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重组人细胞因子基因在转基因中药细胞中的瞬时表达
曾庆平 ,冯丽玲 ,杨瑞仪 ,符林春 ,郭兴伯
(广州中医药大学热带医学研究所 ,广东 广州 510405)
摘　要: 目的　利用转基因中药表达人细胞因子基因 ,探讨培育基因修饰 ( GM )中药的可行性。方法　将体外扩增
分别获得的人α-干扰素基因与 RAN TES基因酶切回收后插入中间载体 ,用 EcoRⅠ 和 HindⅢ 双酶切鉴定重组
子。 由大肠杆菌分离重组质粒并导入根癌农杆菌 A grobacterium tumef aciens, 通过加入卡那霉素 ( Km) 和利福平
( Rif) 筛选含重组双元载体的转化子 ,用叶盘共培养法转化苦瓜和夏枯草外植体。 结果　经 RT-PCR检测到人 α-
干扰素基因与 RAN TES基因在中药转化愈伤组织中的瞬时表达。 结论　首次报道了重组人 α-干扰素基因与
RAN TES基因在转基因苦瓜和夏枯草细胞中的表达 ,为探讨利用转基因中药抗病毒尤其是抗艾滋病开创了新途径。
关键词: α-干扰素基因 ; RANTES基因 ;转基因中药
中图分类号: R282. 13　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 01 0063 04
Transient express ion of recombinant human cytokine genes
in transgenic Chinese materia medica cells
ZEN G Qing-ping , FEN G Li-ling , YAN G Rui-yi, FU Lin-chun, GUO Xing-bo
( Institute of T ropical Medicine, Guang zh ou Univ ersity of TCM , Guang zhou 510405, China)
Abstract: Object　 To explo re the feasibility of breeding genetic modified ( GM ) medicine by express-
ing human cy tokine in t ransgenic Chinese ma teria medica. Methods　 Human interferon α gene and
RAN TES gene available f rom the amplification in vit ro were enzymatically excised, recoveried, and insert-
ed into intermedia te v ectors. The recombinants w ere identi fied by double enzyme dig estion o f EcoRⅠ and
HindⅢ . The plasmids w ere ex tracted from Escherichia col i and int roduced into A. tumefaciens , and the
t ransformants harbo ring bina ry vectors w ere screened by addi tion o f antibiotics o f kanamycin ( Km ) and ri-
fampicin ( Rif ) , and the explants o f M. charantia and P. vulgaris were t ransfo rmed by co-cultiv ation o f leaf
disks wi th A. tumef aciens st rain. Results　 RT-PCR was applied to detect the t ransient expression o f hu-
man interferonαgene and RAN TES gene in t ransfo rmed medicinal herbal calli. Conclusion　 The expres-
sion of recombinant human interferonαgene and RAN T ES gene in t ransgenicM .charant ia and P. vulgaris
cells was fi rstly repo rted, w hich opens an al ternativ e road to antiv irus, especially anti-AIDS virus, by us-
ing t ransgenic Chinese ma teria medica.
Key words: interferon-αgene; RAN TES gene; t ransgenic Chinese materia medica
　　《本草纲目》记载苦瓜 Momordica charantia L.
