全 文 ：中草药 C h i ns e eT r ad it i n a ol a nd Her bal D r u g s 第 3 5卷第 1 0 期 20 0 4 年 1 0 月 · 1 1 6 7 ·
· 药材与资源 ·
人 R AN T E S基因在转基因青篙植株中表达的测定
冯 丽玲 , 曾庆平 , 杨雪芹
(广州中医药大学热带医学研究所 ,广东 广州 5 1 0 4 0 5)
摘 要 : 目的 为了增强青篙的特异药理活性 ,探讨人 卜趋化因子 R A N T E S 基因在青离细胞中表达的可能性 。 方
法 将克隆的 R A N T E S 基因经 iT 质粒衍生 的双元表达载体 p R O K H 导人根癌农杆菌 L B A 4 4 o 4 菌株 , 通过叶盘
共培养法已获得一批表现卡那霉素抗性的转基因青篙植株 。 结果 P C R 和 S o ut h er n 印迹杂交分析表明 , R A N T E S
基因已导人并整合到青蓄基因组中 ; R T 一 P C R 、 N or th er n 印迹 、 W es t er n 印迹杂交结果证实 , R A N T E S 基因已在转
基因青篙植株中成功表达 。 结论 首次报道 了 R A N T E S 基因在转基因青篙植株中的表达 ,为基因工程改造青禽打
下了 良好的基础 。
关键词 :青篙 ; R A N T E S 基因 ; 转基因中药
中图分类号 : R 2 8 2 . 1 2 文献标识码 : A 文章编号 : 0 2 5 3 一 2 6 7 0 ( 2 0 0 4 ) 1 0 一 1 1 6 7 一 0 5
A s s a y o f h u m a n R A N T E S g e n e e x P r e s s e d in t r a n s g e n i c P l a n t s o f A rt e m i s ia a n n u a
F E N G L i
一
l i n g
,
Z E N G Q in g
一
p i n g
,
Y A N G X u e
一
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( T r o p ie a l M
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e in e I n s t i t u t e
,
G u a n g z h
o u U n i v e r s i t y o f T r a d i t io n a l C h i n e s e M
e d ie i n e
,
G
u a n g z h
o u 5 1 0 4 0 5
,
C h i n
a )
A b s t r a e t : o b j e e t T o e n h a n e e t h e s p e e if i e p h a r m a e o l o g i e a l a e t i v i t y o f A
.
a n n u a a n d e x p l o r e t h e p o s s i
-
b i l i t y f o r e x p r e s s io n o f h u m a n 日一 e h e m o k i n e R A N T E S g e n e i n A . a n n u a e e l l s . M e t h o d s T h e C l o n e d
R A N T E S g e n e w a s i n t r o d u e e d i n t o A g r o ba c t e ir u m t u m找人Z e i e n s L B A 4 4 0 4 s t r a i n b y T i p l a s m id 一 d e r i v e d b in a -
r y v e e t o r p P O K l l
.
A b a t e h o f t r a n s g e n i e A
.
a n n u a p l a n t s w i t h k a n a m y e i n r e s i s t a n e e w a s r e g e n e r a t e d b y
d i s k e o e u l t i v a t i o n P r o e e d u r e
.
R e s u l t s T h e a s s a y b y P o l y m e r a s e e h a i n r e a e t i o n ( P C R ) a n d S o u t h e r n b lo t
-
t in g s h o w e d t h a t R A N T E S g e n e h a d i n t r o d u e e d a n d i n t e g r a t e d i n t o t h e g e n o m e o f A
.
a n n u a
.
T h e r e s u l t s
o f R T
一
P C R
,
N o r t h e r n b l o t t i n g
, a n d W
e s t e r n b l o t t i n g e o n f i r m e d t h a t R A N T E S g e n e h a d e x p r e s s e d s u e
-
e e s s f u l l y i n t r a n s g e n i e A
.
a n n u a p l a n t s
.
C o n e l u s i o n T h e e x p r e s s io n o f R A N T E S g e n e i n t r a n s g e n i e A
.
a n n u a p l a n t s
,
w h i e h p a v e a d i r e e t p a t h t o m o d i f y A
.
a n 儿u a b y g e n e t i e e n g i n e e r i n g
.
K e y w o r d s
: A rt e m i s i a a n n u a L
.
