甲素
(3413 Λmo löL ) 诱导的A 3752S2 细胞凋亡。但小剂
量的 PM A (10 ngömL ) 预先 15 m in 加入可增强冬
·524·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 4 期 2004 年 4 月
凌草甲素杀死细胞的作用。且 PKC 抑制剂 H 27
(500 nmo löL ) 较强抑制冬凌草甲素诱导 A 3752S2
细胞凋亡的作用, 见表 4。这一结果提示: 诱导
A 3752S2 细胞凋亡通过线粒体途径激活 Caspase 的
过程中, PKC 的激活参与了这一机制。
表 4　PM A 与 PKC 抑制剂对冬凌草甲素诱导
A375-S2 细胞凋亡的影响 (x±s, n= 3)
Table 4　Effect of PM A and PKC inh ibitor on or idon in-
induced A375-S2 cell apoptosis (x±s, n= 3)
样　品　　　　　 细胞存活率ö%
培养液 　　　10010±115
011%DM SO 9814±611
冬凌草甲素 4011±518
PM A (400 ngömL ) + 冬凌草甲素 6415±5173
PM A (200 ngömL ) + 冬凌草甲素 5516±819
PM A (10 ngömL ) + 冬凌草甲素 1511±0173 3
PM A (5 ngömL ) + 冬凌草甲素 1812±1193
H 27 (50 nmo löL ) + 冬凌草甲素 5015±017
H 27 (500 nmo löL ) + 冬凌草甲素 5913±3103
　　与冬凌草甲素组比较: 3 P < 0105　3 3 P < 0101
　　3 P < 0105　3 3 P < 0101 vs o ridon in group
3　讨论
　　近年来, 寻找有效的抗肿瘤天然药物成为研究
的热点之一, 文献[8, 9 ]报道冬凌草甲素对多种肿瘤具
有杀伤作用, 临床上用于治疗食管癌、肝癌等多种癌
症。体外实验研究[10 ]表明冬凌草甲素不仅可延缓细
胞从 G2进入M 期, 且对肿瘤细胞DNA、RNA 和蛋
白质合成均有明显抑制作用。但冬凌草甲素诱导肿
瘤细胞凋亡的信号转导机制未明。本研究显示冬凌
草甲素 (3413 Λmo löL ) 作用A 3752S2 细胞 12 h, 可
使 Caspase23 活力升高 6 倍。通常认为[11 ] Caspase2
1, Caspase28 具有长的 N 2末端属于上游的半胱氨
酸裂解酶, 发挥传导信号, 激活下游 Caspase23 的作
用, 从而引起 DNA 的片段化, 导致细胞凋亡。而
Caspase29 位于线粒体途径中接受细胞色素 C 传来
的信号, 最后激活下游的 Caspase23 等, 引起细胞凋
亡[12 ]。本研究发现 Caspase23, Caspase29 抑制剂能
显著抑制冬凌草甲素诱导的A 3752S2 细胞凋亡, 提
示冬凌草甲素诱导 A 3752S2 细胞凋亡可能通过线
粒体启动 Caspase 途径, 且因大剂量 PM A (400
ngömL ) 与 PKC 抑制剂均能减弱这种作用, 而小剂
量 PM A (10 ngömL ) 激活 PKC [9 ]、增加 A 3752S2
细胞对冬凌草甲素的敏感性, 说明 PKC 的激活参
与了这一过程。这一结果有助于进一步探讨其作用
机制, 同时, 冬凌草甲素 (13712 Λmo löL ) 可使细胞
大量坏死, 最新报道[13 ]认为 Fas 介导的信号转导也
可诱导坏死, 冬凌草甲素也可能发挥这样的作用。本
研究结果为研究冬凌草甲素诱导A 3752S2 细胞凋
亡与坏死的信号转导提供参考依据。
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为了加快中药现代化的进程, 交流中药指纹图谱研究的经验, 讨论入世后我国中药产业面临的挑战和对
策, 本刊在 2002 年 10 月底出版以“中药现代化”和“中药指纹图谱”为主要内容的增刊。欢迎广大读者直接向
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·624· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 4 期 2004 年 4 月