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一株产长春新碱内生真菌的初步研究
杨显志1, 张玲琪23 , 郭　波2, 郭仕平2Ξ
(11 电子科技大学物理电子学院, 四川 成都　610054; 21 云南大学生命科学学院, 云南 昆明　650091)
摘　要: 目的　通过长春花叶内生真菌的分离, 筛选产生长春新碱的菌株。方法　从长春花叶中分离内生真菌, 对
其发酵提取物进行 TL C 和H PL C 分析。结果　从长春花叶中分离筛选到一株无孢菌群菌株: 97CY3。它能产生长
春新碱, H PL C 测定其长春新碱含量约为 01205 ΛgöL。结论　长春花内生真菌中, 有的菌株可产生与宿主所产相同
的抗癌物质长春新碱。
关键词: 长春花; 无孢菌群; 内生真菌; 长春新碱
中图分类号: R 282115　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 01 0079 03
Prel im inary study of a v incr ist ine-produc ing endophytic fungus isola ted
from leaves of Ca tha ran thus roseus
YAN G X ian2zh i1, ZHAN G L ing2qi23 , GUO Bo 2, GUO Sh i2p ing2
(1. Co llege of Physical E lectron ics, U niversity of E lectron ic Science and T echno logy of Ch ina, Chengdu 610054,
Ch ina; 2. Schoo l of L ife Science, Yunnan U niversity, Kunm ing 650091, Ch ina)
Abstract: Object　To select the endophyt ic fungi w h ich p roduce vincrist ine by iso la t ing fungi from
the leaves of Ca tha ran thus roseus (L. ) G. Don. M ethods　T he endophyt ic fungi w ere iso la ted from the
leaves of C. roseus and the zymo tic ex tracts w ere analyzed by TL C and H PL C. Results　A n endophyt ic
fungu s w h ich isM y celia sterilia 97CY3 can p roduce vincrist ine. T he con ten t of vincrist ine in the fungu s w as
determ ined as 01205 ΛgöL by H PL C. Conclusion 　Som e endophyt ic fungi iso la ted from C. roseus can p ro2
duce the an t icancer sub stance vincrist ine w h ich is the sam e as that of ho st p lan t p roducing.
Key words: Ca tha ran thus roseus (L. ) G. Don; M y celia sterilia; endophyt ic fungi; vincrist ine
　　长春新碱 (vincrist ine, V CR ) 具有抗肿瘤活性,
尤其对白血病具有显著疗效, 通过干扰癌细胞纺锤
体形成, 使细胞有丝分裂停止于中期, 从而阻止癌细
胞的扩散[1 ]。目前长春新碱主要是从夹竹桃科
(A pocynaceae ) 植物长春花 Ca tha ran thus roseus
(L. ) G. Don 中分离提取。但该生物碱在植物体内
含量极低, 仅为百万分之几, 分离提取困难, 且植物
生长缓慢, 资源短缺, 故限制了该药的进一步开发利
用。因此, 寻找长春新碱新的药源, 已成为摆在人类
面前的一项重大研究课题。近年来国内外学者主要
从 3 个方面来探索这类课题, 即化学合成法[2, 3 ]、植
物细胞及组织培养法[4 ]和微生物发酵法[5～ 8 ]。目前
人们普遍认为微生物发酵法是一种最具潜力的方
法。本实验即采用微生物发酵方法, 在以前工作基
础[7, 8 ]上, 首次报道从长春花植株的叶中分离产长春
新碱内生真菌菌株的结果。
1　材料和方法
111　材料: 新鲜长春花 (2～ 3 年生) 采自云南大理
·97·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 1 期 2004 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2003205215
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (39860005)