; R A N T E S g e n e ; t r a n s g e n i e C h i n e s e m a t e r ia m e d i e a
青篙 A rt e m is ia a n n u a L . 用于治疗暑热外感 、
阴虚发热 、 湿热黄疽诸证 ,其功用在历代草本 中均有
丰富记载 。 作为世界卫生组织极力推崇 的抗疟药有
效成分— 青篙素是我 国科学工作者从青篙中分离的化学单体 。 同时 ,青篙素还具有免疫调节功能 l[] ;
青篙素衍生物青篙琉醋钠有抗肿瘤作用图 ; 青篙甲
醇提取物 N l , N S , N l o 一三 一 P 一香豆酞精眯及相关酞
胺类化合物能抑制艾滋病病毒蛋 白酶活性闭 。 鉴于
青篙资源的 日益短缺及化学合成上的困难 ,采用基
因工程手段培育高产青篙素品种正在受到国外学者
的关注#[, 5〕。 为了探讨利用基 因工程手段改造传统 中
药的可能性 , 在人 R A N T E S 基因克隆的基础上 6j[ ,
利用青篙作为转基因模式系统 , 采用叶盘共培养法
将 R A N T E S 基因通过根癌农杆菌双元载体系统导
人青篙 细胞 , 获得稳定表达重组人 R A N T E S 基 因
的转基因青篙植株 。
1 材料
1
.
1 青篙种子 : 青篙 A rt e m is a a n n u a L . 种子 由广
州华立健药业有限公司提供 。
1
·
2 根 癌 农 杆 菌 : 根 癌 农 杆 菌 ( A g or ba ct er iu m
t u m ej 及c i e n s ) L B A 4 4 0 4 ( p A L 4 4 0 4 ) 菌株和 T i 质粒
载体 p R O K n 由中国科学院微生物研究所提供 。 含
有人 R A N T E S 基 因的表达载体 p R 一 R A N 由本室
构建 [ 7 ] 。
1
.
3 植物激素和抗生素 : 6一节氨基 嗦吟 ( B A ) ,新
华活性材料研究所产 品 ; a 一禁乙酸 ( N A A ) , 上海曹
收稿 日期 : 2 0 0 4一 0 1一 0 3签金项目 : 国家自然科学基金新技术探索项 目 ( 3 0 2 7 1 5 9 1 ) ;
( 0 2
一 o 3 Z P 4 3 ) ;健桥科研基金项 目 ( JQ 0 2 0 5 )
广东省 自然科学基金重点项 目 ( 0 2 0 79 ) ; 国家中医药管理局基础研究项 目
作者简介 :冯 丽玲 ( 1 9 7 5一 ) ,女 , 广东广州人 ,学士 ,研究实习员 , 主要从事中药生物工程研究 。
T e l
:
( 0 2 0 ) 3 65 8 5 4 2 2 E
一
m a i l
:
f e n g l i l i n只 l @ Z l e n
.
e o m
·
1 1 6 8
. 中草药 C h in e s e T r a d i t i o n a l a n d H e r b a l D r u g s 第 3 5卷第 1 0期 2 0 0 4年 1 0 月
杨第二 中学化工厂产品 ;头抱霉素 ( C fe ) 和卡那霉
素 ( K a n ) , S i g m a 公司产品 ;利福平 ( R if ) , 广东 台
山新宁制药厂产品 。
.1 4 扩增引物 : 人 R A N T E S 基 因的扩增引物 , 其
中 上 游 引 物 的 序 列 为 : 5’ 一A T G A A G G T C T C -
C G C G G C A C G C C T C
一
3 ` ; 下 游 引 物 的序 列 为 : 5` -
C T A G C T C A T C T C C A A A G A G T T G A T
一
3`
, 由大连
T a k a r a 公司合成 。
1
,
5 酶及 其 他 试 剂 : D N A 酶 、 R T 一 P C R 试 剂 盒
( m R N A S e l e e t i v e P C R K it )
,
T a k a r a 公 司 ; 1 0 0 b p
l a d d e r
、
T a q 酶 , p r o m e g a 公 司 ; l o x 扩 增缓 冲液 、
d N T P
、
B i o
一
1 1
一
d U T P
、
D A B 浓缩显色液 , 华美公司 ;
质粒 D N A 纯化 试 剂 盒 ( C o n e e r t R a p id P l a s m id
M i n i p r e p S y s t e m )
、
D N A 片段回收试剂盒 ( C o n e e r t
R a p id G e l E x t r a e t io n S y s t e m )
,
L if e T e e h n o lo g i e s
公司 ; 植物 D N A 提取 试剂 盒 ( E . 2 . N . A . lP a nt
D N A iK t )
、 植 物 R N A 提取 试剂 盒 ( E . 2 . N . A .