可“除邪热 ,解劳乏 ,清心明目” ,并能“泻六经之火”。
杨显荣从苦瓜中分离出两种核糖体失活蛋白——
α-苦瓜素和 β-苦瓜素 ,并证实其能抑制艾滋病毒的
复制 [ 1]。 Chang等也从苦瓜中分离出对艾滋病毒感
染细胞具有细胞毒性的 MAP-30[2 ]。药化分析发现 ,
夏枯草 Prunella vulgaris L. 含有两种抗艾滋病毒
有效成分——夏枯草皂苷及硫酸多糖。体外评价实
验也证实 ,硫酸多糖能显著抑制 MT-4细胞中艾滋
病毒的逆转录酶活性 [3 ]。
另一方面 ,干扰素具有广谱抗病毒活性和免疫
强化功能 ,可使病毒繁殖量降低和细胞损伤减少。
1 mg纯化的干扰素就有 2× 108个活力单位 ,大约
10个干扰素分子就能使一个细胞产生抗病毒状态。
因此 ,干扰素已作为艾滋病的辅助治疗药物 [ 4 ] ,并经
美国 FDA批准上市 [5 ]。最近发现 ,趋化因子受体可
作为艾滋病毒侵入宿主细胞的通道 ,而趋化因子
(如 RAN TES, SDF-1等 ) 则可通过竞争结合与表
达下调等机制限制艾滋病毒的感染 [6 ]。
为了提高中药的抗病毒活性及其作用的专一
·63·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 1期 2003年 1月
收稿日期: 2002-03-05基金项目:国家自然科学基金 ( 39770902, 39870725) ; 广东省自然科学基金 ( 98064) ;国家中医药管理局科研基金 ( 97Z082)作者简介:曾庆平 ( 1961— ) ,男 ,湖南常德人 ,博士 ,副研究员 ,主要从事中药生物工程研究。
性 ,我们在克隆人α-干扰素基因和 RAN TES基因
的基础上 [7～ 9 ] ,将 α-干扰素基因和 RAN TES基因
通过根癌农杆菌共培养转化系统分别导入苦瓜及夏
枯草培养细胞 ,实现了重组人细胞因子基因在转基
因中药细胞中的瞬时表达 ,为进一步获得稳定表达
人细胞因子基因的转基因中药植株并将其作为生物
反应器生产人重组蛋白创造了条件。
1　材料和方法
1. 1　中间表达载体的构建:将 RAN TES基因及α-
干扰素基因用 Bam HⅠ , KpnⅠ ( Taraka公司 )酶
切 ,电泳回收 ,插入相同酶切的 pRO KⅡ载体中 , T4
DN A连接酶 ( Promega公司 ) 连接 ,分别获得重组
质粒 pR-RAN 和 pR-Ⅰ FN。 将重组质粒转化
DH5α感受态细胞 ,挑取单菌落 ,提取质粒 DNA,以
EcoRⅠ + HindⅢ 进行双酶切 ,并在扩增后测序。
1. 2　根癌农杆菌的转化:将根癌农杆菌 LBA4404
( pAL4404) 涂于含有 Rif 50μg /mL的 Y EB平板
上 ,挑取单菌落接种于 5 mL YEB液体培养基中 , 30
℃ , 250 r /min振荡培养过夜。按常规方法制备感受
态细胞 ,用重组质粒直接转化农杆菌 [ 10]。采用 Rif
50μ g /mL和 Km25μg /mL对转化子进行双抗性
( Km
r
+ Rif
r
) 筛选及双酶切 (Bam HⅠ + KpnⅠ 及
EcoRⅠ + HindⅢ )鉴定。
1. 3　夏枯草外植体的共培养转化:选取 8～ 10 d叶
龄的夏枯草无菌幼苗 ,将叶片剪成 0. 5 cm× 1 cm大
小 ,叶柄则剪成 1 cm长度 ,转入 MS培养基 ( BA
0. 1μg /mL+ 2, 4-D 1μg /mL) 中 ,于 25℃光照条
件下预培养 3 d。挑取 YEB平板 ( Km 25μg /mL+
Rif 50 μg /mL ) 上 的 根 癌 农 杆 菌 LBA4404
( pAL4404∷ pR-RAN)单菌落 ,接种于 20μL YEB
( Km 25μg /mL+ Rif 50μg /mL)液体培养基中 ,
30℃ , 180 r /min培养过夜 ,取 400μL菌液转接 20
μL无抗生素的 Y EB液体培养中 ,继续培养 6 h, 待
吸光度 A600≈ 0. 4时即可用于转化。将菌液倒入无
菌带盖离心管内 ,加盖并封口 , 4 000 r /min离心 5
min。弃去上清液 ,加入无菌 MS液体培养基 ,重悬
菌体。 取出预培养材料 ,倒入稀释好的菌液 ,轻摇 1
min,立即取出叶片 ,置无菌滤纸上吸去多余菌液。
将叶片放回 M S培养基 ( BA 0. 1μg /mL+ 2, 4-D 1
μg /mL)中 ,加盖并封口 ,于 28℃ 黑暗中培养 3～ 4
d, 再转入含 BA 0. 1μ g /mL+ 2, 4-D 1μg /mL和
500 mg /L头孢霉素 ( Cef ) 的 MS培养基上进行脱