作者简介: 杨显志 (1968—) , 男, 四川安岳人, 硕士, 讲师, 曾在中学任教多年, 2002 年 7 月毕业于云南大学生命科学学院微生物学专业,
主要从事微生物次生活性代谢产物及生物电磁学方面的研究, 正式发表论文 6 篇。
T el: (028) 83201064　E2m ail: yangbo s158@ sohu. com3 通讯作者　T el: (0871) 5033159　E2m ail: yim 401@public. yn. cn
弥渡县和西双版纳州。长春新碱 (vincrist ine)对照品
购自 Sigm a 公司。
112　培养基: 马铃薯葡萄糖培养基 (PDA ) , 查氏培
养基, 促孢培养基, 改良MM 液体培养基。
113　内生真菌的分离和纯化: 取长春花不同部位的
叶, 按下列程序表面消毒: 自来水冲洗→75% 酒精漂
洗 (3～ 5 m in)→无菌水冲洗 3～ 4 次→011% 升汞漂
洗 (10～ 30 s)→无菌水冲洗 5 次。
　　将上述处理过的叶片在无菌条件下剪切成约
015 cm ×015 cm 的小片, 然后将小片种植于 PDA
平板上, 置于 28 ℃温箱培养3～ 7 d 后, 即可见样品
剪切过的边缘有菌丝长出, 经纯化后转接到 PDA
斜面上备用。经处理而不剪切的对照叶片上则一直
无任何微生物长出。
114　内生真菌的液体培养: 将改良MM 液体培养
基 100 mL 装在 250 mL 三角瓶中, 每个菌号 5 瓶,
共计 500 mL , 灭菌, 用接种钩挑取少许菌丝或孢子
接种于培养瓶中, 置于 28 ℃摇床 (110 röm in) 培养
3～ 5 d, 待菌丝体长好后进行提取。
115　提取方法: 发酵液 500 mL →碱化 (pH ≥8) →
离心 (2 500 röm in, 15 m in) →沉淀→加 CHC l3 200
mL →浓缩至 3 mL →置干净青霉素小瓶中备用。
116　对照品溶液的制备: 5 m g 包装的长春新碱对
照品, 溶于 10 mL CHC l3 中, 用移液管吸取该溶液
并转移至 20 mL 量瓶中, 再定容至刻度备用。
117　分析检测方法
11711　TL C 分析: 硅胶板: 自制和购自青岛海洋化
工厂; 展开剂: 苯2甲醇 (9∶1) ; 苯2丙酮 (8∶2) ; 显
色: 碘显色。
11712　H PL C 分析检测: Beckm an 421A 控制器,
110B 溶剂导入组件; 163 可变波长检测器; 427 积分
仪。检测波长为 238 nm , 吸光度 015; 泵A (重蒸水)
(1～ 115) ×69 Pa; 泵B (甲醇) (1～ 115) ×69 Pa; 流
速为015 mL öm in; 泵A 30% ; 泵B 70% ; 柱温25 ℃。
2　结果
211　产长春新碱内生真菌的分离: 从云南不同地点
生长的长春花叶中分出 15 株真菌菌株, 结果见表 1。
　　从表 1 可见, 不同来源的长春花叶中分离到的
内生真菌在种类和数量上都存在差异, 体现了植物
内生真菌的多样性, 其中无孢菌群为优势种。TL C
初步分析结果显示, 仅来自弥渡县编号 97CY3 的一
株内生真菌发酵提取物出现了与对照品迁移率
(R f) 相同、颜色一致的斑点 (图 1) , 97CY3 可能产生
长春新碱。故以 97CY3 为实验菌株进行形态观察和
H PL C 分析检测。
表 1　长春花叶中内生真菌的分离结果
Table 1　Results of isola ting endophytic fung i
from leaves of C. roseus
内生真菌的分属 分离菌株数 采集地
无孢菌群 4 弥渡县　
毛壳菌属 1 弥渡县　
短梗霉属 1 弥渡县　
无孢菌群 8 西双版纳
黑孢属　 1 西双版纳É 2展开剂为苯2甲醇 (9∶1)　Ê 2展开剂为苯2丙酮 (8∶2)É 2so lven t system is benzene2m ethano l (9∶1)Ê 2so lven t system is benzene2acetone (8∶2)
图 1　97CY 3 提取物的 TLC 图谱
F ig. 1　Chromatogram of TLC of 97CY 3 extract
212　内生真菌 97CY3 的生长及形态特征: 97CY3
菌株的菌落白色, 不产色素, 菌丝多分枝, 有横隔, 不
产孢子, 经初步鉴定为无孢菌群M y celia sterilia。
　　97CY3 在 PDA 平板上生长较快, 28 ℃, 72 h,
菌落直径可达 315 cm 左右。在改良MM 液体培养
基中, 刚开始 (前 24 h) 生长较缓慢, 有一个生长延
迟期, 但随后却表现出很强的生活力, 48 h 后逐渐
达到生长高峰, 72 h 培养物提取液中长春新碱的量
已达较高水平。
213　H PL C 分析测定: 为了进一步证实 97CY3 能
产长春新碱, 采用H PL C 对该菌发酵提取物进行分
析检测, 结果见图 2。
　　由图 2 可见, 在上述设定条件下, 样品中峰Ê 与
对照品中峰É 的保留时间一致, 即 tR = 2160 m in, 可
判断样品中峰Ê 为长春新碱的吸收峰, 根据峰Ê 的
积分面积计算得出样品中长春新碱的含量, 再根据
发酵液总量可计算出 97CY3 菌株液体培养物中长