P l a n t R N A K i t )
,
O m e g a 公 司 ; R A N T E S 标准 品 ,
In t e r g e n 公司 ;一抗 (羊抗人 R A N T E S C 1 9 抗体 ) ,
S a n t a C r u z 公 司 ; 酶标二抗 ( H R P 标记 的马抗羊
I g G )
,
J
a k s o n Im m n o R e s 公司 。
2 方法
2
.
1 青篙种子发 芽和无菌苗培养 : 青篙种子先在
7 5% 乙醇中浸泡 30 5 , 再在 5% N a CI O 中浸泡 15
m in
,无菌水洗涤 4 次后 , 播种于 1 2/ M S 培养基 , 26
℃ 暗培养 3 d , 出芽后在 2 5 C ,光照 ( 1 0 0 0 0 l x ) 培
养 , 光照时间为 16 h 。
2
.
2 根癌农杆菌转化 : 将 L B A 4 4 O 4 菌液涂在加有
50 雌 /m L iR f 的 Y E B 平板上 , 28 ℃ 培养过夜 。 挑
取单菌落 ,接种 于 s m l、 Y E B 培养液 ( 50 拌g /m L
R i f ) 中 , 2 8 ℃ 、 2 5 o r /m i n 振荡过夜 。 用 p R 一 R A N 转
化 I J B A 4 4 o 4 , 在加有 5 0 拌g /m l咨 R i f 和 2 5 拼g /m L
K an 的 Y E B 平 板 上 筛 选 携 带 双 元 载 体 ( p A L
4 4 0 4二二p R 一 R A N ) 的转化子 。
2
.
3 叶盘共培养 : 选取培养 8一 10 d 的青篙无菌幼
苗 ,将叶片剪成约 5 m m 长的小块 ,转人 N 6 培养基
( N A A .0 5 拌g /m l 才 ) 中 , 于 25 C 、 光 照条件下预培
养 Z d 。 挑取 Y E B 板 (K a n 2 5 拼g /m L + R if 5 0 拌g /
m L ) 上含双元载体的农杆菌单菌落 , 接种于 4 m L
Y E B ( K a n 2 5 拜g / m L + R i f 5 0 拜g /m L ) 液体培养基
中 , 2 8 ℃ 、 1 8 0 : /m i n 培养过夜 。 取 4 0 0 拜L 菌液转接
人 20 m L 无抗生素 Y E B 液体培养中 ,继续培养 6
h
。 将菌液倒入无菌离心管内 , 4 o 0 r /m in 离心 5
m in
,弃上清 ,加人 20 tn I J N 6 液体培养基 。 将预培养
材料取 出 , 倒入稀释后的菌液 , 轻轻摇晃 1 m in , 取
出外植体置于无菌滤纸上吸去菌液 。 将外植体放 回
N 6 培养基 ( N A A 0 . 5 拌g /m L ) 中 , 于 28 ℃ 、 黑暗
中培养 Z d 。 将外植体转到 N 6 培养基 ( N A A 0 . 3
陀 /m )L 中 , 于 25 ℃ 光照培养 Z d , 转人含 25 拜g /
m L K a n 和 5 0 0 拌g / m L C e f 的 M S 培养基 ( B A I
扛g /m I J + N A A 0 . 2 拜g /m L ) 中进行杀菌筛选培养 。
将转化绿芽转入上述筛选培养基 , 每隔 1周更换一
次新鲜培养基 。
2
.
4 转基因植株的分子检测
2
.
4
.
1 P C R
: 按植物 D N A 提取试剂 盒说明书操
作 ,分别提取转基因和未转基 因青篙叶片的 D N A ,
在 50 拜L 反应体 系中用上 、下游引物进行 P C R 扩
增 , P C R 产物于 1% 琼脂糖凝胶中电泳 。
2
.
4
`
2 oS
u t h e r n 杂交 : 将青篙 D N A 用 E co R I 进
行单 酶切和 0 . 8% 琼 脂糖凝胶 电泳 , 将凝胶 放在
Z o x S S C 浸润 的尼龙膜上 ,采用高盐转移法转膜 ,
然后将膜在紫外交联仪中照射 4 m in 。 以人 件趋化
因子 R A N T E S 基 因为探针 ,按生物素标记及显色
试剂盒说明书进行标记和显色 。
2
.