菌培养。
1. 4　苦瓜外植体的共培养转化:切取苦瓜无菌苗的
子叶和叶片 ,置于 2 mg /L N AA和 0. 1 mg /L BA
的 MS培养基上预培养 4 d。将预培养后的外植体
放入稀释 2倍的根癌农杆菌 LBA4404 ( pAL4404∷
pR-Ⅰ FN)菌液中 30 s。用无菌滤纸吸干残留菌液 ,
放回预培养用的培养基中 ,在 26℃ 遮光条件下共
培养 1 d。将共培养后的外植体用无激素 MS培养
液洗 2次 ,每次 30 min, 滤纸吸干残液后 ,转入含 2
mg /L N AA, 0. 1 mg /L BA和 500 mg /L Cef的
MS培养基上。
1. 5　 RT-PCR检测: 切取 100 mg脱菌培养的愈伤
组织 ,放入液氮冻干后 ,于研钵中加入 1 mL RL液
研磨 ,按柱式总 RNA抽提试剂盒 (上海华舜生物
工程公司 )说明书提取总 RNA, - 70℃保存备用。
取总 RNA加入 DNA酶 ( Taraka公司 ) , 37℃ 消
化 20 min, 用等体积苯酚 -氯仿抽提去蛋白 ,添加醋
酸铵 (最终浓度 2 mol /L) , 再加入 2. 5倍量的冷乙
醇沉淀 ,用 70%乙醇洗涤 , 50℃烘干 ,加入 50μL
TE溶解。采用 Life Technolo gies公司的 M-M LV
逆转录酶在 50℃下逆转录 30 min,然后进行 PCR。
夏枯草 cDN A的扩增条件是: 94℃ 30 s, 50℃ 30
s, 72℃ 1 min,共 35个循环。苦瓜 cDN A的扩增条
件是: 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1. 5 min,共 35个
循环。
1-pROK Ⅱ ( Eco RⅠ +
Hind Ⅲ ) 2-pR-Ⅰ FN
(EcoRⅠ + HindⅢ ) 3-100
bp梯度相对分子质量标准
1-pROK Ⅱ ( Eco RⅠ +
Hind Ⅲ ) 2-pR-Ⅰ FN
(EcoRⅠ + HindⅢ ) 3-100
bp ladd er
图 1　 pR-Ⅰ FN 的双
酶切鉴定
Fig. 1　 Identification
of pR-Ⅰ FN
by double
digestion
2　结果和讨论
2. 1　重组质粒的鉴定:α-干扰
素基因内部含有两个 EcoRⅠ
切点 ,用 HindⅢ和 EcoRⅠ 双
酶切时 , pR-Ⅰ FN可产生 5
个片段 ,依次为 Hin dⅢ -Hind
Ⅲ (约 600 bp) , Hin dⅢ -EcoR
Ⅰ ( 121 bp) , EcoRⅠ -EcoRⅠ
( 141 bp ) , EcoRⅠ -EcoRⅠ
(约 900 bp) , EcoRⅠ -HindⅢ
(约 9 kb) (图 1-2) ;而 pROK
Ⅱ 只产生两个片段 ,分别约
1. 2 kbHindⅢ -EcoRⅠ 片段
和约 9 kb Hin dⅢ -EcoRⅠ片
段 (图 1-1)。
pR-RAN 的 HindⅢ -
EcoRⅠ 双酶切产物为 9 kb
HindⅢ -EcoRⅠ 片段和 1. 5
kb HindⅢ -EcoRⅠ 片段 (图
2-2 ) ; p RO KⅡ 经 HindⅢ -
EcoRⅠ 双酶切可产生约 1. 2
·64· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 1期 2003年 1月
1-pROKⅡ ( Eco RⅠ +
HindⅢ ) 2-pR-RN A
( EcoRⅠ + HindⅢ )
3-100 bp梯度相对分
子质量标准
1-pRO KⅡ ( EcoRⅠ +
HindⅢ ) 2-pR-RAN
( EcoRⅠ + HindⅢ )
3-100 bp ladder
图 2　 pR-RAN 的
双酶切鉴定
Fig. 2　 Identificat-
ion of pR-
RAN by
double di-
gestion
kbHin dⅢ -EcoRⅠ 片段和约 9
kbHin dⅢ -EcoRⅠ 片段 (图 2-1)。
以上结果表明 , α-干扰素基
因和 RAN TES基因已分别插入
pRO KⅡ 载体中 ,而且由此获得
的中间表达载体的酶切图谱正确。
2. 2　 α-干扰素基因在苦瓜细胞
中的表达分析: 将 pR-Ⅰ FN导入
根癌农杆菌构成二元载体系统 ,在
其中微型 Ti质粒 pAL4404的
Vir基因协助下 [11 ] , p R-Ⅰ FN中
携带α-干扰素基因的 T-DNA片
段可整合在苦瓜细胞染色体上 ,
α-干扰素基因则在 CaMV启动
子作用下转录产生 α-干扰素
