全 文 ：分光光度与 HPLC法测定荷叶总黄酮的研究
周兰香 ,黄阿根* ,谢凯舟* * ,钱建亚
(扬州大学理学院 化学化工系 ,江苏 扬州　 225009)
中图分类号: R286. 02　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 01 0035 03
　　荷叶 N emlumbo lotus用作中草药早就收载入
传统医书中 [1 ] ,现代医学研究证明荷叶浸提液有显
著降低血脂的作用 [2 ]。 我们的研究发现荷叶含有丰
富的黄酮类化合物 ,资料显示有多种植物黄酮具有
降血脂功能 [3 ] ,而对荷叶黄酮类化合物的研究非常
缺乏 ,荷叶黄酮含量的分析方法尚未见报道。我们建
立荷叶黄酮分析方法对深入开展荷叶黄酮的结构、
降脂功能因子及荷叶黄酮提取精制等方面的工作有
积极的参考价值 [4 ]。
1　材料与方法
1. 1　仪器: 722光栅分光光度计 ; Waters高效液相
色谱仪 ; 490可调波长检测仪 ; 740色谱数据处理机。
1. 2　试剂和原料:槲皮素 ( Sigma公司 )、甲醇、磷酸
为色谱纯 ,芦丁 (生化试剂 ,上海生化试剂二厂 ) ,其
它试剂均为分析纯。荷叶于 10月中旬从江苏宝应县
水泗乡荷藕科技示范区采集 ,扬州大学园艺系鉴定
为藕莲美人红品系。
1. 3　实验方法
1. 3. 1　荷叶黄酮提取方法: 新鲜荷叶低温烘干 ,水
分小于 8% ,剪成 3 mm左右的碎片 ,用 60%乙醇水溶
液 (固液比为 1∶ 40) 80℃浸提 3 h,并不断搅拌 ,抽
滤洗涤后 ,合并滤液定容 ,供分析用。
1. 3. 2　分析方法: ①分光光度法: 对 3, 5位羟基含
量较多的黄酮类化合物的测定可采用在亚硝酸盐存
在时 , Al( NO3 ) 3在碱性条件下与黄酮形成络合物 ,
在一定波长下有最大吸收峰的特点 ,进行比色分析。
标准品选用芦丁。
测定方法:将一定标准样品液 ( 300μg /mL)或
荷叶浸提液置 25 mL容量瓶中 ,用纯水补充至
12. 5 mL,加入 0. 7 mL NaNO2 ( 1∶ 20)摇匀 ,放置
5 min,加入 0. 7 mL Al( N O3 ) 3 ( 1∶ 10) , 6 min后再
加入 5 mL 1 mo l /L NaOH混匀 ,用纯水稀释至刻
度 , 10 min后于 500 nm波长处进行比色测定 ,以试
剂作为空白。
②高效液相色谱法: 荷叶浸提液的高效液相色
谱图显示 ,黄酮类化合物结构多样 ,很难一一分析 ,
故采用酸水解法先将黄酮苷水解为黄酮苷元后 ,用
高效液相色谱法测定其苷元含量 ,以槲皮素为标样
折换成具体含量。
色谱 条 件: 色 谱柱 选 用 Nova-pak C18柱
( 3. 9 mm× 150 mm) ,预柱 C18 ( 3. 9 mm× 15 mm) ,
流动相: 甲醇 -0. 4% 磷酸 ( 1∶ 1) ; 检测波长:
360 nm,流速: 1. 0 mL /min,进样量: 20μL,柱温:
室温。
标准曲线制备:精密称取干燥至恒重的槲皮素
对照品 10 mg,用甲醇定容至 100 mL容量瓶中 ,避光
保存 ,作为对照品贮备液 ;再分别准确吸取上述贮备
液 1. 0, 2. 0, 3. 0, 4. 0, 5. 0 mL,置 10 m L容量瓶中 ,
用甲醇稀释至刻度 ,然后分别准确吸取 20μL注入高
效液相色谱仪 ,记录色谱图 ,测定峰面积。
样品测定: 吸取一定量浸提液 ,适当浓缩 ,加入
5 mL25%的盐酸 ,水浴回流酸解 90 min,冷却后甲