4
.
3 青篙 R N A 提取与 R T 一 P C R : 按植物 R N A
提取试剂盒说明书分别提取转基因和未转基因青篙
叶片的总 R N A ,加入 D N A 酶 , 3 7 ℃ 消化 2 0 m i n ,
用等体积苯酚 一氯仿抽提去蛋 白 , 添加醋酸按 (终浓
度 2 m ol / L ) ,再加人 2 . 5 倍量冷 乙醇沉淀 ,用 70 %
乙醇洗涤 , 50 ℃ 烘干 ,加人 50 爪 J T E 溶解 。 按以下
条件进行 R T 一 P C R 扩增 : s o oC 、 3 0 m i n ~ 8 5 cC 、 l
m i n ; 4 5 ℃ 、 1 m i n ; 7 2 ℃ 、 1 m i n ; 共 3 0 个循环 。
2
.
4
.
4 N o rt h er n 杂交 : 将青篙 R N A 在 l % 甲醛
变性凝胶 电泳中进行分离 ,按 S o ut h er n 杂交法进行
转膜和杂交显色 ,但不经过变性和中和处理 。
.2 .4 5 青篙 蛋白提取 与 W es t er n 杂交 : 按 文献闭
方法提取青篙总蛋白 。 取 20 产L 总蛋白与 20 产L 载
样缓 冲液混合 , 95 ℃ 加热 5 im n ,经聚丙烯酞胺凝
胶电泳 、 转膜 、 洗膜 、 封闭后 , 依次加人 1 , 1 0 0 一
抗 (羊抗人 R A N T E S C 1 9 抗体 ) 和 l : 1 0 0 0 酶标
二抗 ( H R P 标记的马抗羊 Ig G ) ,用 D A B 显色 。
3 结果
3
.
1 青篙的转化和筛选 :经共培养转化的青篙叶盘
在加有抗生素的选择培养上生长 4一 6 d 后 , 叶盘周
边长出颗粒状愈伤组织 ,并不断膨大 ( 图 1一 a ) , 14 ~
21 d 开始出现绿芽分化 (图 1一 b ) ,继续培养 ,并淘汰
白化苗及畸型苗 , 可获得形态正常的 K an 抗性绿苗
(图 1一 e ) 。
中草药 C h in e s e T r a d i t io n a l a n d H e r ha l rD u g s 第 5 5卷第 2 0期 2 0 0 4年 1 0 月 一 1 1 6 9 ·
a一转化愈伤组织 b一转基 因芽 c一转基因植株
a一 t r a n s f o r m e d e a ll i b
一 t r a n s g e n i e s h o o t s e
一 t r a n s g e n i e p la n t s
圈 1 叶盘法转化的转甚因 * 茜植株
F i g
.
1 T r a n s g e亩 c A . a花 n u a p l a n t t r a n s fo r m e d b y l e a f 山 s k m e t h do
3
.
2 转基因青篙的分子检测 3 . 2 . 3 转 基 因青 篙 的表 2 3
3
.
2
.
1 转基因青篙 的转化证据— P C R :从 K a n抗性青篙植株提取总 D N A , 以含有人 R A N T E S 基
因 的 p R 一 R A N 质粒 为 阳性 对照 , 未转 化 青篙总
D N A 为 阴性对 照 , 用上 、 下 游引物进行 R A N T E S
基 因扩增 ( 图 2 ) 。 结果显示 ,转化的 K a n 抗性植株
总 D N A 可扩增出 27 6 b p 的目的基 因片段 , 而未转
化植株总 D N A 则无相应扩增片段 。
2 76 h P e
1
,
2
一转基 因青禽植株的 P C R 产物 3一未转化青蓄植株
的 P C R 产物 4一 10 0 b p 梯度 相对分子 质量标准 5 -
冰 一R A N 质粒的 P C R 产物
l
,
2
一
PC R t r a n s g e in e A
.
a n n u a 3 一 PC R n o n t r a n s fo r m e d
A
·
a 刀雌 u a 4一 1 0 0 b p la d d e r s 一 P C R p R 一R A N
圈 2 转荃因青禽植株的 P C R 鉴定
F ig
.
2 I d e n t l f i
e a t i o n o f t r a ns g e n i
c A
.
a n 花 u a
P l a n t b y P C R
3
.