m RNA,通过 RT-PCR即可对其
进行检测 (图 3)。
从图 3可以看出 ,未转化愈
伤组织 (图 3-1 )无 α-干扰素基
因存在 ,而转化愈伤组织 (图 3-
2, 3 )则可检测到 α-干扰素基因
的扩增产物 ,提示该扩增产物可
1-未转化愈伤组织 PCR产物　 2-转化叶片愈伤组织 PCR产物
3-转化子叶愈伤组织 PCR产物　 4-转化叶片愈伤组织总 RN A
经 DN A酶消化后的 PCR产物　 5-转化子叶愈伤组织总 RN A
经 DN A酶消化后的 PCR产物　 6-转化叶片愈伤组织总 RN A
经 DNA酶消化后的 RT-PCR产物　 7-转化子叶愈伤组织总
RNA经 DNA酶消化后的 RT-PCR产物　 8-100 bp梯度相对
分子质量标准
1-PCR amplicon of unt ransformed leaf-derived calli ( ULDC)
2-PCR amplicon of t rans fo rm ed leaf-deriv ed calli ( TLDC)
3-PCR amplicon of t ransformed co tyledon-deriv ed calli ( TCDC)
4-PCR amplicon of T LDC, f rom total RN A dig es ted by DNase
5-PCR amplicon of T CDC, f rom total RN A dig es ted by DNase
6-RT-PCR am plicon of T LDC, f rom total RN A dig es ted by
DNase　 7-RT-PCR amplicon of TCDC, f rom total RN A dig es t-
ed by DNase　 8-100 bp ladder
图 3　转基因苦瓜愈伤组织的 RT-PCR鉴定
　　　 Fig. 3　 Assay of transgenicM. charantia
calli by RT-PCR
1-转化叶片愈伤组织总 RN A经 DN A酶消化后的 PCR产物　
2-转化叶片愈伤组织总 RNA经 DN A酶消化并去蛋白后的
RT-PCR产物　 3-转化叶片愈伤组织总 RN A经 DN A酶消化
而未去蛋白的 RT-PCR产物　 4-pT-RAN质粒的 PCR产物　
5-100 bp梯度相对分子质量标准
1-PCR amplicon of t rans formed leaf-deriv ed calli ( TLDC ) ,
f rom total RN A diges ted by DNase　 2-RT-PCR amplicon of
T LDC, f rom total RNA dig es ted b y DNase and d eprival of pro-
tein　 3-RT-PCR amplicon of TLDC, f rom total RN A diges ted
by DNase but not deprival of protein　 4-PCR amplicon of plas-
mid pT-RAN　 5-100 bp ladder
图 4　转基因夏枯草愈伤组织的 RT-PCR鉴定
Fig. 4　 Assay of transgen icP . vulgaris calli by RT-PCR
能来自转化的植物细胞或根癌农杆菌本身。 为了消
除α-干扰素基因对 RT-PCR检测 α-干扰素 mRNA
的干扰 ,我们用 DNA酶完全消化转化愈伤组织总
RNA提取物 ,以彻底除去 α-干扰素基因拷贝 ,结果
在 PCR扩增后未检测到 α-干扰素基因的扩增产物
(图 3-4, 5) , 表明 α-干扰素基因相关的 DNA已不
复存在。 以此无 DNA的转化愈伤组织总 RNA为
模板 ,再进行 RT-PCR扩增 ,结果检测到 α-干扰素
基因表达产生的 mRNA (图 3-6, 7 )。
2. 3　 RAN T ES基因在夏枯草细胞中的表达分析:
二元载体系统中 RAN T ES基因所在的 T-DNA可
以整合在夏枯草细胞中的染色体上 ,并在 CaMV启
动子作用下表达。采用经 DNA酶消化的转化愈伤
组织的 RT-PCR, 已检测到 RAN T ES基因的表达
产物 (图 4-2, 3 ) ,其大小与 pT-RAN 质粒中的
RAN TES基因 (图 4-4 ) 相同。 此外 ,去蛋白的
RT-PCR产物的检测信号 (图 4-2) 明显强于未去
蛋白的 RT-PCR产物 (图 4-3 ) ,提示 DNA酶可能
通过消化 RAN TES基因的逆转录产生的 cDN A而