醇定容至 50 m L,摇匀后用 0. 45μm微滤膜过滤 ,分
别吸取此溶液与对照品溶液各 20μL进样 ,样品测定
值与对照品测定值比较计算浓度。
2　实验与讨论
2. 1　分光光度法
2. 1. 1　芦丁标样的线性关系: 准确量取芦丁标准
液 ,含量分别为 30, 60, 120, 180, 240μg ,按上述检
测方法测定吸光度。测定结果用最小二乘法作回归 ,
得芦丁浓度Y ( g /L)与吸光度 A的关系为:
Y= 0. 089 9A+ 0. 004 886, r= 0. 999 5,吸光度
线性范围 0. 1～ 0. 6。
2. 1. 2　重复性试验:吸取一定量按浸提方法中所得
浸提液 ,测定吸光度 ,重复测定 6次 ,得荷叶芦丁含
量为 10. 2% ,折换成槲皮素含量为 4. 43% , RSD为
·35·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 1期
收稿日期: 2001-03-04基金项目:扬州市科委 ( YZ9850, YZ0035)及扬州大学研究基金资助项目。
* 扬州大学农学院　　* * 扬州大学测试中心
1. 24% 。
2. 1. 3　样品回收率试验:对已知样品添加一定标准
芦丁 ,测得回收率数据如表 1所示 ,当添加量小于
25%时 ,回收率接近 100% ;随着标样加量的增加 ,荷
叶中杂质干扰加剧 ,回收率升高。
表 1　不同标样下回收率的变化
样品体积
( mL)
标样量
( m L) 增加 (% )
吸光率
A
回收率
(% )
0. 8 0. 0 0. 344
0. 8 0. 4 12. 7 0. 388 100. 0
0. 8 0. 8 25. 3 0. 439 101. 4
0. 8 1. 2 38. 1 0. 515 109. 0
0. 8 1. 6 50. 8 0. 608 118. 0
0. 0 1. 0 0. 109
2. 1. 4　样品稳定性试验:将反应体系放置 10 min至
150 min后测定其样品吸光度的变化。 在 10～
40 min范围内 ,其吸光度值变化小于 5% ,相对稳定 ,
特别是在 30 min内基本无变化。
2. 1. 5　讨论: ①芦丁标样的最大波长在 490～
520 nm之间几乎不变 ,吸光度变化小于 20% ,而荷
叶浸提液在 500 nm左右有最大吸收峰 ,故选择波长
500 nm。
②标准曲线中 NaNO2、 Al( NO3 ) 3、 NaOH用量
对标准曲线的影响: 试验发现其用量在目前确定的
用量基础上变化在 50%～ 150%之间对曲线的线性
关系无影响 ,对灵敏度稍有影响 ,因此分析时只要采
用某一固定的用量 ,标准一致 ,对样品分析不会有显
著影响。
③石油醚进行预处理是常用的去除脂溶性杂质
如蜡质、叶绿素等的有效方法 ,试验发现浸提液石油
醚处理前后吸光度基本不变 ,溶媒相吸光度趋于零 ,
说明石油醚萃取处理对荷叶黄酮吸光法的分析影响
不大。
④回收率试验中可以看出 ,随着芦丁含量的增
加 ,吸光度显著增加 ,说明荷叶中杂质与黄酮类化合
物的结合物增加了测定的吸光度 ,使化学吸光法测
得的荷叶浸提物黄酮化合物含量偏高 ;这种误差程
序与测定对象的组成关系很大 ,对组成相对稳定的
体系 ,作为简便、快捷的量性分析手段是可行的 ,精
确的定量分析仍要采用高效液相色谱法。
2. 2　高效液相色谱法
2. 2. 1　槲皮素标样的线性关系:以槲皮素的峰面积
A对浓度 C进行回归 ,得回归方程为:
A= 4. 031× 105C+ 3. 776× 104 , r= 0. 998
峰面积与浓度的线性范围为: 5～ 50 mg /mL。