2
.
2 转基 因青篙 的整 合证据— S o ut h er n 印迹 : 为 了获得 R A N T E S 基因在青篙染色体上整合
的证据 , 以 P C R 阳性的转基因青篙及未转化青篙
的总 D N A 为材料 ,用 E co R I 消化后 , 以生物素标记
的 R A N T E S 基因探针进行 S o ut h er n 印迹杂交 ,结
果如图 3 所示 。 转基因植株 (2 和 3) 显示出 2一 3 条
特征性杂交带 ,表 明 R A N T E S 基因已 整合到转基
因青篙植株的基因组 中 , 并以多拷贝形式存在 , 而未
转化植株则无任何杂交带 。
达 证 据— R T 一 P C R : 以
K an 抗性转基因青篙植株
及未转 化植株 的总 R N A
为材 料进行 R T 一 P C R , 结
果如图 4 所示 。 转基因叶
片 总 R N A 经 R T 一 P C R
后 , 均 可 见 2 7 6 b p 的
R A N T E S m R N A 扩增带
( 4一 6 泳道 ) 。 其中 ,未经
D N A 酶消化及 去蛋 白处
理 的 R T 一 PC R 产物最 多
( 6 泳道 ) ,经 D N A 酶消化
而且不去蛋 白的 R T 一 P C R
产 物 最 少 (5 泳 道 ) , 用
D N A 酶 消化并去 蛋 白的
R T
一
P CR 产物则介 于二者
之间 (4 泳道 ) , 表明 D N A
酶可 消 化 逆 转录产 生 的
1
一未转化青盆植株
2 , 3一转基因青篙植株
l
一n o n t扭 n s f o r m e d A
a n n u a p l a n t Z
, 3一 t r a n s -
g e n i e A
.
a 花 陀u a p lau t s
圈 3 转甚因份禽植株的
S o
u t h e r n 印迹杂 交
鉴定
F i g
.
3 I d e n t i f i e a t io n o f
tar o s ge n i
c A
.
a n -
n u a p l叨t b y S o u -
t h e r o b l o t t二n g
c D N A 而使 R T 一 P C R 产物减少 , 其中不去蛋 白 (不
除去 D N A 酶 ) 比去蛋白 (除去 D N A 酶 ) 的效果更
为显著 。 另外 , 预先用 D N A 酶 消化的转基因叶片
(无 D N A ) 总 R N A , 在 P C R 后未检测到任何扩增
产物 (3 泳道 ) 。
3
.
2
,
4 转基因青篙的表达证据— N or t h er n 印迹杂 交 : 对 K an 抗性的转基因青篙和未转化青篙总
R N A 进行 N or t he m 印迹杂交 ,结果见图 5 。 转基因
青篙总 R N A 对应位置有明显杂交信号 , 而未转化
青篙总 R N A 对应位置无杂交信号 。
3
.
2
.
5 转基因青篙 的表达证据— W es t e rn 印迹杂交 : 对 K a n 抗性的转基因青篙和未转化青篙总蛋
白进行 W es t er n 印迹杂交 ,结果见图 6 。 转基因青篙
·
1 1 7 0
· 中草药 C h i n e s e T r a d i ti o n a l a n d eH r ba l D r u g s 第 35 卷第 1 0期 2 0 0 4年 1 0月
总蛋白对应位置有明显杂交信号 ,而未转化青篙总
蛋白对应位置无杂交信号 。
27 6 bP 一
1一 p R
一
R A N 质粒的 PC R 产物 2一 10 0 b p 梯度相对 分子质量标
准 3一转 基因植株总 R N A 经 D N A 酶消化后 的 P C R 产物 4 -
转基因植株总 R N A 经 D N A 酶消化并去蛋白后 的 R T 一CP R 产
物 5一转基因植株总 R N A 经 1) N A 酶消化而未去蛋 白的 R T -
P C R 产物 6一转基因植株总 R N A 的 R T 一 P C R 产物
l
一
P C R p r o d u e t o f p R
一
R A N Z
一
1 0 0 b p l a d d e r 3
一
PC R P r o d u e t
o f t r a n s g e n i e p la n t R N A d ig e s t e d b y D N a s e 4
一
R T
一
P C R p r o
-
d u e t o f t r a n s g e n i e p la n t R N A d ig e s t e d b y D N a s e w i t h p r o t e in
-
e x t r a e t i o n s
一
R T
一
P C R p r o d u e t o f t r a n s g e n ie p la n t R N A d ig e
s t -
e d b y D N a s e w i t h o u t P r o t e i n e x t r a e t i o n 6
一
R T
一
PC R p r o d u e t o f
t r a n s罗 n i e P la n t R N A
圈 4
F盆9 . 4
转荟因份禽植株的 R T 一 P c R 鉴定
I d e nt i ifc
a t io n o f t r a n s g e n皿c A .