降低模板的数量 ,从而使扩增产物显著减少。
RT-PCR检测结果表明 , α-干扰素基因与
RAN TES基因已分别进入苦瓜细胞核及夏枯草细
胞核 ,并在其中合成出相应的 α-干扰素 mRNA和
RAN TES m RNA。 至于二者是否已整合在细胞核
内染色体上 ,则需待它们再生完整植株后再通过
Southern印迹杂交加以证实。
·65·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 1期 2003年 1月
在中药新药研制过程中 ,除了积极寻找中药有
效成分外 ,也应重视生物技术在改造传统中药中的
重要作用。 陈炬在烟草中成功表达人 α-干扰素基
因 [12 ]。随后 , Edelbaum又分别在烟草和水稻中表达
了人 β -干扰素基因 [13 ]。 然而 ,这些植物本身无药用
价值 ,其用途有限 ,迄今为止尚未报道人 α-干扰素
基因和 RAN TES基因在中药细胞中的成功转化与
表达。为此 ,我们开展的转人 α-干扰素基因苦瓜及
转人 RAN T ES基因夏枯草的研究工作 ,首次报道
了人细胞因子基因在转基因中药细胞中的瞬时表
达 ,这将有助于最终培育基因修饰 ( genetic modi fi-
cation, GM ) 中药 ,由此可将病原体或肿瘤抗原基
因、抗病毒基因及其他有用基因引入中药细胞 ,以育
成可以口服的转基因疫苗以及对中药原有药理活性
产生增效作用的转基因中药。
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transg enic plan ts [ J ]. Interferon Res , 1992, 12: 449.
rRNA基因间隔区碱基测序对当归进行鉴定的研究
姬可平 ,李应东* ,张西玲* * ,李啸红
(甘肃中医学院 生物学教研室 ,甘肃 兰州 730000 )
摘　要: 目的　通过 rRN A基因内转录间隔区的碱基序列测定 ,对当归进行分子水平鉴定。方法　常规提取当归种
籽 DN A, 利用合成的特异性引物对其 rRN A基因内转录间隔区进行套式 PCR扩增 ,将扩增产物进行碱基序列测
定。结果　琼脂糖凝胶电泳证实当归种籽中 rRN A基因内转录间隔区 PCR扩增产物存在 ;经测序后得到了当归种
籽 rRNA基因内转录间隔区的碱基序列。结论　 rRN A基因内转录间隔区的碱基序列测定可做为分子水平鉴定植
物性中药材的又一有效途径。
关键词: 当归 ;套式 PCR; DN A测序 ; rRNA基因 ;分子鉴定
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 01 0066 04
Identification by measuring internal transcribed spacer
regions of rRNA gene in Radix Angelicae Sinens is
JI Ke-ping , LI Ying-dong , ZHANG Xi-ling , LI Xiao-hong
( Depar tment of Bio lo gy , Gansu Colleg e o f TCM , Lanzhou 730000, China)
Abstract: Object　 To set up an identified standard on the lev el of molecule th rough measuring the in-
ternal t ranscribed spacer regions o f the rRN A gene in Radix Angelicae Sinensis . Methods　 To ex t ract
·66· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 1期 2003年 1月
收稿日期: 2002-04-24基金项目:甘肃省自然科学基金资助项目 ( ZS011-A25-058-Y)作者简介:姬可平 ( 1956— ) ,男 ,甘肃中医学院基础课部副主任 ,生物学教研室副教授 ,《中国优生与遗传杂志》编委、副主编 , 1982年毕业于西北师范学院生物系 ,获理学士学位 ,研究方向主要为分子生物学理论与技术在中草药质控标准、鉴定方面的应用及中草药对优生和遗传方面的影响。主持省级科研课题 1项 ,厅局级课题 1项 ,参加省级课题 3项 ,厅局级课题 4项 ,获厅局级科研三等奖 1项。 Tel: ( 0931) 8666534
* 本院中心实验室　　* * 本院中药鉴定教研室