春新碱含量约为 01205 ΛgöL。
·08· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 1 期 2004 年 1 月
É 2V CR　Ê 297CY3
图 2　HPLC 图谱
F ig. 2　Chromatogram of HPLC
3　讨论
　　从内生真菌的分离和筛选结果来看, 植物内生
真菌具有一定多样性, 有可能利用药用植物内生真
菌来生产与宿主所产相同或相似的生理活性物质,
只是目前所分离到的内生真菌合成天然活性物质的
量很少, 有待于利用现代生物技术手段改造菌种, 优
化发酵条件及在培养物中添加前体物质等方法来提
高其有效成分的产量。随着科技进步和研究的不断
深入, 开发利用药用植物内生真菌无疑应是解决药
用植物资源短缺的最佳途径之一。
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不同采收期溪黄草中 2Α-羟基熊果酸含量的动态研究
吴剑峰1, 刘　斌2, 祝晨 3, 赖小平3Ξ
(11 广东省佛山职工医学院, 广东 佛山　528000; 21 天津医学高等专科学校, 天津　300052;
31 广州中医药大学, 广东 广州　510405)
摘　要: 目的　为确定溪黄草最佳采收期提供依据, 为按中药材 GA P 原则制定相关标准操作规程 (SO P) 并实施推
广应用, 提供基础研究资料。方法　采用R P2H PL C 法测定 GA P 基地产溪黄草药材不同采收期 2Α2羟基熊果酸的
含量。色谱条件: K rom asil R P2C18色谱柱 (250 mm ×416 mm , 5 Λm ); 乙腈20105% 三氟乙酸溶液 (7015∶2915)为流
动相; 流速 018 mL öm in; 柱温 25 ℃; 检测波长 210 nm。结果　不同采收期狭基线纹香茶菜药材中 2Α2羟基熊果酸的
含量以 8 月份为高, 即开花前期。结论　建议狭基线纹香茶菜药材在开花前枝叶繁盛时采收。
关键词: 溪黄草; 采收期; H PL C; 2Α2羟基熊果酸
中图分类号: R 28216　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 01 0081 03
D eterm ina tion of 2Α-hydroxy-ursol ic ac id from H erba R abdos iae Ser rae
in var ious collecting per iods
W U J ian2feng1, L IU B in2, ZHU Chen2chen3, LA I X iao2p ing3
(1. Fo shan M edical Co llege fo r Personnel of Guangdong, Fo shan 528000, Ch ina; 2. T ian jin M edical T rain ing Co llege,
T ian jin 300052, Ch ina; 3. Guangzhou U niversity of T radit ional Ch inese M edicine, Guangzhou 510405, Ch ina)
Abstract: Object　To supp ly the basis fo r the op t im al co llect ing period fo r H erba R abd osiae S errae
(HR S). To lay dow n relevan t Standard Opera t ing p ract ice (SO P ) in acco rdance w ith GA P of Ch inese
m edicinal m ateria ls and pu t them in to p ract ice w ith p rovid ing basic research ing data. M ethods　To deter2
·18·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 1 期 2004 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2003204215
基金项目:“十五”国家科技攻关计划资助项目 (992929201223)
作者简介: 吴剑峰, 女, 江苏省无锡市人, 副主任药师, 硕士学位, 一直从事药学专业的教学、科研和实践工作, 现任广东省佛山职工医学
院药学教研室主任, 1994 年获广东省“南粤教坛新秀”称号, 同年获佛山市教育基金会颁发的二等奖, 1999 年获佛山市市直优
秀教师奖, 主持了广东省立项科研课题《日本汉方制剂柴苓汤质量控制模式应用于中成药的研究》等 3 项, 参加了国家攀登计
划课题《补阳还五汤治疗脑中风作用机理研究》、国家重点科技攻关项目《中药规范化种植 (GA P) 研究》——溪黄草子课题等
多项研究, 发表论文 10 余篇, 主编了卫生部规划教材《天然药物化学》和《天然药物化学学习指导》, 担任《医学论文写作学》副
主编, 研究方向为天然活性成分和新药开发。T el: (0757) 2816702　13612540388