2. 2. 2　荷叶黄酮含量分析:干荷叶浸提按样品酸解
方法处理后进行色谱分析 , 3次测定平均得干荷叶
黄酮含量为 1. 183% 。
2. 2. 3　回收率试验:精密量取一定已知含量的浸提
液 ,加入一定量的槲皮素对照品 ,按样品测定方法处
理进行测定 ,计算回收率 ,平均回收率为 98. 12% ,
RSD= 1. 12% (n= 5)。
2. 2. 4　精密度试验: 对于同一槲皮素对照品 ,连续
进样 5次 ,结果求得 RSD为 0. 383% 。
2. 2. 5　稳定性试验: 在室温条件下 ,样品酸解液每
间隔 1 h测定一次溶液的浓度 ,求算其含量 ,以第一
次测得的含量为 100%计 ,其余与此比较计算百分
率。 结果 4 h的相对含量为 99. 17% ,可见在 4 h内溶
液的含量基本不变。
A-槲皮素对照品
B-甲醇为流动相
的浸提液
C-乙醇为流动相
的浸提液
图 1　槲皮素对照
品及荷叶浸
提液的色谱
图
2. 2. 6　讨论:①由 RP-HPLC分
析可见 ,荷叶浸提液水解的黄酮
化合物以 3号主峰物质为主 ,其
保留时间为 4. 03 min,是槲皮
素 ,故以槲皮素为标样的高效液
相色谱法来分析荷叶黄酮含量
有代表性 ,在主峰后面的 4, 5号
次峰保留时间分别为 9. 06 min
和 10. 28 min,参照文献可能是
山萘素和异鼠李素 ,因缺少标
样 ,有待进一步验证。
②图 1( C)为用乙醇取代甲
醇为流动相的色谱图 ,对比可
见 ,乙醇的峰形分辨率低 ,拖尾
严重 ,不如甲醇做流动相好。
③酸解时间比较 90 min和
120 min的数据 ,结果无显著差
异 ,说明 90 min的酸解时间可保
证黄酮苷的充分水解。
④将浸提液的乙醇水溶液蒸干 ,浓缩去除大部
分乙醇 ,补加甲醇后酸解 ,与乙醇水溶液直接酸解对
高效注液相色谱含量的影响不大。
⑤分光光度法含量分析比 HPLC分析数据明
显高 ,一方面是分光光度法杂质干扰 ,另一方面是
HPLC分析是单组份分析对照 ,不能全面反映总黄
酮含量 ,有待对组成结构进行进一步分析。
⑥用本法测定银杏黄酮含量为 0. 331% ,黄酮含
量丰富的菊花为 1. 28%左右 ,对比可见荷叶黄酮含
量丰富 ,其功能有待进一步研究。
3　小结
·36· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 1期
3. 1　用 NaNO2-Al( NO3 ) 3-NaOH体系与黄酮形成
络合物的化学吸光分析法 ,线性关系好 ,简便快捷 ,
条件一致时 ,可比性强 ,结合 HPLC分析数据进行
修正可作为定量分析用 ,为探索最佳提取工艺和中
间指标控制提供了有效评价方法。
3. 2　反相高效色谱法以槲皮素为标样定量测定荷
叶酸解液的总黄酮含量分析 ,线性关系、重复性、稳
定性好 ,回收率高。
3. 3　高效液相色谱法以槲皮素为标样分析黄酮得
率 1. 183% ,分光光度法黄酮得率 4. 43% 。
参考文献:
[1 ]　江苏新医学院 . 中药大辞典 (上 ) [M ] . 上海:上海科学技术出
版社 , 1977.
[2 ]　吴吉茂 ,毛维伦 ,江向东 ,等 . 荷叶对家兔食饵性高胆固醇血症
和动脉粥样硬化影响 [ J] .江西医学院学报 , 1987, 27( 3): 5-8.
[3 ]　王宇辉 . 中药降脂研究进展 [ J] . 中国中药杂志 , 1999, 24( 3):
184-186.
[4 ]　黄阿根 ,钱建亚 ,谭道经 . 荷叶黄酮提取工艺的研究 [ J ]. 食品
与机械 , 2000, 5: 14-18.