Pl a n t by R T
一
P C R
a 砚耳“ O
l
, 3 一转基因青 篙植株 2一未转化青篙植株
1
, 3一 t r a n s g e n i e A
.
a n 凡 u a p la n t
2
一 n o n t r a ns of r m e d A
.
a n 砚 “ a p l a n t
圈 5 转落 因青禽的 N or t h et n 杂交鉴定
F i g
.
5 I d e n t if i
e a t i o n o f t ar ns g
e n i e A
.
a 月 n u a
P la n t b y N o r t h e r n b l o t it n g
1
,
3
一转基因青篙植株 2 , 4 一未转基因青篱植株
l
, 3一 t r a ns g e n 亏e A . a ” ” “ a p l a n t
2
, 4一 n o n t r a n s f o r me d A
.
a 刀刀 “ a p l a n t
图 ` 转荃因青禽的 W e , t er n 印迹杂交鉴定
F ig
.
6 I d e n t i f i e a t盛o n o f t r a o s g e川 e A . a . n u a
P l a n t 勿 W e s te r n bl o t ti n g
4 讨论
2 0 世纪 80 年代以来 , 由根癌农杆菌 iT 质粒衍
生的双元载体 、 共整合载体 、 分隔末端载体 、 载体卡
盒等相继构建成功 ,共培养法 、脂质体法 、 电穿孔法 、
基因枪法等基因转移技术已分别用于培育转基因粮
食 、 经济和蔬菜作物 。 同时 ,用抗原蛋白基因 、细胞因
子基因及其他有用基因对药用植物进行遗传修饰
( g e n e t i。 m o d if i e a t io n
,
G M )
, 可望育成能 口服的转
基因疫苗及对中药原有药理活性产生增效作用的转
基因中药 。迄今为止 , 国外 已有几十种药用蛋白及药
用多肤在植物中表达成功 ,如干扰素 、 表皮生长因子
和抗体等 ,可开发为治疗药物或诊断试剂 。
趋化 因子 是一 类低相 对分子质 量 (8 0 0 ~
10 0 0 0) 诱导分泌细胞因子 , 可结合细胞表面的趋
化因子受体而诱发炎症性免疫应答 , 由此调节 T 细
胞趋化动员并促进血管再生 , 在自身免疫性疾病 、器
官移植排斥反应 、 肿瘤发生和发展中具有重要作用 。
最近还发现 , 人类免疫缺陷病毒 h( u m a n im m u n 。 -
d e f i e ie n e y v i r u s
,
H xV ) 感染人体细胞 的主要受体
为 CD 4 , 辅助受体则是趋化 因子受体 。 R A N T E S 、
S D F
一
1 等趋化因子是趋化因子受体的天然配基 , 它
们可结合趋化因子受体而产生空 间位阻效应 , 同时
还能下调趋化因子受体在细胞表面的表达 , 从而阻
断 H I V 侵入细胞 , 降低受 H IV 感染的危险闭 。 另一
方 面 , 高 加 索人种 中 的 趋 化 因 子 受 体 缺 陷 型
( C C R S
一△ 32 ) 对 H IV 感染具有抗性 ,表 明趋化 因
子受体与趋化因子的相互作用是艾滋病药物作用的
潜在靶点之一仁, 。〕 。
本研究将人 R A N T E S 基因通过根癌农杆菌共
培养转化系统导人青篙培养细胞 , 已再生转基 因青
篙植株 , 实现 了外源基因在青篙染色体上的整合及
在完整植株 中的表达 。 通过对转基因青篙植株中
R A N T E S 基因的 P C R 扩增 , 已获得外源基因在转
化细胞中存在的证据 。 S o ut h er n 印迹杂交证实导人
转化细胞的外源基因已在染色体上整合 ,其拷贝数
为 2 ~ 3 个 。 笔者曾利用该双元载体系统转化夏枯
草细胞 , 结果在转基 因愈伤组织 中检测 到整合 的
R A N T E S 基因 ,但拷贝数仅为 1个 〔,’ J 。 R T 一P C R 和
N or ht er n 印迹 杂交 结 果 显 示 , R A N T E S 基 因在
3 5 5 启动 子指 导下 已成功转 录出 R A N T E S m R -
N A