大孔吸附树脂在延胡索生物碱提取分离中的应用
刘俊红 ,魏峻峰 ,王洪志 ,伍孝先
(天津市中西医结合急腹症研究所 ,天津　 300100)
中图分类号: R286. 02　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 01 0037 02
　　延胡索为罂粟科植物延胡索 Corydalis yan-
husuo W. T. Wang的干燥块茎 ,含有多种生物碱 ,
以延胡索乙素 (四氢巴马汀 )为主 ,具有明显的镇痛、
催眠和镇静作用。近年来大孔树脂在药物提取分离 ,
尤其是水溶性成分的分离中 ,显示着越来越重要的
作用。 本实验将 3种大孔吸附树脂应用于延胡索生
物碱的提取分离 ,对于优化生产工艺具有一定的参
考价值。
1　实验部分
1. 1　仪器、材料与试剂:三用紫外灯 ,日本岛津 LC-
10A高效液相色谱仪 ,美国 SSI色谱工作站 ;大孔吸
附树脂 D-101、 DA-201为天津农药厂产品 , W LD-
Ⅲ 为四川中药研究所提供 ; 薄层板: 自制含 1%
NaOH溶液的硅胶 G板 , 10 cm× 20 cm。延胡索乙
素对照品购自中国药品生物制品检定所 ;甲醇为色
谱纯 ,其它试剂均为分析纯。
1. 2　树脂的预处理及再生: 称取大孔树脂 30 g ,湿
法装柱。用 4%盐酸 -乙醇液清洗至流出液加等量水
无混浊 ,然后用自来水冲洗至中性。 用过的树脂 ,用
水洗去溶剂后 ,即再生 ,可用于同类植物的分离。经
反复使用后 ,或用于不同品种的分离 ,可用稀酸或稀
碱浸泡、洗涤 ,水洗中性即可。
1. 3　吸附容量的测定: 分别取延胡索提取液 (以
mg /mL计算 )若干毫升通过 3种已处理的树脂柱 ,
收集与重量相对应流出液体积的后 15 mL,用氨水
调 pH= 12,再用乙醚 20 mL萃取 1次 ,取乙醚液置
于蒸发皿上 ,吹风机冷风吹干 , 1 mL甲醇溶解 ,作为
吸附不同重量时的样品液。 按 2000年版《中国药
典》一部延胡索薄层鉴别方法鉴定。确定树脂吸附容
量 (树脂: 生药 , g /g )分别为 D-101( 1∶ 1) , W LD-Ⅲ
( 1∶ 1) , DA-201( 5∶ 1)。
1. 4　洗脱剂的确定:分别按吸附容量将延胡索水提
取液通过 3种已处理的树脂柱 ,用水洗至流出液无
色 ,然后分别用 30% , 40% , 50% , 60% , 70% , 80% ,
90% , 95%乙醇依次洗脱 ,收集各段洗脱液 ,同 1. 3
薄层鉴别方法。 除 30%、 40%乙醇外 ,其他乙醇浓度
在延胡索乙素对应位置均有明显斑点 ,因此选择
95%乙醇为洗脱剂。
1. 5　延胡索乙素的含量 [1 ]测定
1. 5. 1　 色 谱 条 件: 色 谱 柱: phemoenex ODS
( 4. 6 mm× 250 mm) ,流动相:甲醇 -2 mol /L磷酸盐
缓冲液 ( p H= 7. 2) ( 75∶ 25) ,检测波长: 280 nm ,流
速: 0. 8 mL /min。
1. 5. 2　样品液的制备:分别按吸附容量将延胡索水
提取液通过 3种已处理的树脂柱 (树脂 30 g ) ,用水
洗至流出液无色 ,先用 40%乙醇洗脱 ,弃去 ,再用
95%乙醇洗脱 ,以每 5毫升逐段收集洗脱液 ,分别用
乙醇稀释不同的倍数 ,过膜 ,作为样品液备用。
1. 5. 3　标准曲线的制备:精密称取延胡索乙素对照
品 5. 7 mg ,用甲醇溶解 ,定容于 10 mL容量瓶 ,从中
·37·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 1期
收稿日期: 2001-05-14