。 从 R T 一 P C R 产物的测序结果来看 ,包括信号肤
序列在 内的 R A N T E S 基因全序列 已 被忠实转录
(未发表结果 ) 。 采用 W es t er n 印迹杂交直接检测到
转基 因青 篙中 R A N T E S 的存在 , 表 明 R A N T E S
m R N A 可顺利完成转 录后加工并能正确翻译 。
青篙是广泛分布于我国境内的药用野生植物资
源 ,其有效成分青篙素是强效和高效抗疟药组份 ,但
中草药 C h i n es eT r a di t io n a la n H dr eb a lD r u g s 第 3 5卷第 1 0期 2 0 0连年 1 0月 · 1 1 7 1 -
青篙中青篙素含量过低极大地制约 了其规模化生产
与临床应用 。因此 , 利用基 因工程对青篙基 因组进行
敲人 ( k n o e k i n ) 和敲除 ( k n o e k o u t ) 成为青篙遗传
改良的两大方 向 ,其 目标是提高青篙素含量和促进
青篙的综合利用 , 前提条件是成熟而可靠 的载体 系
统 、 转化方法和再生技术的建立 。 为此 , 国内叶和春
研究小组建立 了青篙宿主 一载体及其转化 系统 lz[ 〕。
本研究为进一步开展这方面的研究奠定了基础 。
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稀土元素斓对掌叶大黄毛状根和非转化根生长及蕙醒产量的影响
杨世海 ` , 刘晓峰 2 ,果德安 “
l(
. 吉林农业大学中药材学院 ,吉林 长春 1 3 0 1 1 8 ; 2 . 吉林亚泰 (集团 )股份有限公司 ,
吉林 长春 1 3 0 0 3 1 ; 3 . 北京大学药学院 ,北京 1 0 0 0 8 3 )
摘 要 : 目的 研究不同浓度的稀 土元素斓 ( L a 3+) 对 3 种大黄根生物量和葱醒次生代谢产物产量的影响 。 方法
采用统计学分析方法 ,研究稀土元素 L a 3+ 对两种掌叶大黄单克隆毛状根 D H S。 、 D H a7 和液体培养非转化根 N O R
生物量和 葱酪化合物合成的影响 。 结果 L a 抖浓度对大黄根生物量积累有显著影响 ,培养基中 L a3 + 为 10 m g / L
时 ,对大黄根生长表现 出明显的抑制作用 ; L a “ + 浓度对 3种大黄根的葱醒产量有极显著影响 , 当培养基中 L a 3+ 1 . 0
m g L/ 时 ,葱酿产量最高 ;经稀土离子处理的 3 种大黄根中芦荟大黄素和大黄酸显著高于大黄素 、 大黄酚和大黄素
甲醚 。 结论 培养基中添加适宜浓度的稀土离子 L a 3+ 对掌叶大黄单克隆毛状根的生物量积累和葱醒类化合物的
合成具有明显的促进作用 。
关键词 :掌叶大黄 ; 毛状根 ; 稀土元素 ; 蕙醒类化合物
中图分类号 : R 2 8 2 . 6 文献标识码 : A 文章编号 : 0 2 5 3 一 2 6 7 0 ( 2 0 0 4 ) 1 0 一 1 1 7 1 一 0 4
E f f e e t o f r a r e
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m a l r o o t s o f R h e u m P a lm a t u m L a n d t h e i r y i e l d o f a n t h r a q u i n o n e s
.
M e t h o d s T h e b i o m a s s a n d a n
-
收稿 日期 : 2 0 0 4一 0 1一 1 6作者简介 : 杨世海 ( 1 9 6 2一 ) , 男 , 吉林人 , 副教授 , 博士后 。 1 9 8 3 年 7 月毕业于吉林农业大学中药材学院 , 1 99 5 年 9 月一 19 9 8 年 1 月在北京 医科大学药学院 (现北京大学药学院 )攻读博士学位 , 2 0。。 年 12 月一 20 0 2 年 12 月在 日本国立农业 生物资源研究所做 日本科学技术振兴事业团博士后 (S T A eF l o w )研究 ,主要从事中药资源和中药生 物工程研究 口
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